Détermination de la durée de la phase S à l’aide de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine chez Saccharomyces cerevisiae

Summary

Nous décrivons deux protocoles complémentaires pour déterminer avec précision la durée de la phase S chez S. cerevisiae à l’aide d’EdU, un analogue de la thymidine, qui est incorporé in vivo et détecté à l’aide de la chimie Click par microscopie et cytométrie en flux. Il permet de caractériser facilement la durée de la réplication de l’ADN et les défauts de réplication négligés chez les mutants.

Abstract

La réplication de l’ADN eucaryote est un processus hautement réglementé qui garantit que le plan génétique d’une cellule est correctement dupliqué avant la ségrégation chromosomique. Comme les défauts de synthèse de l’ADN sous-tendent les réarrangements chromosomiques, la surveillance de la réplication de l’ADN est devenue essentielle pour comprendre la base de l’instabilité du génome. Saccharomyces cerevisiae est un modèle classique pour étudier la régulation du cycle cellulaire, mais les paramètres clés de réplication de l’ADN, tels que la fraction de cellules dans la phase S ou la durée de la phase S, sont encore difficiles à déterminer. Ce protocole utilise des impulsions courtes et non toxiques de 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU), un analogue de la thymidine, dans des cellules de levure TK-hENT1 modifiées, suivies de sa détection par réaction Click pour permettre la visualisation et la quantification de la réplication de l’ADN avec une résolution spatiale et temporelle élevée aux niveaux de la cellule unique et de la population par microscopie et cytométrie en flux. Cette méthode peut identifier des défauts auparavant négligés dans la phase S et la progression du cycle cellulaire des mutants de levure, permettant ainsi la caractérisation de nouveaux acteurs essentiels pour assurer la stabilité du génome.

Introduction

La stabilité du génome par division mitotique est assurée par la transmission d’un ensemble complet et égal de chromosomes aux deux descendants cellulaires produits. Cela repose sur l’achèvement précis d’une série d’événements se produisant dans un temps donné dans chaque phase du cycle cellulaire. Dans G 1, les origines de réplication sont concédées sous licence lors du recrutement de plusieurs facteurs de licence, y compris Cdc6₁. Dans la phase S, la duplication du génome entier est initiée à partir de multiples origines de réplication actives et effectuée par des machines de réplication qui rassemblent des foyers microscopiquement visibles appelés usines de réplication². Dans la phase M, des chromatides sœurs dupliquées sont attachées et biorientées sur le fuseau mitotique pour permettre leur ségrégation aux pôles opposés de la cellule mitotique³. La régulation, la bonne réalisation et la durée de chaque phase sont essentielles pour assurer la stabilité du génome. En effet, la sortie prématurée de l’une de ces phases conduit à une instabilité du génome. Par exemple, un G 1 plus court induit par la délétion de l’inhibiteur de CDK de levure bourgeonnant Sic1 ou par la surexpression de cyclines G₁ modifiera la phase S 4,5,6 suivante. Par conséquent, ces dérégulations, associées ou non au stress de réplication, entraînent des cassures chromosomiques, des réarrangements et une mauvaise ségrégation ^4,5,6. Par conséquent, la surveillance de la durée de la phase S et, plus largement, de la durée des autres phases du cycle cellulaire peut être cruciale pour identifier les défauts survenant chez différents mutants et dans différentes conditions stressantes.

Une méthode traditionnelle de mesure de la durée de phase du cycle cellulaire comprend une cytométrie en flux de contenu d’ADN simple (Figure 1A) et repose sur un algorithme d’ajustement (disponible dans la plupart des logiciels de cytométrie) utilisé pour séparer la population en fractions de phase G₁, S et G₂ + M des pics 1C et 2C. Les fractions sont ensuite multipliées par la population en doublant le temps⁷. Cependant, cette méthode ne donne que des valeurs estimées, nécessite une distribution homogène de la taille des cellules dans une fraction donnée et n’est pas applicable aux cultures synchronisées. Pour étudier la durée de la phase S dans les cellules de mammifères, plusieurs analogues de la thymidine ont été développés et largement utilisés, y compris EdU. Leur absorption à partir du milieu extracellulaire et leur phosphorylation par la thymidine kinase (ci-après dénommée TK) les rendent disponibles pour les ADN polymérases afin de les incorporer sur des sites de synthèse de l’ADN (réplication, recombinaison, réparation). Pour contourner l’absence du gène TK dans les cellules de Saccharomyces cerevisiae , des souches de levure ont été conçues pour permettre une expression stable et constitutive du virus de l’herpès simplex TK⁸ et du transporteur nucléosidique équilibré humain (hENT1)⁹. Une fois incorporé dans l’ADN, l’EdU est détecté via la réaction Click sélective, qui couple chimiquement sa fraction alcyne à des fluorochromes modifiés par azoture¹⁰.

Cet article fournit deux protocoles complets optimisés pour marquer des impulsions asynchrones et synchrones TK-hENT1 modifiées avec EdU afin de visualiser et de mesurer avec précision la durée et la dynamique de la réplication de l’ADN, ainsi que la durée des autres phases du cycle cellulaire, avec une résolution spatiale et temporelle élevée aux niveaux de la cellule unique et de la population par microscopie et cytométrie en flux.

Protocol

1. Culture cellulaire de S. cerevisiae REMARQUE : Les souches de levure utilisées sont énumérées dans le tableau 1. REMARQUE: La durée de la phase S peut être surveillée de différentes manières. Selon la question à traiter, les cellules peuvent être cultivées de manière asynchrone ou synchrone après l’arrêt G1 . À partir de cellules de S. cerevisiae en croissance asynchrone<br…

Representative Results

Pour déterminer la durée de la phase S et, plus largement, la durée de G1 et G2 + M (étape de protocole 1.1), des cellules de type sauvage W303 de S. cerevisiae (WT, Tableau 1) ont été cultivées de manière asynchrone en milieu SC pendant 7 h. Toutes les heures, la concentration de la cellule a été surveillée pour déterminer le temps de doublement (figure 2B). Dans ces conditions de croissance, le temps de doublement calculé était …

Discussion

La levure est un organisme modèle de premier plan pour les études du cycle cellulaire, mais la caractérisation de sa phase S a longtemps été entravée par son incapacité à incorporer des nucléosides exogènes, tels que BrdU, qui sont utilisés comme traceurs de la réplication de l’ADN. L’équipement de la levure avec une expression élevée de l’herpès simplex thymidine kinase (TK) et l’ajout d’un transporteur nucléosidique humain (hENT) a largement résolu ce problème^15,16<s…

Materials

α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100–812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent