Summary
Descrevemos dois protocolos complementares para determinar com precisão a duração da fase S em S. cerevisiae usando EdU, um análogo da timidina, que é incorporado in vivo e detectado usando a química Click por microscopia e citometria de fluxo. Ele permite a fácil caracterização da duração da replicação do DNA e defeitos de replicação negligenciados em mutantes.
Abstract
A replicação do DNA eucariótico é um processo altamente regulado que garante que o modelo genético de uma célula seja corretamente duplicado antes da segregação cromossômica. Como os defeitos de síntese de DNA estão subjacentes aos rearranjos cromossômicos, o monitoramento da replicação do DNA tornou-se essencial para entender a base da instabilidade do genoma. Saccharomyces cerevisiae é um modelo clássico para estudar a regulação do ciclo celular, mas os principais parâmetros de replicação do DNA, como a fração de células na fase S ou a duração da fase S, ainda são difíceis de determinar. Este protocolo utiliza pulsos curtos e não tóxicos de 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU), um análogo da timidina, em células de levedura TK-hENT1 modificadas, seguidas de sua detecção por reação Click para permitir a visualização e quantificação da replicação do DNA com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo. Este método pode identificar defeitos anteriormente negligenciados na fase S e na progressão do ciclo celular de mutantes de levedura, permitindo assim a caracterização de novos players essenciais para garantir a estabilidade do genoma.
Introduction
A estabilidade do genoma através da divisão mitótica é assegurada pela transmissão de um conjunto completo e igual de cromossomos para as duas progênies celulares produzidas. Isso depende da conclusão precisa de uma série de eventos que ocorrem em um determinado tempo em cada fase do ciclo celular. No G 1, as origens de replicação são licenciadas mediante o recrutamento de vários fatores de licenciamento, incluindo o Cdc61. Na fase S, a duplicação do genoma inteiro é iniciada a partir de múltiplas origens de replicação ativas e executada por máquinas de replicação que se reúnem em focos microscopicamente visíveis chamados fábricas de replicação2. Na fase M, cromátides irmãs duplicadas são anexadas e biorientadas no fuso mitótico para permitir sua segregação para os polos opostos da célula mitótica3. A regulação, a conclusão adequada e a duração de cada fase são fundamentais para garantir a estabilidade do genoma. De fato, a saída prematura de qualquer uma dessas fases leva à instabilidade do genoma. Por exemplo, um G1 mais curto induzido pela deleção do inibidor de CDK de levedura em brotamentoSic1 ou pela superexpressão de ciclinas G1 alterará a fase Ssubsequente 4,5,6. Consequentemente, essas desregulamentações, associadas ou não à tensão de replicação, resultam em quebras cromossômicas, rearranjos e má segregação 4,5,6. Portanto, monitorar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração das outras fases do ciclo celular pode ser crucial para identificar os defeitos que ocorrem em diferentes mutantes e em diferentes condições estressantes.
Um método tradicional para medir a duração da fase do ciclo celular inclui citometria de fluxo de conteúdo de DNA simples (Figura 1A) e depende de um algoritmo de ajuste (disponível na maioria dos softwares de citometria) usado para separar a população em frações de fase G1, S e G2 + M dos picos 1C e 2C. As frações são então multiplicadas pelo tempo de duplicação da população7. No entanto, este método fornece apenas valores estimados, requer uma distribuição homogênea do tamanho da célula dentro de uma determinada fração e não é aplicável a culturas sincronizadas. Para estudar a duração da fase S em células de mamíferos, vários análogos da timidina foram desenvolvidos e amplamente utilizados, incluindo o EdU. Sua absorção do meio extracelular e fosforilação pela timidina quinase (doravante referida como TK) os tornam disponíveis para DNA polimerases para incorporá-los em locais de síntese de DNA (replicação, recombinação, reparo). Para contornar a ausência do gene TK nas células de Saccharomyces cerevisiae , cepas de levedura foram modificadas para permitir a expressão estável e constitutiva do vírus herpes simplex TK8 e do transportador de nucleosídeos equilibrados humanos (hENT1)9. Uma vez incorporado ao DNA, o EdU é detectado através da reação seletiva de Click, que acopla quimicamente sua porção alquina a fluorocromos modificados com azida10.
Este artigo fornece dois protocolos abrangentes otimizados para células de engenharia assíncronas e síncronas de TK-hENT1 com EdU, a fim de visualizar e medir com precisão a duração e a dinâmica da replicação do DNA, bem como a duração das outras fases do ciclo celular, com alta resolução espacial e temporal nos níveis de célula única e populacional por microscopia e citometria de fluxo.
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Protocol
1. Cultura de células de S. cerevisiae
NOTA: As estirpes de levedura utilizadas estão listadas no quadro 1
NOTA: A duração da fase S pode ser monitorada de diferentes maneiras. Dependendo da questão a ser abordada, as células podem ser cultivadas de forma assíncrona ou síncrona após a parada do G1 .
- De células de S. cerevisiae de crescimento assíncrono
NOTA: Este método permite a determinação da percentagem de células na fase S numa população de células em crescimento assíncrono. Ao determinar o tempo de duplicação, a duração da fase S (e das outras fases) pode ser extrapolada.- Inocular células de S. cerevisiae em 10 mL de meio sintético completo (SC) a uma baixa concentração celular (5 × 104 células/mL) para uma cultura noturna a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm.
NOTA: A concentração é medida com um contador de células. Para calcular eficientemente os tempos de duplicação, recomenda-se inocular a cultura de uma cultura noturna que ainda esteja na fase exponencial (ou seja, idealmente abaixo de 2 × 107 células/mL). O crescimento de células em meio rico (YPD) não é recomendado, pois a detecção de EdU não é eficiente. - No dia seguinte, diluir as células em 20 mL de meio SC fresco na concentração final de 5 × 105 células/mL.
- Culturar as células a 30 °C em banho-maria agitado com agitação horizontal a 120 rpm.
- Meça a concentração celular a cada hora até atingir 1 × 107 células/mL.
NOTA: Esta etapa permite fazer uma representação gráfica do aumento da concentração de células ao longo do tempo. A fórmula utilizada para calcular os tempos de duplicação é explicada na legenda da Tabela 2. - Prossiga em paralelo com a etapa 2 para a marcação de EdU quando a concentração celular for de cerca de 2 × 10 6-5 × 106 células/mL.
- Inocular células de S. cerevisiae em 10 mL de meio sintético completo (SC) a uma baixa concentração celular (5 × 104 células/mL) para uma cultura noturna a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm.
- De células de S. cerevisiae sincronizadas com G1
NOTA: Este método permite determinar quando a fase S começa e termina por meio de citometria de fluxo e/ou análises microscópicas.- Inocular células de S. cerevisiae em 10 mL de meio SC a uma baixa concentração celular (5 × 104 células/mL) para uma cultura noturna a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm.
Observação : consulte as observações após a etapa 1.1.1. - No dia seguinte, diluir as células em 20 mL de meio SC fresco a uma concentração final de 2 × 10 6-3 × 106 células/mL.
- Adicionar 40 μL de 1 mg/mL de fator α diluído em água.
- Cultivar as células a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm durante 1 h.
- Adicionar novamente 40 μL de 1 mg/mL de fator α diluído em água.
- Cultivar as células a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm durante 1 h.
- Visualize as células sob um microscópio de luz para monitorar a parada G1 . Prossiga se mais de 90% das células exibirem um shmoo e as outras forem células arredondadas e não brotadas.
NOTA: Dependendo do plano de fundo usado, recomenda-se sonicar as células antes da visualização shmoo. Para o fundo W303, sonicate 2x, para 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50. - Centrífuga por 3 min a 1.500 × g. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Ressuspender as células em 20 mL de meio SC.
- Repita as etapas 1.2.8-1.2.9 uma vez.
NOTA: O fator de α é lavado com essas etapas e as células são liberadas no ciclo celular. Em alternativa, o factor de α pode ser lavado filtrando as células de levedura com um filtro de nitrocelulose de 1,2 μm utilizando um funil ajustado num balão de braço lateral ligado a uma bomba de vácuo. - Recolha 1 ml de células 2x a cada 5 minutos e prossiga para o passo 2 para a rotulagem EdU.
NOTA: Rotule as células de pulso de apenas um dos dois tubos com EdU. As células não marcadas com pulso são usadas para distinguir células EdU-positivas de EdU-negativas em um gráfico bivariado de iodeto de propídio (PI)-EdU. - Adicionar 400 μL de 1 mg/mL de fator α diluído em água 30 min após a liberação.
NOTA: Esta alta dose de fator de α é necessária para deter as células na fase G1 do próximo ciclo celular e para evitar que as células voltem a entrar na fase S subsequente.
- Inocular células de S. cerevisiae em 10 mL de meio SC a uma baixa concentração celular (5 × 104 células/mL) para uma cultura noturna a 30 °C com agitação orbital a 130 rpm.
2. Rotulagem EdU
- Transfira 1 mL de cultura celular para um tubo de microfuga de 2,0 mL contendo 1 μL de EdU de 10 mM. Misture bem por inversão.
NOTA: Para discriminar as células EdU-positivas das células EdU-negativas em um FACS bivariado PI-EdU, transfira mais 1 mL de cultura celular para um tubo de microfujo de 2,0 mL contendo 1 μL de DMSO. - Incubar durante 3-5 min a 30 °C sob agitação em banho-maria agitado.
NOTA: Três minutos são suficientes para a detecção de EdU com um microscópio; São necessários 5 minutos para a detecção ideal de EdU em um citômetro de fluxo. - Pare a reação com a adição de 100 μL de etanol a 100%.
- Pare a reação com a adição de 100 μL de paraformaldeído a 20% se for necessária a medição do tamanho da célula.
NOTA: Se a arquitetura nuclear das células mitóticas deve ser mantida intacta para análises posteriores após a reação de Click, recomendamos a fixação de células com paraformaldeído a 2% à temperatura ambiente (RT) em vez de colocar as células no gelo, uma vez que esta última causa despolimerização de microtúbulos. - Deixar as células por 20 min no RT sob agitação suave em um balancim de velocidade variável a 20 inclinações/min para fixar as células antes da adição de 100 μL de etanol a 100%.
- Pare a reação com a adição de 100 μL de paraformaldeído a 20% se for necessária a medição do tamanho da célula.
3. Fixação celular e permeabilização
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Remova o sobrenadante usando uma pipeta a vácuo.
- Ressuscite o pellet celular em 500 μL de etanol a 70%. Misture bem por vórtice.
- Deixe por ≥1 h a RT a 20 inclinações/min em um balancim de velocidade variável para permeabilizar as células.
NOTA: As células cultivadas em meio SC não pellets bem como eles tendem a aderir às paredes de microfuga. A adição de etanol melhora a peletização e reduz a perda celular. As células podem ser armazenadas a 4 °C durante a noite ou por períodos mais longos a -20 °C. - Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Lave as células 2x com 500 μL de etanol a 10% em PBS.
NOTA: As lavagens são cruciais para remover o EdU não incorporado das células.
4. Reação de clique-it
- Para análise de citometria
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Ressuspender o pellet em 200 μL de PBS contendo 0,1 mg/mL de RNase A e 0,2 mg/mL de proteinase K.
- Incubar durante 1-2 h a 50 °C com agitação ocasional (ou durante a noite a 37 °C).
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Lave as células com 500 μL de PBS.
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Ressuspender o pellet celular em 200 μL de PBS + 1% de albumina sérica bovina (BSA). Incubar por 30 min no RT.
NOTA: Tempos mais longos não são necessários e são até prejudiciais para a eficiência das reações de clique. - Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Ressuspender o pellet em 300 μL de PBS + 1% BSA.
- Distribuir as células entre dois tubos: 200 μL em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para a reação Click e 100 μL em outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para coloração Sytox Green.
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Para coloração Sytox Green
NOTA: É altamente recomendável tomar uma alíquota para a coloração Sytox Green (sem Click) para obter perfis de referência de conteúdo de DNA de alta qualidade. De fato, a reação Click extingue fortemente a fluorescência intercalante, incluindo a fluorescência Sytox Green e PI. Consequentemente, a reação Click pode distorcer a leitura do conteúdo de DNA.- Ressuscite o pellet celular em 100 μL de PBS.
- Transfira 10-30 μL (dependendo da concentração celular) para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 μL de Tris-HCl de 50 mM, pH 7,5 e 0,5 μM Sytox Green.
- Sonicate 2x, por 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50.
- Deixar no escuro até processar as amostras num citómetro de fluxo.
NOTA: As células podem ser mantidas nesta fase a 4 °C durante alguns dias.
- Para a reação Click
- Preparar o tampão Azide Dye fresco misturando os reagentes na seguinte ordem (quantidade para um tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO4, 0,2 μL de 2 mM Cy5 Azida e 2 μL de 1 M de ácido ascórbico.
NOTA: É possível preparar uma mistura master do buffer Azide Dye. Os reagentes devem ser misturados na mesma ordem que a mencionada acima. - Ressuscite o pellet celular com 40 μL de mistura de Azide Dye feita na hora. Incubar em RT no escuro por 60 min.
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Lave as células 3x com 300 μL de etanol a 10% em PBS.
NOTA: As lavagens são cruciais para eliminar toda a azida solúvel de EdU-Cy5. - Ressuspender as células em 100 μL de 50 μg/mL PI em PBS. Deixe por 10 min no escuro.
- Transferir 10-30 μL da suspensão celular (dependendo da concentração celular) para um tubo de citômetro de fluxo contendo 300 μL de 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
- Sonicate 2x, por 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50.
- Deixar no escuro até processar as amostras num citómetro.
NOTA: As células podem ser mantidas nesta fase a 4 °C durante alguns dias.
- Preparar o tampão Azide Dye fresco misturando os reagentes na seguinte ordem (quantidade para um tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO4, 0,2 μL de 2 mM Cy5 Azida e 2 μL de 1 M de ácido ascórbico.
- Leia as amostras do Sytox Green usando um laser azul de excitação a 488 nm e um filtro de 530/30 BP. Consulte a Figura 1A para obter resultados típicos. Leia as amostras bivariadas de PI-EdU em um gráfico de pontos usando um laser azul de excitação a 488 nm e um filtro de 615/20 BP para o PI (eixo x) e um laser vermelho de excitação a 640 nm e um filtro de 660/20 BP (eixo y). Consulte a Figura 1B para obter resultados típicos.
NOTA: A Figura 1C representa o resultado típico do FACS bivariado PI-EdU para células EdU-negativas. Permite a discriminação das células EdU-negativas das células EdU-positivas.
- Para análise microscópica
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Ressuspender o pellet em 200 μL de PBS + 1% BSA. Incubar por 30 min no RT.
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfuge. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Preparar o tampão Azide Dye fresco misturando os reagentes na seguinte ordem (quantidade para um tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO4, 0,2 μL de 2 mM de azida Dy-530, 2 μL de ácido ascórbico 1 M.
NOTA: Uma mistura mestra do tampão Azide Dye pode ser preparada fresca misturando os reagentes na ordem acima mencionada. - Ressuscite o pellet com 40 μL de tampão Azide Dye acabado de fazer. Incubar em RT no escuro por 60 min.
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Lave as células 2x com 300 μL de etanol a 10% em PBS.
NOTA: As lavagens são cruciais para eliminar toda a azida solúvel de Dy-530. - Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Ressuspender as células em 100 μL de 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em PBS. Deixe por 30 min no escuro à temperatura ambiente.
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em uma microcentrífuga. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Lave com 300 μL de PBS para remover o excesso de DAPI.
- Pellet as células por 2 min a 10.000 × g em um microfugo. Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta de vácuo.
- Ressuscite o pellet com 10-50 μL de PBS, dependendo da concentração celular.
- Sonicate 2x, por 2 s de cada vez, a uma amplitude de 40-50.
NOTA: As células podem ser mantidas nesta fase a 4 °C durante alguns dias. - Pipetar 1,7 μL das células para uma lâmina de microscópio de vidro e cobrir com uma tampa limpa.
- Observe imediatamente sob um microscópio de fluorescência com filtros DAPI e TexasRed ou Cy3.
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Representative Results
Para determinar a duração da fase S e, de forma mais ampla, a duração de G 1 e G2 + M (etapa do protocolo 1.1), células selvagens do tipo S. cerevisiae W303 (WT, Tabela 1) foram cultivadas de forma assíncrona em meio SC por 7 h. A cada hora, a concentração celular foi monitorada para determinar o tempo de duplicação (Figura 2B). Nessas condições de crescimento, o tempo de duplicação calculado foi de 120 min ± 13 min a 25 °C (Tabela 2). Quando as células estavam na fase exponencial (2 × 10 6-5 × 106 células/mL), uma alíquota de células foi marcada por pulso com EdU (10 μM) por 5 min para destacar as células na fase S e determinar a porcentagem de células que estavam nas fases G1, S e G2 + M. Três populações de células foram observadas em uma análise bivariada do citômetro EdU-PI (Figura 1B). A discriminação entre as populações EdU-negativa e EdU-positiva foi feita por meio de um experimento de controle no qual as células não foram marcadas com EdU, mas a reação Click foi realizada (Figura 1C). As duas populações negativas para EdU nas áreas inferior esquerda e inferior direita que diferiram em intensidade de IP duas vezes corresponderam a G1 e G2 + M, respectivamente (Figura 1B,C). Portanto, a população superior (com intensidade >1× 10 4-2 × 104) correspondeu às células positivas para EdU que estavam na fase S no momento do pulso (Figura 1B). Assim, 27% ± 5% da população celular estava na fase G1, 29% ± 3% na fase S e 44% ± 2% estava no G2 + M. Como o tempo de duplicação foi de 120 min ± 13 min nessas condições, extrapolou-se que as fases G1, S e G 2 + M duraram 32 min ± 4 min, 35 min ± 6 min e 53 min ± 7 min, respectivamente, a 25 °C (Tabela2 e Tabela 3).
Em seguida, nosso objetivo foi validar esse método e mostrar que ele é sensível o suficiente para identificar mutantes com defeitos de replicação de DNA que foram negligenciados até agora. Raciocinamos que os alelos de perda de função ajustáveis dos fatores envolvidos na replicação do DNA seriam controles de validação ideais. Assim, utilizou-se uma cepa de levedura contendo um mutante cdc6-1 sensível à temperatura (Tabela 1)11. Cdc6 é um fator de licenciamento essencial que é expresso em M e G1 tardios para montar complexos de pré-replicação (preRC) em locais cromossômicos ligados a ORC que podem ser usados posteriormente como origens de replicação. Portanto, a uma temperatura permissiva, sua duração da fase S deve ser a mesma que a do WT, enquanto a uma temperatura restritiva, nenhuma replicação de DNA deve ocorrer, pois nenhuma origem é licenciada12. No entanto, a uma temperatura semi-permissiva, onde menos origens são licenciadas, mas há o suficiente para conferir viabilidade celular (nossos dados não publicados; Barba Tena et al., em preparação), antecipamos diferentes durações para cada fase. Como esperado, com base em testes de queda, as células cdc6-1 cresceram da mesma forma que as células WT a uma temperatura permissiva (ou seja, 25 °C, Figura 2A), exibindo o mesmo tempo de duplicação (Figura 2B e Tabela 2), mas estavam mortas a ou acima de 34 °C (Figura 2A). De interesse, a uma temperatura semi-permissiva (ou seja, 28 °C), o cdc6-1 era viável (28 °C, Figura 2A). No entanto, o tempo de duplicação foi maior do que para o WT (Figura 2B e Tabela 2), e a duração de cada fase foi diferente. De fato, no cdc6-1, o G 1 foi ligeiramente mais curto (12 min ±1 min vs. 16 min ± 2 min), enquanto a fase S foi ligeiramente estendida (34 min ± 4 min vs. 29 min ± 5 min), e a fase G2 + M foi significativamente mais longa (77 min ± 4 min vs. 45 min ± 3 min) em comparação com o WT (Figura 2C, D e Tabela 3). A fase S foi, surpreendentemente, não muito estendida, mas a intensidade média do sinal EdU foi diminuída em 25% (Figura 2C,D), o que é consistente com uma fase S iniciada a partir de menos origens. Além disso, enquanto as células WT positivas para EdU foram distribuídas homogeneamente entre as fases S (S1) e tardia (S2) (Figura 2C, Figura Suplementar S1A, fases S [S1] inicial e tardia [S2] delimitadas com uma linha tracejada vertical na porta superior), 65% das células cdc6-1 positivas para EdU se acumularam na fase S tardia (Figura 2D, Figura Suplementar S1B). Não houve distinção clara entre as populações S e G 2 + M (Figura 2D), sugerindo que as células lutaram para completar a fase S antes de entrar na fase G2. Portanto, este método é adequado e sensível para identificar mutantes com defeitos na fase S (duração e/ou distribuição) e na duração da fase ciclo celular.
Um método complementar foi concebido para determinar quando as células começam e terminam sua replicação de DNA e estimar a duração da fase S usando células sincronizadas (etapa 1.2 do protocolo). Para tanto, utilizando-se α fator com células sincronizadas em G1, as células foram liberadas em meio SC e coletadas a cada 5 min. A duração da fase S pode ser de cerca de 25 min com base no tempo em que o conteúdo de DNA mudou de 1C para 2C no perfil do citômetro de fluxo Sytox Green (Figura 3A). No entanto, essa estimativa depende de quando uma fração celular significativa da população incorporou Sytox Green suficiente para ser vista no perfil FACS. Os eventos de replicação antecipada e tardia não podem ser detectados com esse método. Para definir com precisão quando a fase S começa e termina e quanto tempo dura, as células da fase S foram destacadas de uma alíquota de células após a marcação de pulso com EdU (10 μM) por 5 min a cada 5 min após a liberação do G1. Como esperado, nos primeiros 10 minutos após a liberação, todas as células estavam na área inferior esquerda (ou seja, em G1, Figura 3B, Figura Suplementar S2). Quinze minutos após a liberação, uma fração de células positivas para EdU já foi detectada (compare as duas primeiras linhas na Figura Suplementar S2 e na Figura Suplementar S3, células tratadas com EdU e livres de EdU, respectivamente), indicando que a fase S havia começado (Figura 3C). A progressão através da fase S foi observada pela nuvem celular primeiro se movendo para cima e depois para a direita no gráfico bivariado PI-EdU (Figura 3D-F). Finalmente, a 35 min da liberação, uma fração de células era EdU-negativa, mas com o dobro da quantidade de DNA, indicando que essas células haviam completado a fase S e estavam na fase G2 + M (Figura 3G). Assim, a fase S dura 20 min nessas condições. Vale ressaltar que, apesar da alta sincronia observada com a sobreposição do conteúdo de DNA detectado com Sytox Green, sugerindo que a fase S havia terminado em toda a população 40 min após a liberação, as análises bivariadas mostraram que algumas células terminaram a fase S 60 min após a liberação e que a fase S estava completa para toda a população 65 min após a liberação (Figura 3H, I e Figura Suplementar S2).
Além disso, a fase S e a síntese de DNA podem ser monitoradas por microscopia. A partir de cada origem de replicação ativada, a síntese de DNA é realizada por dois replissomos amarrados, formando um foco de replicação nuclear que pode ser seguido por microscopia por imagem de uma versão marcada de um fator de replicação e/ou matriz de operadores e seu repressor correspondente fundido a uma proteína fluorescente 2,13. Alternativamente, a síntese de DNA pode ser detectada por microscopia utilizando análogos de timidina14,15. Usamos EdU para monitorar as regiões subnucleares de DNA que sofrem síntese de DNA. Para este fim, nós pulse-marcado WT assíncrono e cdc6-1 células com EdU (10 μM) por 3 min a 28 °C e as fotografamos após a reação Click. Esperávamos detectar variações nas intensidades de sinal EdU dependendo da taxa de síntese de DNA e da progressão celular no ciclo celular durante o pulso EdU de 3 minutos (ou seja, as células que passam os 3 minutos inteiros na fase S exibirão um sinal mais forte do que aquelas que entram ou saem da fase S durante o pulso). Assim, as células WT da fase S exibiram um sinal EdU em seu núcleo que variou em intensidade (Figura 4A). A duração da fase S pode ser prontamente extrapolada a partir desta análise. De fato, foi determinado a partir de duas replicações biológicas (pelo menos 150 células foram contadas), que 34% ± 3% e 38% ± 3% das células WT e cdc6-1 eram EdU positivas, respectivamente. Como nessas condições de crescimento, o tempo de duplicação foi de 90 min e 123 min para as células WT e cdc6-1, respectivamente (Tabela 2), extrapolou-se que a fase S durou 31 min e 47 min, respectivamente. O primeiro resultado está de acordo com o obtido a partir de nossas análises FACS (Tabela 3), indicando que a detecção de células EdU-positivas por microscopia permite a determinação da duração da fase S. Vale ressaltar que esta última é maior do que a duração da fase S extrapolada de nossas análises de FACS, pois não houve distinção clara entre as populações S e G2 + M (Figura 2D). Os focos de EdU foram prontamente observados nas células WT (Figura 4B), mas foram mais fracos e menores nas células cdc6-1 (Figura 4C). Para descartar a possibilidade de que a diferença de intensidade do sinal EdU entre as células WT e cdc6-1 dependesse da etapa da fase S, a intensidade foi quantificada a partir de células sincronizadas. Como esperado, a intensidade média do sinal EdU foi três vezes menor nas células cdc6-1 (Figura 4D), consistente com a replicação do DNA iniciada a partir de menos origens de replicação. O sinal EdU foi restrito ao núcleo, colocalizando-se com um forte sinal DAPI, e organizado em padrões globulares, consistentes com a organização da replicação do DNA em regiões nucleares ou fábricas de replicação. É importante ressaltar que o EdU só foi detectado em células não brotadas ou de pequeno brotamento e nunca presente em células com grandes brotos, indicando que as células de levedura WT haviam terminado a replicação no momento em que entraram na mitose. Este método é, portanto, sensível para visualizar a replicação do DNA em uma alta resolução espacial, bem como para detectar e quantificar defeitos leves de replicação do DNA.
Figura 1: Análises representativas do FACS. (A) Análises representativas do FACS Sytox Green para células WT cultivadas a 25 °C. (B,C) Análises representativas do FACS bivariado EdU-PI para células WT cultivadas a 25 °C e marcadas por pulso por 5 min com EdU (10 μM) ou 1 μL de DMSO. Os polígonos foram os mesmos em ambas as análises. C foi usado para delinear o EdU-negativo das células EdU-positivas (geralmente, o limite é definido em uma intensidade >1× 10 4-2 × 104). A porta superior do polígono delineou as células EdU-positivas (fração de fase S). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fração de células nas fases do ciclo celular G 1, S e G2 + M em populações celulares assíncronas. (A) As cepas WT e cdc6-1 foram detectadas em diluições seriadas de cinco vezes em meio rico e cultivadas a 25 °C, 28 °C ou 34 °C. (B) Tempo de duplicação da população. As células WT assíncrona e cdc6-1 foram cultivadas a 25 °C ou 28 °C, e a concentração celular foi medida a cada hora por 7 h. (C,D) Análise bivariada FACS EdU-PI de células WT e cdc6-1 cultivadas a 28 °C e marcadas por pulso por 5 min com EdU (10 μM). Multiplicando o tempo de duplicação da população pela fração da fase S fornece a duração da fase S. As intensidades médias das células EdU-positivas e EdU-negativas foram calculadas como a média da intensidade de cada valor no polígono correspondente. As intensidades médias das células EdU-negativas para WT e cdc6-1 (5.077 e 4.454, respectivamente) foram normalizadas para 1. As intensidades médias das células EdU-positivas para WT e cdc6-1 (52.604 e 36.141, respectivamente) foram divididas pelo fator de normalização utilizado para cada cepa. Os valores obtidos foram 10,4 e 8,1, respectivamente (ou seja, uma redução de 25%, como mencionado no texto). Abreviaturas: WT = tipo selvagem; EdU = 5-etil-2'-desoxiuridina; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; IP = iodeto de propídio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Determinação da duração da fase S em células sincronizadas. (A) Análise do curso temporal do conteúdo de DNA de células WT após liberação de fator α a 28 °C. O tempo indicado leva em conta a duração do pulso EdU (5 min). (B-I) Análises FACS bivariadas de EdU-PI para células WT sincronizadas marcadas por pulso por 5 min com EdU (10 μM) e coletadas nos horários indicados após a liberação da parada G1. Abreviaturas: WT = tipo selvagem; EdU = 5-etil-2'-desoxiuridina; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; IP = iodeto de propídio. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Detecção e quantificação de EdU por microscopia. As cepas assíncronas WT e cdc6-1 foram cultivadas por 2 h a 28 °C e, em seguida, marcadas por pulso por 3 min com EdU (10 μM) e fotografadas por microscopia de campo amplo usando filtros de excitação/emissão adequados. (A) Imagens representativas de microscopia de campo largo para WT e (B,C) células individuais para WT e cdc6-1 visualizadas por DIC e coradas com DAPI ou para EdU, conforme indicado. As barras de escala em (A) e (B,C) são de 10 μm e 2 μm, respectivamente. (D) Medições da intensidade da EdU em células WT e cdc6-1 síncronas cultivadas a 28 °C 30 min após a libertação da paragem G1. O gráfico representa o agrupamento de três replicações biológicas (pelo menos 50 células foram contadas em cada replicação biológica). A média ± DP são exibidas no gráfico. Um teste t bicaudal não emparelhado entre as células WT e cdc6-1 é indicado por **** (p < 0,0001). Abreviaturas: WT = tipo selvagem; EdU = 5-etil-2'-desoxiuridina; DIC = contraste de interferência diferencial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; A.U. = unidades arbitrárias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Genótipo | Figuras e tabelas | ||
| WT (E3087): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | Fig.1, Fig.2A,B,C, Fig3, Fig.4A,B,D, SUPP Fig.1,2,3 Tabelas2,3 | ||
| cdc6-1 (E5956): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | Fig.2A,B,D, Fig.4 C,D, Supp Fig.1, Tabelas2,3 | ||
| TK+ (E1000): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) | Supp Fig.4 | ||
| TK+ hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | Supp Fig.4 | ||
| hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 | Supp Fig.4 | ||
| cdc6-1 TK+ hENT+ (E3968): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | Supp Fig.4 | ||
| W303-1A (E001): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 | Supp Fig.4 | ||
Tabela 1: Lista das cepas utilizadas neste estudo.
| WT | cdc6-1 | |||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |
| Tempo de duplicação (min) | 120 | 90 | 118 | 123 |
| SD | ± 13 min | ± 3 min | ± 10 min | ± 6 min |
Tabela 2: Tempos médios de duplicação das estirpes WT e cdc6-1 cultivadas a 25 °C e 28 °C. Os tempos de duplicação foram calculados a partir de três repetições biológicas (quatro repetições técnicas para cada replicação biológica) utilizando a seguinte fórmula: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), onde Cf e Ci correspondem às concentrações celulares final e inicial, respectivamente, e Δt corresponde à diferença de minutos entre tf e ti, quando Cf e Ci foram medidos, respectivamente.
| WT | cdc6-1 | |||||||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |||||
| Por cento | Duração (mín) |
Por cento | Duração (mín) |
Por cento | Duração (mín) |
Por cento | Duração (mín) |
|
| G1 | 27 | 32 | 18 | 16 | 13 | 16 | 10 | 12 |
| S | 29 | 35 | 32 | 29 | 28 | 34 | 28 | 34 |
| G2+M | 44 | 53 | 50 | 45 | 59 | 71 | 62 | 77 |
| SD G1 | ±5 | ±4 | ±3 | ±2 | ±2 | ±1 | ±1 | ±1 |
| SD S | ±3 | ±6 | ±5 | ±5 | ±5 | ±7 | ±4 | ±4 |
| SD G2+M | ±2 | ±7 | ±4 | ±3 | ±4 | ±4 | ±6 | ±4 |
Tabela 3: Frações médias de células e duração das fases G 1, S e G2 + M em células WT e cdc6-1 cultivadas a 25 °C e 28 °C. As frações das células foram determinadas a partir de três replicações biológicas (duas repetições técnicas para cada replicação biológica). As diferenças na duração de G 1, S e G2 + M entre as células WT e cdc6-1 cultivadas a 28 °C foram estatisticamente significativas (teste t bicaudal não pareado, p <0,1).
Figura suplementar S1: Fração de células nas fases S inicial e tardia em células WT e cdc6-1 cultivadas a 28 °C. Dois polígonos idênticos denominados S1 e S2 para as fases S inicial e tardia, respectivamente, foram sorteados na fração de células positivas para EdU para dividi-la em duas metades nas análises FACS bivariadas de EdU-PI para (A) células WT cultivadas a 28 °C e (B) células cdc6-1 cultivadas a 28 °C. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S2: Progressão do ciclo celular de células marcadas com pulso EdU após liberação da parada G1 visualizada pelo FACS bivariado EdU-PI. Uma alíquota de células foi marcada por pulso por 5 min com 10 μM de EdU a cada 5 min após liberação da parada do fator α a 28 °C e até 80 min, conforme indicado. Abreviaturas: EdU = 5-etil-2'-desoxiuridina; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; IP = iodeto de propídio. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S3: Progressão do ciclo celular de células tratadas com DMSO após liberação da parada G1 visualizada pelo CAVCS bivariado EdU-PI. Isso é o mesmo que a Figura 2 Suplementar, mas as células foram incubadas por 5 min com 1 μL de DMSO (dimetilsulfóxido). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S4: Toxicidade de BrdU e EdU em células de levedura TK hENT1. As células do genótipo indicado foram detectadas em diluições em série de cinco vezes em placas YPD contendo concentrações crescentes de BrdU ou EdU e cultivadas por 40 h a 30 °C. Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; BrdU = bromodeoxiuridina; Edu = 5-etil-2'-desoxiuridina; TK = timidina quinase; hENT1 = transportador de nucleosídeos equilibrativos humanos. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A levedura é um organismo modelo primordial para estudos do ciclo celular, mas a caracterização de sua fase S tem sido dificultada por sua incapacidade de incorporar nucleosídeos exógenos, como o BrdU, que são usados como traçadores da replicação do DNA. Equipar leveduras com alta expressão de herpes simplex timidina quinase (TK) e a adição de um transportador de nucleosídeos humanos (hENT) resolveram em grande parte esse problema15,16. O EdU é mais versátil que o BrdU, pois sua detecção com pequena azida fluorescente e química Click é passível de análise de leveduras permeabilizadas e FACS, ao contrário dos anticorpos anti-BrdU17. Aqui, otimizamos as condições de rotulagem e detecção de EdU nesta cepa TK-hENT1 e mostramos que defeitos de replicação não detectados anteriormente podem ser quantificados usando este protocolo por FACS ou microscopia.
Estudar um mecanismo biológico usando ferramentas que podem interferir com o mesmo mecanismo é um problema comum na biologia. Como o EdU tem um efeito citotóxico conhecido, procuramos concentrações de EdU que não sejam tóxicas na exposição crônica à cepa TK-hENT1 modificada e descobrimos que 10 μM é uma dose adequada. As células TK-hENT1 não se proliferam a 25 μM de EdU, enquanto as células TK-isoladas ou hENT1-sozinhas suportam facilmente 100 μM de EdU (Figura Suplementar S4). Embora as células de levedura sejam consideravelmente mais sensíveis ao EdU do que o BrdU, descobrimos que a proliferação diminuiu apenas após o segundo ciclo celular após a exposição ao EdU, sugerindo que ele precisa ser incorporado em ambas as cadeias para impactar a proliferação celular (dados não mostrados). Para permanecer no lado seguro, usamos 10 μM EdU em todo este protocolo, com pulsos curtos apenas (3 min para microscopia; 5 min para FACS), e descobrimos que isso era adequado para uma boa detecção usando este protocolo otimizado.
Defeitos sutis na replicação do DNA podem ter um forte impacto nos rearranjos cromossômicos4. Portanto, o desenvolvimento de técnicas e protocolos capazes de detectar esses defeitos sutis é fundamental para descobrir a etiologia das aberrações cromossômicas. Aqui, mostramos que esse protocolo otimizado de incorporação e detecção de EdU pode medir até três vezes a redução na intensidade do sinal (Figura 2 e Figura 4), indicando que a taxa de síntese de DNA é reduzida em células cdc6-1 sensíveis à temperatura cultivadas a 28 °C, que, até o momento, não apresentam defeitos nos ensaios de viabilidade da placa (Figura 2A). ). Este protocolo de incorporação e quantificação de EdU pode, assim, ser usado para rastrear outros mutantes para os quais os defeitos de replicação não são suspeitos inicialmente. Além disso, pode ser útil para detectar a síntese de DNA mitótico (MiDAS), a síntese de DNA dependente de recombinação meiótica ou outra síntese de DNA de trato longo.
Uma desvantagem é que a detecção de EdU pode ser realizada apenas em células fixas, impedindo a análise ao vivo, como acontece com o PCNA-GFP ou outras leituras fluorescentes de replicação de DNA, que sofrem com a alta fototoxicidade dos feixes de laser usados para imagens. O crescimento de células em um meio sintético é crucial para a melhor detecção, pois os remanescentes de YPD parecem apagar significativamente a reação Click. Curiosamente, destacar as células da fase S usando a análise bivariada EdU-PI FACS em populações sincronizadas permite estimar a duração da fase S para 20 min em células únicas (Figura 3, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3). No entanto, mesmo quando a sincronia após a liberação do fator α parece tão quase perfeita quanto na análise clássica do Sytox Green FACS (Figura 3A), fica claro a partir da análise bivariada do EdU-PI FACS que as células entram na fase S de forma relativamente assíncrona (Figura 3B-I).
Aqui, descrevemos três métodos para determinar a duração da fase S usando citometria de fluxo e microscopia em células síncronas e assíncronas nos níveis de célula única e populacional. As durações médias da fase S determinadas em células WT assíncronas no nível populacional são semelhantes usando citometria de fluxo e microscopia, em 29 min e 31 min, respectivamente, enquanto nossa abordagem sincronizada baseada em célula única mostra que a duração pode ser tão curta quanto 20 min (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Tabela 3 ). A discrepância entre esses valores é surpreendente, mas pode ser facilmente explicada. De fato, com nossa abordagem baseada em célula única, a duração da fase S foi determinada com base nos primeiros eventos (ou seja, as primeiras células que entram e saem da fase S, Figura 3C,G), mas isso não implica que a fase S dure 20 minutos em cada célula dentro de uma população. Esses dados apoiariam a noção inesperada de que há um certo nível de heterogeneidade na duração da fase S entre as células.
Protocolos melhorados ou novas técnicas podem derrubar dogmas de longa data ou ideias novas. Há três que esses dados desafiam. Primeiro, acredita-se que a síntese de DNA é concomitante com a emergência de brotos em S. cerevisiae. A Figura 4A-C mostra que a coloração EdU é mais forte em células não brotadas e de brotamento pequeno, apesar do atraso de marcação de 3 minutos, indicando que a fase S começa claramente antes da brotação, como mostrado anteriormente16. Em segundo lugar, é relatado que as células de levedura não têm uma fase G2, com fusos mitóticos se formando ao mesmo tempo que a síntese de DNA. Os pulsos muito curtos combinados com a detecção sensível de EdU por FACS (Figura 3, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3) ou microscopia (Figura 4) permitem determinar com precisão quando a fase S começa e termina em células únicas. Ao fazer isso, descobrimos que a síntese de DNA em massa termina 40 min após a liberação do fator de α (Figura 3, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3), enquanto fusos mitóticos curtos se formam apenas 20 min depois16 (dados não mostrados). Concluímos que as células de levedura têm uma fase G2. Em terceiro lugar, foi proposto recentemente que até 30% das células de levedura completam a síntese de DNA na anáfase-telofase18. Usando este protocolo otimizado, não detectamos a incorporação de EdU em células que exibem um fuso de anáfase/telófase (dados não mostrados), mas não podemos descartar que essa segunda onda de síntese de DNA esteja abaixo do limiar de detecção utilizado. Dada a forte relação sinal/ruído, consideramos a última opção improvável.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores desejam agradecer à Agence Nationale de la Recherche (ANR) e à Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) pelas bolsas de doutoramento ao J.d.D.B.T. e à Agence Nationale pour la Recherche (ANR) pelo apoio financeiro (subvenção ANR-18-CE12-0018-01). A citometria e a microscopia foram realizadas no centro de imagem BioCampus da RM de Montpellier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100--812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
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