Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Summary

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Abstract

La replicación del ADN eucariota es un proceso altamente regulado que garantiza que el plano genético de una célula se duplique correctamente antes de la segregación cromosómica. A medida que los defectos de síntesis de ADN subyacen a los reordenamientos cromosómicos, el monitoreo de la replicación del ADN se ha vuelto esencial para comprender la base de la inestabilidad del genoma. Saccharomyces cerevisiae es un modelo clásico para estudiar la regulación del ciclo celular, pero los parámetros clave de replicación del ADN, como la fracción de células en la fase S o la duración de la fase S, aún son difíciles de determinar. Este protocolo utiliza pulsos cortos y no tóxicos de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU), un análogo de la timidina, en células de levadura TK-hENT1 diseñadas, seguidas de su detección por reacción Click para permitir la visualización y cuantificación de la replicación del ADN con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo. Este método puede identificar defectos previamente pasados por alto en la fase S y la progresión del ciclo celular de los mutantes de levadura, lo que permite la caracterización de nuevos actores esenciales para garantizar la estabilidad del genoma.

Introduction

La estabilidad del genoma a través de la división mitótica está garantizada por la transmisión de un conjunto completo e igual de cromosomas a las dos progenies celulares producidas. Esto se basa en la finalización precisa de una serie de eventos que ocurren en un momento dado en cada fase del ciclo celular. En G 1, los orígenes de replicación se licencian tras la contratación de varios factores de licencia, incluido Cdc6¹. En la fase S, la duplicación del genoma completo se inicia a partir de múltiples orígenes de replicación activa y se realiza mediante maquinarias de replicación que se reúnen en focos microscópicamente visibles llamados fábricas de replicación². En la fase M, las cromátidas hermanas duplicadas se unen y se biorientan en el huso mitótico para permitir su segregación a los polos opuestos de la célula mitótica³. La regulación, la finalización adecuada y la duración de cada fase son clave para garantizar la estabilidad del genoma. De hecho, la salida prematura de cualquiera de estas fases conduce a la inestabilidad del genoma. Por ejemplo, un G 1 más corto inducido por la deleción del inhibidor de CDK de levadura en ciernes Sic1 o por la sobreexpresión de ciclinas G₁ alterará la fase S posterior 4,5,6. En consecuencia, estas desregulaciones, asociadas o no al estrés de replicación, resultan en roturas cromosómicas, reordenamientos y mala segregación ^4,5,6. Por lo tanto, monitorear la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de las otras fases del ciclo celular puede ser crucial para identificar los defectos que ocurren en diferentes mutantes y en diferentes condiciones estresantes.

Un método tradicional para medir la duración de la fase del ciclo celular incluye citometría de flujo de contenido de ADN simple (Figura 1A) y se basa en un algoritmo de ajuste (disponible en la mayoría de los programas de citometría utilizados) utilizado para separar la población en fracciones de fase G₁, S y G₂ + M de los picos 1C y 2C. Las fracciones se multiplican por la población duplicando el tiempo⁷. Sin embargo, este método solo da valores estimados, requiere una distribución homogénea del tamaño de celda dentro de una fracción dada y no es aplicable a cultivos sincronizados. Para estudiar la duración de la fase S en células de mamíferos, se han desarrollado y utilizado ampliamente varios análogos de timidina, incluido EdU. Su absorción del medio extracelular y su fosforilación por la timidina quinasa (en lo sucesivo, TK) las ponen a disposición de las ADN polimerasas para incorporarlas en los sitios de síntesis de ADN (replicación, recombinación, reparación). Para evitar la ausencia del gen TK en las células de Saccharomyces cerevisiae , se han diseñado cepas de levadura para permitir la expresión estable y constitutiva del virus del herpes simple TK⁸ y el transportador de nucleósidos de equilibrio humano (hENT1)⁹. Una vez incorporado al ADN, EdU se detecta a través de la reacción selectiva de clic, que acopla químicamente su fracción alquina a fluorocromos modificados con azida¹⁰.

Este documento proporciona dos protocolos integrales optimizados para las células diseñadas con TK-hENT1 asíncronas y sincrónicas con etiquetas de pulso con EdU para visualizar y medir con precisión la duración y la dinámica de la replicación del ADN, así como la duración de las otras fases del ciclo celular, con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo.

Protocol

1. Cultivo celular de S. cerevisiae NOTA: Las cepas de levadura utilizadas se enumeran en la Tabla 1 NOTA: La duración de la fase S se puede monitorear de diferentes maneras. Dependiendo de la pregunta a abordar, las células se pueden cultivar de forma asíncrona o sincrónica después de la detención de G1 . De células de S. cerevisiae de crecimiento asincrónicoNOTA: Este método perm…

Representative Results

Para determinar la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de G 1 y G2 + M (paso del protocolo 1.1), las células de tipo salvaje W303 de S. cerevisiae (WT, Tabla 1) se cultivaron asíncronamente en medio SC durante 7 h. Cada hora, la concentración celular fue monitoreada para determinar el tiempo de duplicación (Figura 2B). En estas condiciones de crecimiento, el tiempo de duplicación calculado fue de 120 min ± 13 min a 25…

Discussion

La levadura es un organismo modelo principal para estudios del ciclo celular, sin embargo, la caracterización de su fase S se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por su incapacidad para incorporar nucleósidos exógenos, como BrdU, que se utilizan como trazadores de la replicación del ADN. El equipamiento de la levadura con una alta expresión de herpes simple timidina quinasa (TK) y la adición de un transportador de nucleósidos humanos (hENT) ha resuelto en gran medida este problema^15,16</s…

Materials

α-factor	Genescript	RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA)	Euromedex	04-100–812-E
Copper sulfate	Sigma	C1297
DAPI	Sigma	D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide)	Interchim	FP-JV6320	Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide	Dyomics	530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine)	Carbosynth	NE08701
Ethanol absolute	Carlo Erba reagents	P013A10D16	or equivalent
L- ascorbic acid	Sigma	A4544
Propidium iodide	Sigma	P4864
Proteinase K	Euromedex	EU0090
Rnase	SIGMA	R5000
Sytox Green	Invitrogen	S-7020
Equipment
Cell counter	OLS	CASY
Flow cytometer	Agilent	NovoSampler Pro
Shaking incubator	Infors	444-4230	or equivalent
Shaking water bath	Julabo	SW22	or equivalent
Sonicator	Sonics	Vibra cell
Wide-field microscopy	Leica	THUNDER Imager	or equivalent