Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد مدة المرحلة S باستخدام 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Inincorporated في Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

وصفنا بروتوكولين متكاملين لتحديد مدة الطور S بدقة في S. cerevisiae باستخدام EdU ، وهو نظير ثيميدين ، والذي تم دمجه في الجسم الحي واكتشافه باستخدام كيمياء النقر عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. يسمح بالتوصيف السهل لمدة تكرار الحمض النووي وعيوب النسخ المتماثل التي تم التغاضي عنها في الطفرات.

Abstract

تضاعف الحمض النووي حقيقي النواة هو عملية منظمة للغاية تضمن تكرار المخطط الجيني للخلية بشكل صحيح قبل فصل الكروموسومات. نظرا لأن عيوب تخليق الحمض النووي تكمن وراء إعادة ترتيب الكروموسومات ، فقد أصبحت مراقبة تكرار الحمض النووي ضرورية لفهم أساس عدم استقرار الجينوم. Saccharomyces cerevisiae هو نموذج كلاسيكي لدراسة تنظيم دورة الخلية ، ولكن لا يزال من الصعب تحديد معلمات تكرار الحمض النووي الرئيسية ، مثل جزء الخلايا في المرحلة S أو مدة المرحلة S. يستخدم هذا البروتوكول نبضات قصيرة وغير سامة من 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) ، وهو نظير ثيميدين ، في خلايا خميرة TK-hENT1 المهندسة ، متبوعا باكتشافه عن طريق تفاعل النقر للسماح بتصور وقياس تكرار الحمض النووي بدقة مكانية وزمانية عالية على مستوى الخلية الواحدة والسكان عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي. قد تحدد هذه الطريقة العيوب التي تم تجاهلها سابقا في المرحلة S وتطور دورة الخلية لمتحولات الخميرة ، مما يسمح بتوصيف لاعبين جدد ضروريين لضمان استقرار الجينوم.

Introduction

يتم ضمان استقرار الجينوم من خلال الانقسام الانقسامي من خلال نقل مجموعة كاملة ومتساوية من الكروموسومات إلى ذريتي الخلية المنتجتين. يعتمد هذا على الإكمال الدقيق لسلسلة من الأحداث التي تحدث في وقت معين في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. في G 1 ، يتم ترخيص أصول النسخ المتماثل عند توظيف العديد من عوامل الترخيص ، بما في ذلك Cdc61. في المرحلة S ، يبدأ تكرار الجينوم الكامل من أصول النسخ المتماثل النشطة المتعددة ويتم تنفيذه بواسطة أجهزة النسخ المتماثل التي تتجمع في بؤر مرئية مجهريا تسمى مصانع النسخ المتماثل2. في المرحلة M ، يتم ربط الكروماتيدات الشقيقة المتضاعفة وثنائية الاتجاه على المغزل الانقسامي للسماح بفصلها إلى القطبين المتقابلين للخلية الانقسامية3. يعد التنظيم والإكمال المناسب ومدة كل مرحلة أمرا أساسيا لضمان استقرار الجينوم. في الواقع ، يؤدي الخروج المبكر من أي من هذه المراحل إلى عدم استقرار الجينوم. على سبيل المثال ، فإن G 1 الأقصر الناجم عن حذف مثبط CDK الخميرة الناشئ Sic1 أو عن طريق الإفراط في التعبير عن سيكلين G1 سيغير المرحلة S اللاحقة4،5،6. وبالتالي ، فإن عمليات إلغاء التنظيم هذه ، المرتبطة أو غير المرتبطة بإجهاد النسخ المتماثل ، تؤدي إلى كسر الكروموسومات وإعادة ترتيبها والفصل الخاطئ4،5،6. لذلك ، قد تكون مراقبة مدة المرحلة S ، وعلى نطاق أوسع ، مدة المراحل الأخرى من دورة الخلية أمرا حاسما لتحديد العيوب التي تحدث في الطفرات المختلفة وفي الظروف المجهدة المختلفة.

تتضمن الطريقة التقليدية لقياس مدة مرحلة دورة الخلية القياس الخلوي البسيط لتدفق محتوى الحمض النووي (الشكل 1 أ) وتعتمد على خوارزمية مناسبة (متوفرة في معظم برامج قياس الخلايا) تستخدم لفصل السكان إلى كسور طور G1 و S و G2 + M من قمم 1C و 2C. ثم يتم ضرب الكسور في وقت مضاعفة المجتمع الإحصائي7. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تعطي قيما تقديرية فقط ، وتتطلب توزيعا متجانسا لحجم الخلية داخل جزء معين ، ولا تنطبق على الثقافات المتزامنة. لدراسة مدة المرحلة S في خلايا الثدييات ، تم تطوير العديد من نظائر الثيميدين واستخدامها على نطاق واسع ، بما في ذلك EdU. إن امتصاصها من الوسط خارج الخلية والفسفرة بواسطة ثايميدين كيناز (المشار إليه فيما يلي باسم TK) يجعلها متاحة لبوليميراز الحمض النووي لدمجها في مواقع تخليق الحمض النووي (النسخ المتماثل ، إعادة التركيب ، الإصلاح). لتجاوز غياب جين TK في خلايا Saccharomyces cerevisiae ، تم تصميم سلالات الخميرة للسماح بالتعبير المستقر والتأسيسي لفيروس الهربس البسيط TK8 وناقل النوكليوزيد البشري المتوازن (hENT1)9. بمجرد دمجه في الحمض النووي ، يتم اكتشاف EdU عبر تفاعل النقر الانتقائي ، والذي يقترن كيميائيا بمزيج الألكين الخاص به إلى الفلوروكرومات المعدلة بالأزيد10.

تقدم هذه الورقة بروتوكولين شاملين محسنين لتسمية الخلايا المهندسة TK-hENT1 غير المتزامنة والمتزامنة مع EdU من أجل تصور وقياس مدة وديناميكيات تكرار الحمض النووي بدقة ، بالإضافة إلى مدة المراحل الأخرى من دورة الخلية ، مع دقة مكانية وزمانية عالية على مستوى الخلية الواحدة والسكان عن طريق الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S. ثقافة الخلايا cerevisiae

ملاحظة: يتم سرد سلالات الخميرة المستخدمة في الجدول 1

ملاحظة: يمكن مراقبة مدة المرحلة S بطرق مختلفة. اعتمادا على السؤال الذي يجب معالجته ، يمكن زراعة الخلايا بشكل غير متزامن أو متزامن بعد اعتقال G1 .

  1. من خلايا S. cerevisiae المتنامية بشكل غير متزامن
    ملاحظة: تسمح هذه الطريقة بتحديد النسبة المئوية للخلايا في المرحلة S في عدد الخلايا المتزايد بشكل غير متزامن. من خلال تحديد وقت المضاعفة ، يمكن استقراء مدة المرحلة S (والمراحل الأخرى).
    1. تلقيح خلايا S. cerevisiae في 10 مل من وسط اصطناعي كامل (SC) بتركيز منخفض للخلايا (5 × 104 خلايا / مل) لمزرعة ليلية عند 30 درجة مئوية مع تحريض مداري عند 130 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: يتم قياس التركيز باستخدام عداد خلية. لحساب أوقات المضاعفة بكفاءة ، يوصى بتلقيح الثقافة من ثقافة ليلية لا تزال في المرحلة الأسية (أي أقل من 2 × 107 خلايا / مل). لا ينصح بزراعة الخلايا في وسط غني (YPD) ، لأن اكتشاف EdU ليس فعالا.
    2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الخلايا في 20 مل من وسط SC الطازج عند التركيز النهائي ل 5 × 105 خلايا / مل.
    3. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية في حمام مائي يهتز مع اهتزاز أفقي عند 120 دورة في الدقيقة.
    4. قم بقياس تركيز الخلية كل ساعة حتى تصل إلى 1 × 107 خلايا / مل.
      ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بعمل تمثيل رسومي لزيادة تركيز الخلية بمرور الوقت. يتم شرح الصيغة المستخدمة لحساب أوقات المضاعفة في وسيلة إيضاح الجدول 2.
    5. تابع بالتوازي مع الخطوة 2 لوضع العلامات EdU عندما يكون تركيز الخلية حوالي 2 × 10 6-5 × 106 خلايا / مل.
  2. من خلايا S. cerevisiae المتزامنة G1
    ملاحظة: تسمح هذه الطريقة بتحديد متى تبدأ المرحلة S وتنتهي عن طريق قياس التدفق الخلوي و / أو تحليلات الفحص المجهري.
    1. تلقيح خلايا S. cerevisiae في 10 مل من وسط SC بتركيز منخفض للخلايا (5 × 104 خلايا / مل) لمزرعة ليلية عند 30 درجة مئوية مع تحريض مداري عند 130 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: راجع الملاحظات بعد الخطوة 1.1.1.
    2. في اليوم التالي ، قم بتخفيف الخلايا في 20 مل من وسط SC الطازج بتركيز نهائي قدره 2 × 10 6-3 × 106 خلايا / مل.
    3. أضف 40 ميكرولتر من 1 ملغ / مل α عامل مخفف في الماء.
    4. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية مع التحريض المداري عند 130 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
    5. أضف مرة أخرى 40 ميكرولتر من 1 ملغ / مل α عامل مخفف في الماء.
    6. استزرع الخلايا عند 30 درجة مئوية مع التحريض المداري عند 130 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
    7. تصور الخلايا تحت المجهر الضوئي لمراقبة اعتقال G1 . تابع إذا كان أكثر من 90٪ من الخلايا تعرض shmoo والخلايا الأخرى عبارة عن خلايا مستديرة غير مهدمة.
      ملاحظة: اعتمادا على الخلفية المستخدمة ، فمن المستحسن أن صوتنة الخلايا قبل التصور shmoo. بالنسبة لخلفية W303 ، صوتي 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
    8. جهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق بسرعة 1500 × جم. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    9. أعد تعليق الخلايا في 20 مل من وسط SC.
    10. كرر الخطوات 1.2.8-1.2.9 مرة واحدة.
      ملاحظة: يتم غسل العامل α بعيدا مع هذه الخطوات ، ويتم تحرير الخلايا في دورة الخلية. بدلا من ذلك ، يمكن غسل العامل α عن طريق تصفية خلايا الخميرة بمرشح نيتروسليلوز 1.2 ميكرومتر باستخدام قمع مثبت على قارورة ذراع جانبية متصلة بمضخة تفريغ.
    11. اجمع 1 مل من الخلايا 2x كل 5 دقائق وانتقل إلى الخطوة 2 لوضع العلامات على EdU.
      ملاحظة: قم بتسمية الخلايا من أنبوب واحد فقط من الأنبوبين باستخدام EdU. تستخدم الخلايا غير الموسومة بالنبض لتمييز الخلايا الإيجابية EdU عن الخلايا السلبية EdU على الرسم البياني ثنائي المتغير بروبيديوم يوديد (PI) - EdU.
    12. أضف 400 ميكرولتر من 1 مجم / مل α عامل مخفف في الماء بعد 30 دقيقة من الإطلاق.
      ملاحظة: هذه الجرعة العالية من عامل α مطلوبة لإيقاف الخلايا في المرحلة G1 من دورة الخلية التالية ولمنع الخلايا من العودة إلى المرحلة S اللاحقة.

2. وضع العلامات EdU

  1. انقل 1 مل من مزرعة الخلايا إلى أنبوب ميكروفوج سعة 2.0 مل يحتوي على 1 ميكرولتر من 10 مللي مول EdU. تخلط جيدا عن طريق الانقلاب.
    ملاحظة: لتمييز الخلايا الإيجابية EdU عن الخلايا السالبة EdU على FACS ثنائية المتغير PI-EdU ، قم بنقل 1 مل آخر من مزرعة الخلايا إلى أنبوب microfuge سعة 2.0 مل يحتوي على 1 ميكرولتر من DMSO.
  2. احتضن لمدة 3-5 دقائق عند 30 درجة مئوية تحت التحريك في حمام مائي يهتز.
    ملاحظة: ثلاث دقائق كافية للكشف عن EdU باستخدام المجهر ؛ مطلوب 5 دقائق للكشف الأمثل عن EdU على مقياس التدفق الخلوي.
  3. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
    1. أوقف التفاعل بإضافة 100 ميكرولتر من 20٪ بارافورمالدهيد إذا كان قياس حجم الخلية مطلوبا.
      ملاحظة: إذا كان سيتم الحفاظ على البنية النووية للخلايا الانقسامية سليمة لمزيد من التحليلات بعد تفاعل النقر ، فإننا نوصي بتثبيت الخلايا التي تحتوي على 2٪ بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة (RT) بدلا من وضع الخلايا على الجليد ، لأن الأخير يسبب إزالة بلمرة الأنابيب الدقيقة.
    2. اترك الخلايا لمدة 20 دقيقة عند RT تحت تحريض خفيف على هزاز متغير السرعة عند 20 إمالة / دقيقة لإصلاح الخلايا قبل إضافة 100 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.

3. تثبيت الخلية ونفاذية

  1. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في microfuge. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة مفرغة.
  2. أعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪. تخلط جيدا عن طريق دوامة.
  3. اتركه لمدة ≥1 ساعة عند RT بسرعة 20 إمالة / دقيقة على هزاز متغير السرعة لاختراق الخلايا.
    ملاحظة: الخلايا التي تنمو في وسط SC لا تحبيبات جيدا لأنها تميل إلى الالتصاق بجدران microfuge. إضافة الإيثانول يحسن التكوير ويقلل من فقدان الخلايا. يمكن تخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو لفترات أطول عند -20 درجة مئوية.
  4. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
  5. اغسل الخلايا 2x ب 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الغسالات ضرورية لإزالة EdU غير المدمج من الخلايا.

4. رد فعل النقر عليه

  1. لتحليل قياس الخلايا
    1. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    2. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.1 مجم / مل RNase A و 0.2 مجم / مل بروتيناز K.
    3. احتضن لمدة 1-2 ساعة عند 50 درجة مئوية مع الاهتزاز من حين لآخر (أو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية).
    4. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    5. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    6. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من PBS + 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA). احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
      ملاحظة: الأوقات الأطول ليست ضرورية بل إنها تضر بكفاءة تفاعلات النقر.
    8. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    9. أعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS + 1٪ BSA.
    10. قم بتوزيع الخلايا بين أنبوبين: 200 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لتفاعل النقر و 100 ميكرولتر في أنبوب طرد مركزي دقيق آخر سعة 1.5 مل لتلطيخ Sytox Green.
    11. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    12. لتلطيخ سيتوكس الأخضر
      ملاحظة: نوصي بشدة بأخذ حصة لتلوين Sytox Green (بدون نقرة) من أجل الحصول على ملفات تعريف مرجعية عالية الجودة لمحتوى الحمض النووي. في الواقع ، فإن تفاعل النقر يروي بقوة مضان intercalant ، بما في ذلك Sytox Green و PI fluorescence. وبالتالي ، يمكن أن يؤدي تفاعل النقر إلى تشويه قراءة محتوى الحمض النووي.
      1. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
      2. انقل 10-30 ميكرولتر (حسب تركيز الخلية) إلى أنبوب مقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من 50 mM Tris-HCl و pH 7.5 و 0.5 μM Sytox Green.
      3. Sonicate 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
      4. اتركيه في الظلام حتى تتم معالجة العينات على مقياس التدفق الخلوي.
        ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام.
    13. لتفاعل النقر
      1. قم بإعداد مخزن Azide Dye المؤقت الطازج عن طريق خلط الكواشف بالترتيب التالي (الكمية لأنبوب واحد): 36 ميكرولتر من PBS ، 2 ميكرولتر من 0.2 M CuSO4 ، 0.2 ميكرولتر من 2 mM Cy5 Azide ، و 2 ميكرولتر من 1 M حمض الأسكوربيك.
        ملاحظة: من الممكن تحضير مزيج رئيسي من المخزن المؤقت Azide Dye. يجب خلط الكواشف بنفس الترتيب المذكور أعلاه.
      2. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 40 ميكرولتر من مزيج Azide Dye الطازج. احتضان في RT في الظلام لمدة 60 دقيقة.
      3. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
      4. اغسل الخلايا 3x مع 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني.
        ملاحظة: الغسالات ضرورية للتخلص من جميع أزيد EdU-Cy5 القابل للذوبان.
      5. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل PI في برنامج تلفزيوني. اتركيه لمدة 10 دقائق في الظلام.
      6. نقل 10-30 ميكرولتر من تعليق الخلية (اعتمادا على تركيز الخلية) إلى أنبوب مقياس التدفق الخلوي الذي يحتوي على 300 ميكرولتر من 50 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5.
      7. Sonicate 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
      8. اتركيه في الظلام حتى تتم معالجة العينات على مقياس الخلايا.
        ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام.
    14. اقرأ عينات Sytox Green باستخدام ليزر أزرق مثير عند 488 نانومتر ومرشح 530/30 BP. انظر الشكل 1 أ للحصول على نتائج نموذجية. اقرأ عينات PI-EdU ثنائية المتغير على مخطط نقطي باستخدام ليزر أزرق مثير عند 488 نانومتر ومرشح 615/20 BP ل PI (المحور السيني) وليزر أحمر مثير عند 640 نانومتر ومرشح 660/20 BP (المحور ص). انظر الشكل 1 ب للحصول على نتائج نموذجية.
      ملاحظة: يمثل الشكل 1C نتيجة PI-EdU ثنائية المتغير FACS النموذجية للخلايا السالبة EdU. يسمح بتمييز الخلايا السلبية EdU عن الخلايا الإيجابية EdU.
  2. للتحليل المجهري
    1. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    2. إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من PBS + 1 ٪ BSA. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    4. قم بإعداد مخزن Azide Dye الطازج عن طريق خلط الكواشف بالترتيب التالي (الكمية لأنبوب واحد): 36 ميكرولتر من PBS ، 2 ميكرولتر من 0.2 M CuSO4 ، 0.2 ميكرولتر من 2 mM Dy-530 azide ، 2 ميكرولتر من 1 M حمض الأسكوربيك.
      ملاحظة: يمكن تحضير مزيج رئيسي من المخزن المؤقت Azide Dye طازجا عن طريق خلط الكواشف بالترتيب المذكور أعلاه.
    5. أعد تعليق الحبيبات باستخدام 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت Azide Dye الطازج. احتضان في RT في الظلام لمدة 60 دقيقة.
    6. بيليه الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    7. اغسل الخلايا 2x مع 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 10٪ في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: الغسالات ضرورية للتخلص من جميع أزيد Dy-530 القابل للذوبان.
    8. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في جهاز طرد مركزي دقيق. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    9. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام / مل 4'،6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) في برنامج تلفزيوني. اتركيه لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
    10. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10,000 × غرام في أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    11. اغسل ب 300 ميكرولتر من PBS لإزالة DAPI الزائد.
    12. حبيبات الخلايا لمدة 2 دقيقة في 10000 × غرام في microfuge. تجاهل الطاف مع ماصة فراغ.
    13. أعد تعليق الحبيبات ب 10-50 ميكرولتر من PBS اعتمادا على تركيز الخلية.
    14. Sonicate 2x ، لمدة 2 ثانية في كل مرة ، بسعة 40-50.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا في هذه المرحلة عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام.
    15. ماصة 1.7 ميكرولتر من الخلايا على شريحة مجهر زجاجي وغطاء بغطاء نظيف.
    16. راقب على الفور تحت مجهر مضان مع مرشحات DAPI و TexasRed أو Cy3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتحديد مدة المرحلة S ، وعلى نطاق أوسع ، مدة G 1 و G2 + M (خطوة البروتوكول 1.1) ، نمت خلايا S. cerevisiae W303 من النوع البري (WT ، الجدول 1) بشكل غير متزامن في وسط SC لمدة 7 ساعات. كل ساعة ، تم رصد تركيز الخلية لتحديد وقت المضاعفة (الشكل 2 ب). في ظروف النمو هذه ، كان وقت المضاعفة المحسوب 120 دقيقة ± 13 دقيقة عند 25 درجة مئوية (الجدول 2). عندما كانت الخلايا في المرحلة الأسية (2 × 10 6-5 × 106 خلايا / مل) ، تم تسمية حصص الخلايا بالنبض باستخدام EdU (10 μM) لمدة 5 دقائق لتمييز الخلايا في المرحلة S وتحديد النسبة المئوية للخلايا التي كانت في مراحل G1 و S و G2 + M. لوحظت ثلاث مجموعات من الخلايا في تحليل مقياس الخلايا EdU-PI ثنائي المتغير (الشكل 1B). تم التمييز بين السكان سلبيي EdU وإيجابيي EdU باستخدام تجربة تحكم لم يتم فيها تسمية الخلايا بالنبض باستخدام EdU ولكن تم تنفيذ تفاعل النقر (الشكل 1C). تتوافق مجموعتا EdU السلبيتان في المناطق السفلية اليسرى وأسفل اليمين اللتان اختلفت في شدة PI مرتين مع G1 و G2 + M ، على التوالي (الشكل 1B ، C). لذلك ، فإن السكان العلويين (بكثافة >1× 10 4-2 × 104) تتوافق مع الخلايا الإيجابية EdU التي كانت في المرحلة S في وقت النبض (الشكل 1B). ومن ثم ، كان 27٪ ± 5٪ من سكان الخلايا في المرحلة G1 ، و 29٪ ± 3٪ في المرحلة S ، و 44٪ ± 2٪ في G2 + M. نظرا لأن وقت المضاعفة كان 120 دقيقة ± 13 دقيقة في هذه الظروف ، فقد استقرأنا أن مراحل G1 و S و G 2 + M استمرت 32 دقيقة ± 4 دقائق و 35 دقيقة ± 6 دقائق و 53 دقيقة ± 7 دقائق ، على التوالي ، عند 25 درجة مئوية (الجدول 2 والجدول 3).

بعد ذلك ، كنا نهدف إلى التحقق من صحة هذه الطريقة وإظهار أنها حساسة بما يكفي لتحديد الطفرات التي تعاني من عيوب تكرار الحمض النووي التي تم تجاهلها حتى الآن. لقد استنتجنا أن أليلات فقدان الوظيفة القابلة للضبط للعوامل المشاركة في تضاعف الحمض النووي ستكون عناصر تحكم مثالية للتحقق من الصحة. ومن ثم ، استخدمنا سلالة خميرة تحتوي على متحولة cdc6-1 حساسة لدرجة الحرارة (الجدول 1) 11. Cdc6 هو عامل ترخيص أساسي يتم التعبير عنه في أواخر M و G1 لتجميع مجمعات ما قبل النسخ (preRC) على مواقع الكروموسومات المرتبطة ب ORC والتي يمكن استخدامها لاحقا كأصول تكرار. لذلك ، عند درجة حرارة متساهلة ، يجب أن تكون مدة الطور S هي نفسها مدة WT ، بينما في درجة حرارة مقيدة ، يجب ألا يحدث تكرار الحمض النووي حيث لا يوجد أصل مرخص12. ومع ذلك ، في درجة حرارة شبه متساهلة ، حيث يتم ترخيص عدد أقل من الأصول ولكن هناك ما يكفي لمنح بقاء الخلية (بياناتنا غير المنشورة ؛ Barba Tena et al. ، قيد الإعداد) ، توقعنا فترات مختلفة لكل مرحلة. كما هو متوقع ، بناء على اختبارات السقوط ، نمت خلايا cdc6-1 بنفس نمو خلايا WT عند درجة حرارة متساهلة (أي 25 درجة مئوية ، الشكل 2 أ) ، وأظهرت نفس وقت المضاعفة (الشكل 2 ب والجدول 2) ، لكنها ماتت عند أو فوق 34 درجة مئوية (الشكل 2 أ). من المثير للاهتمام ، عند درجة حرارة شبه متساهلة (أي 28 درجة مئوية) ، كان cdc6-1 قابلا للتطبيق (28 درجة مئوية ، الشكل 2 أ). ومع ذلك ، كان وقت المضاعفة أطول من WT (الشكل 2B والجدول 2) ، وكانت مدة كل مرحلة مختلفة. في الواقع ، في cdc6-1 ، كان G1 أقصر قليلا (12 دقيقة ± دقيقة واحدة مقابل 16 دقيقة ± دقيقتين) ، بينما تم تمديد المرحلة S قليلا (34 دقيقة ± 4 دقائق مقابل 29 دقيقة ± 5 دقائق) ، وكانت المرحلة G2 + M أطول بكثير (77 دقيقة ± 4 دقائق مقابل 45 دقيقة ± 3 دقائق) مقارنة ب WT (الشكل 2C ، (د) والجدول 3). والمثير للدهشة أن المرحلة S لم تمتد كثيرا ، ولكن انخفض متوسط شدة إشارة EdU بنسبة 25٪ (الشكل 2C ، D) ، وهو ما يتوافق مع المرحلة S التي بدأت من أصول أقل. علاوة على ذلك ، في حين تم توزيع خلايا WT الإيجابية EdU بشكل متجانس بين المراحل المبكرة (S1) والمتأخرة S (S2) (الشكل 2C ، الشكل التكميلي S1A ، المراحل المبكرة [S1] والمتأخرة S [S2] المحددة بخط متقطع رأسي في البوابة العلوية) ، 65٪ من خلايا CDC6-1 الإيجابية EdU تراكمت في المرحلة S المتأخرة (الشكل 2D ، الشكل التكميلي S1B). لم يكن هناك تمييز واضح بين مجموعات S و G 2 + M (الشكل 2D) ، مما يشير إلى أن الخلايا كافحت لإكمال المرحلة S قبل دخول مرحلة G2. لذلك ، هذه الطريقة مناسبة وحساسة لتحديد الطفرات ذات العيوب في المرحلة S (المدة و / أو التوزيع) وفي مدة مرحلة دورة الخلية.

تم ابتكار طريقة تكميلية لتحديد متى تبدأ الخلايا وتنتهي من تكرار الحمض النووي وتقدير مدة المرحلة S باستخدام الخلايا المتزامنة (خطوة البروتوكول 1.2). تحقيقا لهذه الغاية ، باستخدام عامل α مع الخلايا المتزامنة في G1 ، تم إطلاق الخلايا في وسط SC وتم جمعها كل 5 دقائق. قد تكون مدة المرحلة S حوالي 25 دقيقة بناء على الوقت الذي تغير فيه محتوى الحمض النووي من 1C إلى 2C على ملف تعريف مقياس التدفق الخلوي Sytox Green (الشكل 3A). ومع ذلك ، يعتمد هذا التقدير على الوقت الذي يدمج فيه جزء كبير من الخلايا ما يكفي من Sytox Green ليتم رؤيته في ملف تعريف FACS. لا يمكن الكشف عن أحداث النسخ المتماثل المبكر والمتأخر باستخدام هذا الأسلوب. لتحديد بدقة متى تبدأ المرحلة S وتنتهي ومدة استمرارها ، تم تمييز خلايا الطور S من حصص الخلايا عند وضع العلامات النبضية باستخدام EdU (10 ميكرومتر) لمدة 5 دقائق كل 5 دقائق بعد إطلاق G1. كما هو متوقع ، خلال أول 10 دقائق بعد الإطلاق ، كانت جميع الخلايا في المنطقة السفلية اليسرى (أي في G1 ، الشكل 3B ، الشكل التكميلي S2). بعد خمسة عشر دقيقة من الإطلاق ، تم بالفعل اكتشاف جزء صغير من الخلايا الإيجابية ل EdU (قارن الصفين الأولين في الشكل التكميلي S2 والشكل التكميلي S3 ، الخلايا المعالجة ب EdU والخلايا الخالية من EdU ، على التوالي) ، مما يشير إلى أن المرحلة S قد بدأت (الشكل 3C). شوهد التقدم خلال المرحلة S بواسطة سحابة الخلية تتحرك أولا لأعلى ثم إلى اليمين في الرسم البياني PI-EdU ثنائي المتغير (الشكل 3D-F). أخيرا ، بعد 35 دقيقة من الإطلاق ، كان جزء من الخلايا سلبيا ل EdU ولكن مع ضعف كمية الحمض النووي ، مما يشير إلى أن تلك الخلايا قد أكملت المرحلة S وكانت في المرحلة G2 + M (الشكل 3G). وبالتالي ، تستمر المرحلة S لمدة 20 دقيقة في هذه الظروف. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من التزامن العالي الذي لوحظ مع تراكب محتوى الحمض النووي المكتشف باستخدام Sytox Green ، مما يشير إلى أن المرحلة S قد انتهت في جميع السكان بعد 40 دقيقة من الإطلاق ، أظهرت التحليلات ثنائية المتغير أن بعض الخلايا أنهت المرحلة S بعد 60 دقيقة من الإطلاق وأن المرحلة S كانت كاملة لجميع السكان بعد 65 دقيقة من الإطلاق (الشكل 3H ، I والشكل التكميلي S2).

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن مراقبة المرحلة S وتوليف الحمض النووي عن طريق الفحص المجهري. من كل أصل تكرار نشط ، يتم تنفيذ تخليق الحمض النووي بواسطة ردين مربوطين ، مما يشكل تركيزا للتكرار النووي يمكن أن يتبعه الفحص المجهري عن طريق تصوير نسخة موسومة من عامل النسخ المتماثل و / أو مجموعة المشغلين ومثبطها المقابل المنصهر في بروتين الفلورسنت 2,13. بدلا من ذلك ، يمكن الكشف عن تخليق الحمض النووي عن طريق الفحص المجهري باستخدام نظائرها ثيميدين14,15. استخدمنا EdU لمراقبة مناطق الحمض النووي دون النووية التي تخضع لتخليق الحمض النووي. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتسمية خلايا WT و cdc6-1 غير المتزامنة بالنبض باستخدام EdU (10 ميكرومتر) لمدة 3 دقائق عند 28 درجة مئوية وتصويرها بعد تفاعل النقر. كنا نتوقع اكتشاف الاختلافات في شدة إشارة EdU اعتمادا على معدل تخليق الحمض النووي وعلى تقدم الخلية في دورة الخلية خلال نبضة EdU لمدة 3 دقائق (أي أن الخلايا التي تقضي 3 دقائق كاملة في المرحلة S ستعرض إشارة أقوى من تلك التي تدخل أو تخرج من المرحلة S أثناء النبضة). وفقا لذلك ، أظهرت خلايا WT S-phase إشارة EdU في نواتها التي تباينت في شدتها (الشكل 4 أ). يمكن استقراء مدة المرحلة S بسهولة من هذا التحليل. في الواقع ، تم تحديد من مكررين بيولوجيين (تم حساب 150 خلية على الأقل) ، أن 34٪ ± 3٪ و 38٪ ± 3٪ من خلايا WT و cdc6-1 كانت إيجابية EdU ، على التوالي. كما هو الحال في ظروف النمو هذه ، كان وقت المضاعفة 90 دقيقة و 123 دقيقة لخلايا WT و cdc6-1 ، على التوالي (الجدول 2) ، استقرأنا أن المرحلة S استمرت 31 دقيقة و 47 دقيقة على التوالي. تتماشى النتيجة الأولى مع تلك التي تم الحصول عليها من تحليلات FACS (الجدول 3) ، مما يشير إلى أن اكتشاف الخلايا الإيجابية EdU بواسطة الفحص المجهري يسمح بتحديد مدة المرحلة S. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الأخير أعلى من مدة المرحلة S المستنبطة من تحليلات نظام مراقبة الأصول الميدانية (FACS) لأنه لم يكن هناك تمييز واضح بين مجموعات S و G2 + M (الشكل 2D). لوحظت بؤر EdU بسهولة في خلايا WT (الشكل 4B) ولكنها كانت باهتة وأقل في خلايا cdc6-1 (الشكل 4C). لاستبعاد احتمال أن يعتمد فرق شدة إشارة EdU بين خلايا WT و cdc6-1 على خطوة المرحلة S ، تم تحديد الكثافة من الخلايا المتزامنة. كما هو متوقع ، كان متوسط شدة إشارة EdU أقل بثلاثة أضعاف في خلايا cdc6-1 (الشكل 4D) ، بما يتفق مع تكرار الحمض النووي الذي بدأ من أصول نسخ متماثل أقل. اقتصرت إشارة EdU على النواة ، وتتمركز مع إشارة DAPI قوية ، وتم تنظيمها في أنماط كروية ، بما يتفق مع تنظيم تكرار الحمض النووي في المناطق النووية أو مصانع النسخ المتماثل. الأهم من ذلك ، تم اكتشاف EdU فقط في الخلايا غير البراعم أو صغيرة البراعم ولم يكن موجودا أبدا في الخلايا ذات البراعم الكبيرة ، مما يشير إلى أن خلايا خميرة WT قد انتهت من التكاثر بحلول الوقت الذي دخلت فيه الانقسام الميتوزي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة حساسة لتصور تكرار الحمض النووي بدقة مكانية عالية ، وكذلك للكشف عن عيوب تكرار الحمض النووي الخفيفة وقياسها.

Figure 1
الشكل 1: تحليلات FACS التمثيلية. (أ) تحليلات Sytox Green FACS التمثيلية لخلايا WT التي نمت عند 25 درجة مئوية. (B,C) تحليلات EdU-PI ثنائية المتغير FACS التمثيلية لخلايا WT التي نمت عند 25 درجة مئوية وموسومة بالنبض لمدة 5 دقائق باستخدام EdU (10 ميكرومتر) أو 1 ميكرولتر من DMSO. كانت المضلعات هي نفسها في كلا التحليلين. تم استخدام C لتحديد سلبي EdU من الخلايا الإيجابية EdU (بشكل عام ، يتم تعيين الحد عند كثافة >1× 10 4-2 × 104). حددت بوابة المضلع العلوية الخلايا الإيجابية EdU (جزء الطور S). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: جزء من الخلايا في مراحل دورة الخلية G 1 و S و G2 + M في مجموعات الخلايا غير المتزامنة. (أ) رصدت سلالات WT و CDC6-1 عند تخفيفات متسلسلة بخمسة أضعاف على وسط غني ونمت إما عند 25 درجة مئوية أو 28 درجة مئوية أو 34 درجة مئوية. (ب) وقت مضاعفة عدد السكان. نمت خلايا WT و cdc6-1 غير المتزامنة عند 25 درجة مئوية أو 28 درجة مئوية ، وتم قياس تركيز الخلية كل ساعة لمدة 7 ساعات. (C ، D) تحليل EdU-PI ثنائي المتغير FACS لخلايا WT و cdc6-1 نمت عند 28 درجة مئوية ونبضة لمدة 5 دقائق مع EdU (10 ميكرومتر). بضرب وقت مضاعفة السكان في كسر الطور S ، يوفر مدة المرحلة S. تم حساب متوسط شدة الخلايا الإيجابية EdU والخلايا السالبة EdU كمتوسط لشدة كل قيمة في المضلع المقابل. تم تطبيع متوسط شدة الخلايا السلبية WT و cdc6-1 EdU (5,077 و 4,454 على التوالي) إلى 1. تم تقسيم متوسط شدة الخلايا الإيجابية WT و cdc6-1 EdU (52,604 و 36,141 على التوالي) على عامل التطبيع المستخدم لكل سلالة. كانت القيم التي تم الحصول عليها 10.4 و 8.1 ، على التوالي (أي انخفاض بنسبة 25 ٪ ، كما هو مذكور في النص). الاختصارات: WT = النوع البري ؛ EdU = 5-إيثينيل-2'-ديوكسييوريدين; FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق ؛ PI = يوديد البروبيديوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تحديد مدة المرحلة S على الخلايا المتزامنة. (أ) تحليل الدورة الزمنية لمحتوى الحمض النووي لخلايا WT بعد إطلاق عامل α عند 28 درجة مئوية. يأخذ الوقت المشار إليه في الاعتبار مدة نبض EdU (5 دقائق). (ب - ط) تحليلات EdU-PI ثنائية المتغير FACS لخلايا WT المتزامنة الموسومة بالنبض لمدة 5 دقائق مع EdU (10 ميكرومتر) ويتم جمعها في الأوقات المحددة بعد الإفراج عن اعتقال G1. الاختصارات: WT = النوع البري ؛ EdU = 5-إيثينيل-2'-ديوكسييوريدين; FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق ؛ PI = يوديد البروبيديوم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: الكشف عن EdU والقياس الكمي بواسطة الفحص المجهري. تمت زراعة سلالات WT و cdc6-1 غير المتزامنة لمدة 2 ساعة عند 28 درجة مئوية ، ثم تم وضع علامة النبض لمدة 3 دقائق باستخدام EdU (10 μM) وتم تصويرها بواسطة الفحص المجهري واسع المجال باستخدام مرشحات الإثارة / الانبعاث الكافية. (أ) صور تمثيلية من الفحص المجهري واسع المجال ل WT والخلايا الفردية (B ، C) ل WT و cdc6-1 التي تصورها DIC وملطخة ب DAPI أو ل EdU ، كما هو موضح. أشرطة المقياس في (A) و (B ، C) هي 10 μm و 2 μm ، على التوالي. (د) قياسات كثافة EdU على خلايا WT و cdc6-1 المتزامنة التي نمت عند 28 درجة مئوية بعد 30 دقيقة من إطلاق القبض على G1 . يمثل الرسم البياني تجميع ثلاث نسخ بيولوجية مكررة (تم حساب 50 خلية على الأقل في كل نسخة بيولوجية). متوسط ± يتم عرض SD على الرسم البياني. يشار إلى اختبار t ثنائي الطرف غير المزاوج بين خلايا WT و cdc6-1 بواسطة **** (p < 0.0001). الاختصارات: WT = النوع البري ؛ EdU = 5-إيثينيل-2'-ديوكسييوريدين; DIC = تباين التداخل التفاضلي ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول ؛ A.U. = وحدات تعسفية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اسم الجيني الأشكال والجداول
WT (E3087): MATa ، ade2-1 ، trp1-1 ، can1-100 ، leu2-3,112 ، his3-11,15 ، RAD5 ، ura3::URA3 / GPD-TK (5x) ، AUR1c :: ADH-hENT1 الشكل 1 ، الشكل 2 أ ، ب ، ج ، الشكل 3 ، الشكل 4 أ ، ب ، د ، الملحق الشكل 1،2،3 الجداول 2،3
CDC6-1 (E5956): MATa ، ade2-1 ، trp1-1 ، can1-100 ، leu2-3,112 ، his3-11,15 ، cdc6-1 ، RAD5 ، ura3::URA3 / GPD-TK (5x) ، AUR1c :: ADH-hENT1 الشكل 2 أ ، ب ، د ، الشكل 4 ج ، د ، الملحق الشكل 1 ، الجداول 2,3
TK+ (E1000): MATa ، ade2-1 ، trp1-1 ، can1-100 ، leu2-3,112 ، his3-11,15 ، RAD5 ، ura3::URA3 / GPD-TK (7x) ملحق الشكل 4
TK+ hENT+ (E2031): MATa ، ade2-1 ، trp1-1 ، can1-100 ، leu2-3,112 ، his3-11,15 ، RAD5 ، ura3::URA3 / GPD-TK (7x) ، AUR1c :: ADH-hENT1 ملحق الشكل 4
hENT+ (E2031): MATa ، ade2-1 ، trp1-1 ، can1-100 ، leu2-3,112 ، his3-11,15 ، RAD5 ، AUR1c :: ADH-hENT1 ، RAD52-GFP ، URA3::mCherry-TUB1 ملحق الشكل 4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa ، ade2-1 ، trp1-1 ، can1-100 ، leu2-3,112 ، his3-11,15 ، cdc6-1 ، RAD5 ، ura3::URA3 / GPD-TK (7x) ، AUR1c :: ADH-hENT1 ملحق الشكل 4
W303-1A (E001): ماتا ، ade2-1 ، trp1-1 ، can1-100 ، leu2-3,112 ، his3-11,15 ، RAD5 ، ura3-1 ملحق الشكل 4

الجدول 1: قائمة السلالات المستخدمة في هذه الدراسة.

بالوزن CDC6-1
25 درجة مئوية 28 درجة مئوية 25 درجة مئوية 28 درجة مئوية
مضاعفة الوقت (دقيقة) 120 90 118 123
إس دي ± 13 دقيقة ± 3 دقائق ± 10 دقائق ± 6 دقائق

الجدول 2: متوسط أوقات مضاعفة سلالات WT و cdc6-1 نمت عند 25 درجة مئوية و 28 درجة مئوية. تم حساب أوقات المضاعفة من ثلاث مكررات بيولوجية (أربع نسخ تقنية لكل مكرر بيولوجي) باستخدام الصيغة التالية: Δt × ln (2) / ln (CF / Ci) ، حيث يتوافق Cf و Ci مع تركيزات الخلية النهائية والأولية ، على التوالي ، و Δt يتوافق مع الفرق بالدقائق بين tf و ti ، عندما تم قياس Cf و Ci ، على التوالي.

بالوزن CDC6-1
25 درجة مئوية 28 درجة مئوية 25 درجة مئوية 28 درجة مئوية
المائه مدة
(دقيقة)		 المائه مدة
(دقيقة)		 المائه مدة
(دقيقة)		 المائه مدة
(دقيقة)
ز1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2 + M 44 53 50 45 59 71 62 77
إس دي جي1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
إس دي إس ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
إس دي جي٢ + م ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

الجدول 3: متوسط كسور الخلايا ومدة مراحل G 1 و S و G2 + M في خلايا WT و cdc6-1 التي نمت عند 25 درجة مئوية و 28 درجة مئوية. تم تحديد كسور الخلايا من ثلاث نسخ بيولوجية مكررة (مكررتان تقنيتان لكل مكرر بيولوجي). كانت الاختلافات في مدة G 1 و S و G2 + M بين خلايا WT و cdc6-1 التي نمت عند 28 درجة مئوية ذات دلالة إحصائية (اختبار t ثنائي الذيل غير المزاوج ، p <0.1).

الشكل التكميلي S1: جزء من الخلايا في المراحل S المبكرة والمتأخرة في خلايا WT و cdc6-1 نمت عند 28 درجة مئوية. تم رسم مضلعين متطابقين اسمهما S1 و S2 للمرحلتين S المبكرة والمتأخرة ، على التوالي ، في جزء من الخلايا الإيجابية EdU لتقسيمها إلى نصفين في تحليلات EdU-PI ثنائية المتغير FACS ل (A) خلايا WT نمت عند 28 درجة مئوية و (B) خلايا cdc6-1 نمت عند 28 درجة مئوية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: تقدم دورة الخلية للخلايا الموسومة بنبض EdU بعد إطلاقها من اعتقال G1 المرئي بواسطة FACS ثنائي المتغير EdU-PI . تم وضع علامة النبض على حصص الخلايا لمدة 5 دقائق مع 10 ميكرومتر EdU كل 5 دقائق بعد إطلاقها من اعتقال عامل α عند 28 درجة مئوية وحتى 80 دقيقة ، كما هو موضح. الاختصارات: EdU = 5-إيثينيل-2'-ديوكسييوريدين. FACS = فرز الخلايا المنشط بالتألق ؛ PI = يوديد البروبيديوم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: تطور دورة الخلية للخلايا المعالجة ب DMSO بعد إطلاقها من اعتقال G1 الذي تصوره EdU-PI ثنائي المتغير FACS. هذا هو نفس الشكل التكميلي 2 ، ولكن تم تحضين الخلايا لمدة 5 دقائق مع 1 ميكرولتر DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S4: سمية BrdU و EdU في خلايا الخميرة TK hENT1. تم رصد خلايا النمط الجيني المشار إليه في تخفيفات متسلسلة من خمسة أضعاف على ألواح YPD تحتوي على تركيزات متزايدة من BrdU أو EdU ونمت لمدة 40 ساعة عند 30 درجة مئوية. الاختصارات: DMSO = ثنائي ميثيل سلفوكسيد ؛ BrdU = برومودوكسييوريدين. Edu = 5-إيثينيل-2'-ديوكسييوريدين. TK = ثيميدين كيناز ؛ hENT1 = ناقل نيوكليوزيد التوازن البشري. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخميرة هي كائن نموذجي رئيسي لدراسات دورة الخلية ، ومع ذلك فإن توصيف طورها S قد أعاق منذ فترة طويلة بسبب عدم قدرتها على دمج النيوكليوسيدات الخارجية ، مثل BrdU ، والتي تستخدم كمتتبعات لتكرار الحمض النووي. إن تجهيز الخميرة بتعبير عال عن الهربس البسيط ثيميدين كيناز (TK) وإضافة ناقل نيوكليوزيد بشري (hENT) قد حل هذه المشكلة إلى حد كبير15,16. EdU أكثر تنوعا من BrdU حيث أن اكتشافه باستخدام أزيد الفلورسنت الصغير وكيمياء النقر قابل للاختراق لخلايا الخميرة وتحليل FACS ، على عكس الأجسام المضادة المضادة ل BrdU17. هنا ، قمنا بتحسين ظروف وضع العلامات والكشف عن EdU في سلالة TK-hENT1 هذه وأظهرنا أنه يمكن قياس عيوب النسخ المتماثل غير المكتشفة سابقا باستخدام هذا البروتوكول بواسطة FACS أو الفحص المجهري.

تعد دراسة آلية بيولوجية باستخدام أدوات قد تتداخل مع نفس الآلية مشكلة شائعة في علم الأحياء. نظرا لأن EdU له تأثير سام للخلايا معروف ، فقد بحثنا عن تركيزات EdU غير السامة في التعرض المزمن لسلالة TK-hENT1 المهندسة ووجدنا أن 10 ميكرومتر هي جرعة مناسبة. تفشل خلايا TK-hENT1 في التكاثر عند 25 ميكرومتر EdU ، في حين أن خلايا TK-alone أو hENT1 وحدها تتحمل بسهولة 100 ميكرومتر EdU (الشكل التكميلي S4). على الرغم من أن خلايا الخميرة أكثر حساسية ل EdU من BrdU ، فقد وجدنا أن الانتشار انخفض فقط بعد دورة الخلية الثانية بعد التعرض ل EdU ، مما يشير إلى أنه يجب دمجه على كلا الشريطين للتأثير على تكاثر الخلايا (البيانات غير معروضة). للبقاء في الجانب الآمن ، استخدمنا 10 μM EdU في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، مع نبضات قصيرة فقط (3 دقائق للفحص المجهري ؛ 5 دقائق ل FACS) ، ووجدنا أن هذا مناسب للكشف الجيد باستخدام هذا البروتوكول الأمثل.

قد يكون للعيوب الدقيقة في تكرار الحمض النووي تأثير قوي على إعادة ترتيب الكروموسوم4. لذلك ، فإن تطوير التقنيات والبروتوكولات القادرة على اكتشاف هذه العيوب الدقيقة هو المفتاح للكشف عن مسببات انحرافات الكروموسومات. هنا ، نظهر أن هذا البروتوكول الأمثل لدمج EdU والكشف عنه يمكن أن يقيس ما يصل إلى ثلاثة أضعاف في شدة الإشارة (الشكل 2 والشكل 4) ، مما يشير إلى أن معدل تخليق الحمض النووي ينخفض في خلايا cdc6-1 الحساسة لدرجة الحرارة التي تنمو عند 28 درجة مئوية ، والتي ، حتى الآن ، لا تظهر أي عيوب في مقايسات صلاحية اللوحة (الشكل 2 أ ). وبالتالي ، يمكن استخدام بروتوكول دمج EdU والقياس الكمي هذا لفحص الطفرات الأخرى التي لا يشتبه في عيوب النسخ المتماثل لها في البداية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من المفيد الكشف عن تخليق الحمض النووي الانقسامي (MiDAS) ، أو تخليق الحمض النووي المعتمد على إعادة التركيب الميوزي ، أو تخليق الحمض النووي طويل المسالك الأخرى.

أحد العيوب هو أنه يمكن إجراء اكتشاف EdU على الخلايا الثابتة فقط ، مما يحول دون التحليل المباشر كما هو الحال مع PCNA-GFP أو قراءات الفلورسنت الأخرى لتكرار الحمض النووي ، والتي تعاني من السمية الضوئية العالية لأشعة الليزر المستخدمة في التصوير. تعد زراعة الخلايا في وسط اصطناعي أمرا بالغ الأهمية للحصول على أفضل اكتشاف ، حيث يبدو أن بقايا YPD تطفئ تفاعل Click بشكل كبير. ومن المثير للاهتمام ، أن تحديد خلايا الطور S باستخدام تحليل EdU-PI FACS ثنائي المتغير على المجموعات السكانية المتزامنة يسمح بتقدير مدة المرحلة S إلى 20 دقيقة في الخلايا المفردة (الشكل 3 ، الشكل التكميلي S2 ، والشكل التكميلي S3). ومع ذلك ، حتى عندما يبدو التزامن بعد إطلاق العامل α شبه مثالي كما هو الحال في تحليل Sytox Green FACS الكلاسيكي (الشكل 3 أ) ، يصبح واضحا من تحليل EdU-PI FACS ثنائي المتغير أن الخلايا تدخل المرحلة S بشكل غير متزامن نسبيا (الشكل 3B-I).

هنا ، نصف ثلاث طرق لتحديد مدة الطور S باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري على الخلايا المتزامنة وغير المتزامنة على مستوى الخلية الواحدة والسكان. يتشابه متوسط فترات الطور S المحددة في خلايا WT غير المتزامنة على مستوى السكان باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري ، عند 29 دقيقة و 31 دقيقة على التوالي ، بينما يوضح نهجنا المتزامن القائم على خلية واحدة أن المدة يمكن أن تكون قصيرة مثل 20 دقيقة (الشكل 2 ، الشكل 3 ، الشكل 4 ، والجدول 3 ). التناقض بين هذه القيم مثير للدهشة ولكن يمكن تفسيره بسهولة. في الواقع ، من خلال نهجنا القائم على الخلية الواحدة ، تم تحديد مدة المرحلة S بناء على الأحداث الأولى (أي الخلايا الأولى التي تدخل وتخرج من المرحلة S ، الشكل 3C ، G) ، لكن هذا لا يعني أن المرحلة S تستمر 20 دقيقة في كل خلية داخل السكان. ستدعم هذه البيانات الفكرة غير المتوقعة بأن هناك مستوى معينا من عدم التجانس في مدة الطور S بين الخلايا.

يمكن للبروتوكولات المحسنة أو التقنيات الجديدة الإطاحة بالعقائد القديمة أو الأفكار الجديدة. هناك ثلاثة أن هذه البيانات التحدي. أولا ، يعتقد أن تخليق الحمض النووي يصاحب ظهور البراعم في S. cerevisiae. يوضح الشكل 4A-C أن تلطيخ EdU يكون أقوى في الخلايا غير البراعم والصغيرة البراعم ، على الرغم من تأخر وضع العلامات لمدة 3 دقائق ، مما يشير إلى أن المرحلة S تبدأ بوضوح قبل مهدها ، كما هو موضح سابقا16. ثانيا ، يقال أن خلايا الخميرة ليس لها طور G2 ، حيث تتشكل المغازل الانقسامية في نفس وقت تخليق الحمض النووي. تسمح النبضات القصيرة جدا جنبا إلى جنب مع الكشف الحساس عن EdU بواسطة FACS (الشكل 3 ، الشكل التكميلي S2 ، والشكل التكميلي S3) أو الفحص المجهري (الشكل 4) بتحديد متى تبدأ المرحلة S وتنتهي بدقة في خلايا مفردة. من خلال القيام بذلك ، وجدنا أن تخليق الحمض النووي السائب ينتهي بعد 40 دقيقة من إطلاق العامل α (الشكل 3 ، الشكل التكميلي S2 ، والشكل التكميلي S3) ، بينما تتشكل المغازل الانقسامية القصيرة بعد 20 دقيقة فقط بعد16 (البيانات غير معروضة). نستنتج أن خلايا الخميرة لها طور G2. ثالثا ، تم اقتراح مؤخرا أن ما يصل إلى 30 ٪ من خلايا الخميرة تكمل تخليق الحمض النووي في الطور التطوري18. باستخدام هذا البروتوكول الأمثل ، لم نكتشف دمج EdU في الخلايا التي تعرض مغزل الطور / الطور النهائي (البيانات غير معروضة) ، لكن لا يمكننا استبعاد أن هذه الموجة الثانية من تخليق الحمض النووي أقل من عتبة الكشف المستخدمة. نظرا لنسبة الإشارة / الضوضاء القوية ، فإننا نعتبر الخيار الأخير غير مرجح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يرغب المؤلفون في الاعتراف بالوكالة الوطنية للبحوث (ANR) وجمعية البحوث حول السرطان (ARC) للحصول على زمالات الدكتوراه إلى JD D.D.B.T. والوكالة الوطنية للبحوث (ANR) للحصول على الدعم المالي (منحة ANR-18-CE12-0018-01). تم إجراء القياس الخلوي والفحص المجهري في مرفق التصوير بالرنين المغناطيسي في مونبلييه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 188،
تحديد مدة المرحلة S باستخدام 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Inincorporated في <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter