Summary
للحث على التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي ، وهو نموذج حيواني للتصلب المتعدد ، يتم تحصين الفئران بمستحلب ماء في زيت يحتوي على مستضد ذاتي ومساعد فرويند كامل. في حين توجد عدة بروتوكولات لإعداد هذه المستحلبات ، يتم تقديم بروتوكول تجانس سريع وبسيط وموحد لإعداد المستحلب هنا.
Abstract
يشترك التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) في ميزات مناعية وسريرية مماثلة مع التصلب المتعدد (MS) ، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع كنموذج لتحديد أهداف دوائية جديدة لعلاج أفضل للمرضى. يتميز مرض التصلب العصبي المتعدد بعدة دورات مرضية مختلفة: التصلب العصبي المتعدد الانتكاسي (RRMS) ، والتصلب المتعدد التقدمي الأولي (PPMS) ، والتصلب المتعدد التدريجي الثانوي (SPMS) ، وشكل نادر من الانتكاس التدريجي (PRMS). على الرغم من أن النماذج الحيوانية لا تحاكي بدقة كل هذه الأنماط الظاهرية المتناقضة للأمراض البشرية ، إلا أن هناك نماذج EAE تعكس بعض المظاهر السريرية المختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد. على سبيل المثال ، يحاكي البروتين السكري قليل التغصن الميالين (MOG) الذي يسببه EAE في الفئران C57BL / 6J PPMS البشري ، بينما يشبه بروتين المايلين البروتيني (PLP) الذي يسببه EAE في الفئران SJL / J RRMS. كما تستخدم المستضدات الذاتية الأخرى ، مثل بروتين المايلين الأساسي (MBP) ، وعدد من سلالات الفئران المختلفة لدراسة EAE. للحث على المرض في نماذج EAE للتحصين الذاتي ، يتم تحضير مستحلب الماء في الزيت وحقنه تحت الجلد. تتطلب غالبية نماذج EAE أيضا حقن سم السعال الديكي حتى يتطور المرض. من أجل تحريض EAE المتسق والقابل للتكرار ، من الضروري وجود بروتوكول مفصل لإعداد الكواشف لإنتاج مستحلب مستضد / مساعد. تستفيد الطريقة الموضحة هنا من طريقة موحدة لتوليد مستحلبات الماء في الزيت. إنه بسيط وسريع ويستخدم مجانس اهتزاز بدلا من المحاقن لإعداد مستحلبات يتم التحكم في جودتها.
Introduction
يمكن أن يؤدي انهيار التسامح المناعي إلى توليد اضطرابات المناعة الذاتية ، مثل التصلب المتعدد (MS). تشير التقديرات إلى أن 2.8 مليون شخص يعيشون مع مرض التصلب العصبي المتعدد في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من أن السبب الدقيق لمرض التصلب العصبي المتعدد لا يزال غير معروف إلى حد كبير ، إلا أن عدم تنظيم الخلايا التائية والبائية ذاتية التفاعل ، بالإضافة إلى العيوب في وظيفة Treg ، تلعب أدوارا مهمة في التسبب في المرض 2,3.
النماذج الحيوانية لأمراض المناعة الذاتية هي أدوات أساسية للتحقيق في الطرائق العلاجية المحتملة. تم استخدام نموذج التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) منذ ما يقرب من قرن من قبل الباحثين المهتمين ب MS4. في التجارب المبكرة ، كان معدل الإصابة بالمرض منخفضا نسبيا. مكن إدخال مساعد فرويند الكامل (CFA) ، الذي يحتوي على المتفطرة وسم السعال الديكي ، من الحث المستمر ل EAE في الفئران4. الأهم من ذلك ، من الضروري خلط CFA مع مستضد خاص بالجهاز العصبي المركزي (CNS) لتوليد مستحلب متجانس من الماء في الزيت لتحفيز EAE. تعتمد نماذج EAE الأكثر شيوعا المتاحة حاليا على التحصين النشط للفئران بالببتيدات الدماغية. تلعب الخلفية الوراثية للفئران دورا مهما في القابلية للإصابة بالأمراض ، مع بروتين سكري المايلين قليل التغصن (MOG35-55) وبروتين المايلين البروتيني (PLP139-151) الببتيدات المستخدمة للحث على EAE في الفئران C57BL / 6J و SJL ، على التوالي5. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام سلالات الفئران الأخرى والببتيدات المشتقة من الجهاز العصبي المركزي.
تعد جودة مستحلب CFA / الببتيد عاملا حاسما يحدد اختراق المرض في نموذج EAEللتحصين النشط 6. يجب تحضير مستحلب متجانس من الماء في الزيت عن طريق خلط الببتيدات الدماغية المذابة في محلول مائي مع CFA ، وإلا فلن تصاب الحيوانات بالمرض. تم نشر العديد من البروتوكولات حول تحضير مستحلبات CFA / الببتيد. ومن الأمثلة على ذلك استخدام دوامة7 ، صوتنة8 ، محاقن وموصل Tثلاثي الاتجاهات 9 ، أو حقنة واحدة فقط5. ومع ذلك ، يصعب توحيد كل هذه الطرق وغالبا ما ترتبط ببروتوكولات طويلة ومعقدة.
بالمقارنة مع جميع الطرق المذكورة أعلاه ، فإن الطريقة البسيطة الموضحة هنا لإعداد المستحلب توفر مزايا عدم وجود اختلافات من شخص لآخر وكونها سريعة نسبيا. يتم إنشاء المستحلب بواسطة خالط يهز الكواشف بسرعة ووقت ودرجة حرارة محددة ، مما يضمن نتائج سريعة ومتسقة. بالإضافة إلى تحريض المرض في نموذج EAE ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لدراسة نماذج أمراض المناعة الذاتية الأخرى مثل التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين (CIA) والتهاب المفاصل الناجم عن المستضد (AIA)6. لذلك ، من المتوقع أن يتم استخدام هذه الطريقة للحث باستمرار على المرض في النماذج الحيوانية الأخرى التي تعتمد على مستحلبات الماء في الزيت مع المستضدات الذاتية ، مثل التهاب العصب المناعي الذاتي التجريبي (EAN)10 ، والتهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي التجريبي (EAT)11 ، والتهاب القزحية المناعي الذاتي (EAU)12 ، والوهن العضلي الوبيل (MG)13. تحفز هذه الطريقة أيضا استجابات مناعية عامة مثل فرط الحساسية من النوع المتأخر (DTH) باستمرار6 ، وبالتالي يمكن استخدامها لتوصيل لقاحات السرطان والملاريا (انظر المناقشة).
وبالتالي ، تم تطوير طريقة سريعة (إجمالي وقت التحضير ~ 30 دقيقة) ، بسيطة (يمكن تحضير جميع الكواشف مسبقا وتخزينها) ، وموحدة (يتم إنجاز المستحلب باستخدام خالط الاهتزاز) ويتم تقديمها هنا. مستحلبات CFA / المستضد المحضرة باستخدام هذا البروتوكول تحفز باستمرار المرض في نماذج المناعة الذاتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لممارسات المجلس السويدي للبحوث الحيوانية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان ، لوند مالمو ، السويد (رقم التصريح: M126-16).
ملاحظة: يتم وصف التدفق التخطيطي للطريقة في الشكل 1.
1. إعداد المواد
ملاحظة: تحضير جميع الكواشف معقمة في غطاء معقم ، والقسمة وتخزينها في درجة الحرارة المشار إليها. يمكن تخزين الكواشف لمدة تصل إلى 2 سنوات دون أن تفقد تأثيرها.
- تحضير CFA يحتوي على 20 ملغ / مل المتفطرة السلية كما هو موضح أدناه.
- أضف 100 ملغ من M. tuberculosis H37RA المجفف بالتجميد (انظر جدول المواد) وخمس خرزات فولاذية 3.2 مم إلى أنبوب سعة 7 مل (انظر جدول المواد). رج الأنبوب في الخالط (انظر جدول المواد) لمدة 60 ثانية بأعلى إعداد للسرعة (5000 دورة في الدقيقة).
- أضف 5 مل من مساعد فرويند غير المكتمل (IFA) إلى الأنبوب ورجه مرة أخرى لمدة 60 ثانية بأعلى سرعة. انقل ملاط المتفطرة السلية المتجانسة في IFA (المسمى الآن CFA) إلى أنبوب جديد به ماصة ، تاركا الخرز خلفه ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
- أضف الماء عالي النقاء إلى المسحوق المجفف بالتجميد من ببتيد MOG35-55 (انظر جدول المواد) للحصول على تركيز ببتيد نهائي يبلغ 10 مجم / مل. تعقيم الحل عن طريق تمريره من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر. تحضير 60 ميكرولتر من القسمة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
ملاحظة: الببتيد MOG35-55 المستخدم في هذه التجربة هو من نقاء ImmunoGrade (~ 70٪) ، وهو مشقوق TFA ، ويذوب بسهولة في الماء ، ويحتوي على أميد C-terminal (-NH2) لزيادة استقرار الجسم الحي 14. لم يتم إذابة حصص الببتيد وإعادة تجميدها أكثر من مرتين ، وتم تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. - تحضير 100 مل من المخزن المؤقت لسموم السعال الديكي: قم بإذابة 2.9 جم من كلوريد الصوديوم في 80 مل من 1x Ca2 + / Mg2+ PBS المجاني وأضف 100 ميكرولتر من 10٪ Triton X-100. اضبط مستوى الصوت على 100 مل باستخدام PBS وقم بتعقيم المحلول عن طريق تمريره عبر مرشح 0.2 ميكرومتر. تحضير 10 مل من القسمة وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
2. إعداد مستحلبات CFA / الببتيد
- حساب كمية المستحلب اللازمة للتحصين. في هذا البروتوكول القياسي ، يتلقى كل فأر 50 ميكروغرام من الببتيد MOG35-55 و 300 ميكروغرام من M. السل المنتشر في مساعد فرويند (CFA). يمكن حساب كمية كل كاشف (MOG35-55 الببتيد ، PBS ، CFA ، و IFA) المطلوبة لإعداد المستحلبات باستخدام الملف التكميلي 1. يتم تضمين 20 ٪ إضافية من جميع الكواشف ، للتعويض عن فقدان صغير من المستحلب ، في الحساب.
ملاحظة: تتكون مجموعة المستحلب التجاري (انظر جدول المواد) المستخدمة في هذه الدراسة من أنبوب وغطاء لولبي ومكبس في كيس معقم. يحتوي كل أنبوب من مجموعة المستحلب على 9.6 مل كحد أقصى ، مما يجعل من الممكن تحضير محاقن 8 × 1 مل كافية لتحصين 40 فأرا (أو 80 فأرا في حالة استخدام 100 ميكرولتر من المستحلب لكل). - ضع الأنبوب اللولبي المغطى (من مجموعة المستحلب التجاري) والكواشف لاستخدامها على الجليد.
- أضف مكونات المستحلب بالترتيب التالي في وحدات التخزين المحسوبة في الخطوة 2.1: PBS ، ثم الببتيد ، ثم M. السل في CFA ، وأخيرا IFA.
- أغلق الأنبوب بالغطاء بإحكام عن طريق شده وتخفيفه عدة مرات. هز الأنبوب بقوة لمدة 5-10 ثوان باليد لخلط الكواشف مسبقا.
- ضع الأنبوب في الخالط المهتز وقم بتثبيته بالقضيب. اضبط السرعة على أعلى إعداد والوقت على 60 ثانية. بمجرد الانتهاء من الجري ، ضع الأنبوب على الثلج لمدة 3 دقائق. كرر التشغيل مرة أو مرتين بنفس الإعدادات.
- الطرد المركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة الهواء المحبوس وضغط المستحلب.
- قم بإزالة الغطاء من الأنبوب ، وأدخل المكبس في الأنبوب ، وادفعه لأسفل ببطء حتى يصل إلى قمة المستحلب. قم بإزالة الإغلاق المفاجئ في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق لفه.
- قم بإزالة المكبس من حقنة الحقن (1 مل ؛ انظر جدول المواد). أضف إبرة (يفضل 25-27 جم) إلى حقنة الحقن.
- قم بتوصيل الطرف الخلفي لحقنة الحقن بالقفل المخصص في الجزء السفلي من الأنبوب وقفله بلف قصير.
- انقل المستحلب من الأنبوب إلى حقنة الحقن عن طريق دفع المكبس برفق. توقف عندما يصل المستحلب إلى تخريج 0.15 مل من حقنة الحقن.
- افصل حقنة الحقن عن الأنبوب وأدخل المكبس بعناية ، مع الحرص على عدم دخول الهواء إلى المحقنة. ادفع المكبس حتى يخرج المستحلب من الإبرة.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام بعض المستحلب لمراقبة الجودة (انظر الخطوة 3). - كرر الخطوات 2.8-2.11 لبقية المستحلب الموجود في الأنبوب.
ملاحظة: لتقليل إهدار مستحلبات CFA / المستضد باهظة الثمن ، يجب استخدام محاقن سعة 1 مل. يمكن استخدام محاقن أخرى تناسب القفل المخصص في أسفل الأنبوب ؛ ومع ذلك ، قد يلزم تحضير كمية أكبر من المستحلب. يمكن تخزين مستحلب الببتيد CFA / MOG35-55 في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 أسبوعا دون أن يفقد قدرته على تحفيز EAE.
3. مراقبة جودة المستحلب
- اختبار السقوط: أضف قطرة صغيرة من المستحلب إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل مملوء ب 20 مل من الماء البارد. أغلق الأنبوب ورجه باليد لبضع ثوان. يؤكد ظهور قطرات صغيرة مميزة تكوين مستحلب الماء في الزيت.
- افحص المستحلب باستخدام مجهر تباين الطور.
- لتحليل حجم جزيئات الماء في الزيت ، أضف قطرة صغيرة (2-3 ميكرولتر) من المستحلب إلى شريحة مجهرية ، وقم بتلطيخها بزلة غطاء ، ثم ادفع بقوة في حركة دائرية لتسطيح المستحلب.
- افحص المستحلب الملطخ تحت مجهر تباين الطور (انظر جدول المواد) بتكبير 400x وركز على حقل به طبقة أحادية من المستحلب. تأكد من ظهور جزيئات رمادية / بيضاء موحدة صغيرة (الشكل 2 أ).
- تحليل حجم جسيمات المستحلب باستخدام حيود الليزر.
ملاحظة: يقيس حيود الليزر توزيعات حجم الجسيمات باستخدام شعاع الليزر. هذا هو اختبار مراقبة الجودة النهائي للمستحلبات. تظهر في الشكل 2B نتيجة تمثيلية لتوزيعات حجم الجسيمات باستخدام الطريقة الموضحة هنا (للحصول على وصف مفصل ، انظر Topping et al.6). ومع ذلك ، فإن اختبار السقوط وفحص المجهر كافيان للتحقق مما إذا كان قد تم تشكيل مستحلب مرض.- اضبط مؤشرات الانكسار لكل من الليزر الأحمر والأزرق للمشتت (انظر جدول المواد) على 1.456 وللعينة على 1.33 على محلل حجم الجسيمات (انظر جدول المواد). اضبط امتصاص معامل الانكسار على 0.02.
- أضف قطرة واحدة من المحقنة التي تحتوي على مستحلب الببتيد إلى وحدة التشتت التي تحتوي على زيت معدني خفيف. ابدأ الحصول على البيانات على الفور بعد تشتت المستحلب.
ملاحظة: تم تطبيق نموذج للأغراض العامة، وافترضت جسيمات كروية، لتقدير توزيع حجم الجسيمات.
4. تحريض EAE باستخدام مستحلب الببتيد MOG 35-55 في الفئران C57BL6 / J
ملاحظة: في جميع التجارب ، تم استخدام خمس فئران C57BL6 / J تبلغ من العمر 8-12 أسبوعا.
- قبل التحصين ، قم بتخدير الفئران باستخدام 2.5٪ إيزوفلوران متبخر وتأكد باستخدام قرصة إصبع قدم ثابتة.
- حقن كل فأر تحت الجلد باستخدام محاقن 1 مل في موقعين مختلفين ، على الجانبين الأيمن والأيسر من الجناح الخلفي مع 200 ميكرولتر من المستحلب الذي يحتوي على 50 ميكروغرام من الببتيد MOG35-55 بنسبة 1: 1 (v / v) من الببتيد / CFA.
- بعد 1.5 ساعة على الأقل من التحصين بالمستحلب ، ثم مرة أخرى بعد 24 ساعة ، قم بإدارة ما مجموعه 80 نانوغرام من توكسين السعال الديكي Bordetella في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لسموم السعال الديكي لكل فأر ، من خلال الحقن داخل الصفاق (100 ميكرولتر على اليسار و 100 ميكرولتر على الموقع الأيمن من البطن).
ملاحظة: ثبت أن التوطين الدقيق للحقن داخل الصفاق مع توكسين السعال الديكي ضروري لتنشيط الخلايا التائية في العقدة الليمفاويةالمستنزفة 15. - اختياري: حقن الببتيد MOG35-55 مرة أخرى في اليوم السابع (كما هو مستخدم في بعض البروتوكولات16) عن طريق تكرار الخطوة 4.2.
ملاحظة: الأهم من ذلك ، تأكد من أن المحاقن والإبر المستخدمة في التحصين التي تحتوي على MOG / CFA أو سم السعال الديكي يتم التخلص منها بشكل كاف في أكياس / حاويات الخطر البيولوجي. - قم بتقييم النتيجة السريرية يوميا ، باستخدام مقياس من 0-6 كما هو موضح سابقا6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 البروتوكول السريع والبسيط والموحد لإعداد مستحلبات CFA / MOG. تم وصف هذه الطريقة مؤخرا في مكان آخر6. يمكن أيضا تحضير مستحلبات CFA / MOG بطرق أخرى ، مثل طريقة المحاقن التقليدية أو عن طريق الدوامة. تمت مقارنة هذه الطرق هنا من خلال تقييم جودة المستحلبات. أنتجت جميع الطرق مستحلبات الماء في الزيت. تم تقييم تجانس وجودة هذه المستحلبات عن طريق إضافة قطرة صغيرة على شريحة زجاجية تليها الملاحظة تحت مجهر تباين الطور. عرضت المستحلبات الناتجة عن طريقة التجانس المهتز جزيئات رمادية / بيضاء على شكل حبة ، تمثل قطرات صغيرة من مستحلبات الماء في الزيت. في المقابل ، كانت قطرات المستحلب الناتجة باستخدام طريقة الحقنة أكبر وأكثر بياضا. في طريقة الدوامة ، لوحظت جزيئات رمادية / سوداء كبيرة ، تتوافق مع فقاعات الهواء المحاصرة في المستحلب (الشكل 2 أ).
لاختبار الاستقرار طويل المدى لمستحلبات الماء في الزيت ، يمكن قياس التغيرات في توزيع حجم الجسيمات بمرور الوقت باستخدام محلل حجم جسيمات حيود الليزر. لم تظهر المستحلبات المحضرة بالبروتوكول الموحد الموصوف هنا أي تغيير في حجم الجسيمات على مدى 6 أسابيع (الشكل 2 ب). لذلك ، تم اختبار إمكانية تخزين المستحلبات التي تحتوي على الببتيد MOG35-55 عند 4 درجات مئوية لفترة طويلة من الزمن ولا تزال تحفز المرض. تم تحضير المستحلبات التي تحتوي على ببتيد CFA / MOG35-55 بهذه الطريقة واستخدامها على الفور أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة 3 أو 15 أسبوعا (الشكل 3 أ). تم حقن الفئران ب 50 ميكروغرام من الببتيد MOG35-55 وسجلت العلامات السريرية للمرض كما هو موضح في البروتوكول. ومن اللافت للنظر أن المستحلبات الطازجة التي يبلغ عمرها 3 أسابيع و 15 أسبوعا تسببت جميعها في مرض EAE مماثل في جميع الحيوانات التي تم اختبارها طوال التجربة (الشكل 3 أ). وهكذا ، كشفت هذه النتائج أن المستحلبات التي تحتوي على ببتيدات MOG35-55 المحضرة باستخدام طريقة التجانس المهتز يمكن تخزينها لمدة 15 أسبوعا على الأقل ولا تزال تحفز EAE بدرجات مرض مماثلة لتلك التي تحققت مع المستحلبات الطازجة.
لتبسيط وتسريع إعداد التجارب وتجنب اختلاف الكواشف من دفعة إلى دفعة ، تم إعداد جميع المكونات الضرورية واقتباسها وتخزينها في درجة الحرارة المناسبة مسبقا. ثم أجريت خمس تجارب على مدى 6 أشهر. تم تحصين الفئران C57BL6 / J بمستحلبات MOG / CFA المعدة في يوم التحصين ، باستخدام مجموعات المستحلب ، وتقييمها للأعراض السريرية. طورت الفئران نمطا مرضيا مشابها في جميع التجارب (الشكل 3B) ، مما يكشف أن طريقة التجانس المعروضة هنا أنتجت مستحلبات تحفز EAE بطريقة متسقة وقابلة للتكرار.
لا يستغرق إجمالي وقت التحضير ، من استرداد جميع الكواشف وإضافتها وهز الأنبوب ثلاث مرات ، وتحميل المحاقن بالمستحلب ، الجاهز للتحصين ، أكثر من 30 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تحضير 20٪ فقط من المستحلب الإضافي. هذا في تناقض صارخ مع البروتوكولات الأخرى ، حيث يمكن أن يصل وقت التحضير إلى 1.5-2 ساعة وقد يلزم إعداد 50٪ -100٪ من المستحلب الإضافي لضمان وجود مواد كافية للتحصين16.
الشكل 1: رسم تخطيطي لعملية تحضير المستحلب باستخدام مجموعة مستحلب تجارية. تم إعادة استخدام هذا الرقم من Topping et al6 بإذن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: توصيف المستحلبات الناتجة باستخدام طرق مختلفة. (أ) صور تمثيلية من ثلاث طرق تحضير مختلفة: طريقة التجانس القياسية، وطريقة المحاقن التقليدية، وطريقة الدوامة. تم وضع كمية صغيرة من المستحلب على شريحة زجاجية وتمت ملاحظتها تحت مجهر تباين الطور (400x). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يتم عرض إعداد تمثيلي لكل طريقة من >15 تجربة. تم قياس المتوسط D [4 ، 3] (المتوسط المرجح للحجم) باستخدام محلل حجم الجسيمات ليكون 0.7 ميكرومتر لطريقة تجانس الاهتزاز ، و 1.4 ميكرومتر لطريقة المحاقن ، و 5.4 ميكرومتر لطريقة الدوامة. (ب) تم قياس استقرار المستحلب بمرور الوقت باستخدام محلل حجم الجسيمات. تم تحضير مستحلب من CFA / PBS باستخدام الخالط المهتز ومجموعة المستحلب ، وتحديد حجم الجسيمات ، باستخدام حيود الليزر بمرور الوقت. تم تحليل عينة واحدة على الفور ثم تم تخزين المستحلبات عند 4 درجات مئوية. تم تحليل هذه العينات بعد 1 و 2 و 4 و 6 أسابيع من التحضير. كان متوسط الحجم المرجح D [4 ، 3] لجميع العينات 0.73 ميكرومتر ± 0.03 ميكرومتر (SD). تم إعادة استخدام هذا الرقم من Topping et al6 بإذن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحريض EAE في الفئران المحصنة بمستحضر الببتيد MOG35-55 / CFA باستخدام مجموعة مستحلب تجاري. (أ) تحريض EAE للمستحلب المخزن. تم تحضير المستحلبات التي تحتوي على CFA و 50 ميكروغرام من MOG35-55 ببتيد / فأر بطريقة التجانس وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة 3 أو 15 أسبوعا. تم حقن المستحلبات الطازجة والمخزنة في نفس اليوم في الفئران C57BL / 6J (ن = 5 لكل مجموعة). تلقت الفئران 80 نانوغرام من سم السعال الديكي في نفس اليوم وبعد 24 ساعة ، وتم تسجيلها لعلامات المرض باستخدام الدرجات السريرية من 0-6. (ب) الحث المتسق ل EAE مع المستحلبات المحضرة باستخدام طريقة التجانس. تم تحضير مستحلبات تحتوي على CFA و 50 ميكروغرام من MOG35-55 ببتيد / فأر في نقاط زمنية مختلفة وحقنها في الفئران C57BL / 6J (n = 5 لكل مجموعة). تلقت الفئران 80 نانوغرام من سم السعال الديكي في نفس اليوم وبعد 24 ساعة ، وتم تسجيلها بحثا عن علامات المرض. تم إعادة استخدام هذا الرقم من Topping et al6 بإذن. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: حساب كمية كل كاشف (MOG35-55 الببتيد ، PBS ، CFA ، و IFA) لإعداد المستحلب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم استخدام مستحلبات الماء في الزيت ، مثل مستضد / مساعد فرويند ، لأكثر من نصف قرن للحث على EAE17. لا توجد حاليا طريقة موحدة لإعداد مستحلبات المستضد مستقلة عن التأثير البشري. يعد الخلط اليدوي باستخدام المحاقن أمرا قياسيا لمعظم المختبرات ، ولكن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا ، وغالبا ما تؤدي إلى فقد مفرط للمواد ، وتختلف الجودة اعتمادا على العالم الذي يقوم بإعدادها.
تستخدم الطريقة المقدمة في هذه المخطوطة آلة تجانس اهتزاز قياسية لتحضير مستحلبات المستضد/CFA. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون جميع الكواشف المستخدمة هنا aliquote وتخزينها لفترة طويلة من الزمن ، مما يجعلها مريحة وسريعة لإعداد المستحلبات. الوقت الإجمالي لإعداد المستحلبات لما يصل إلى 80 الفئران هو حوالي 30 دقيقة. هذا في تناقض صارخ مع الطرق المنشورة الأخرى ، والتي تتطلب 1-1.5 ساعة لإعداد مستحلبات MOG35-55 16,18. غالبا ما ترتبط الطرق اليدوية الأخرى ، مثل طريقة المحاقن الواحدة ، بإدخال فقاعات الهواء داخل المحاقن5. تم تصميم الطريقة المعروضة هنا بحيث يتم دفع المستحلب إلى المحاقن من نهايتها الخلفية ، مما يلغي إدخال فقاعات الهواء ويقلل من فقد المواد.
لضمان نتائج متسقة والحد الأدنى من هدر المستحلب ، هناك بعض الخطوات الحاسمة في طريقة تجانس الاهتزاز التي تتطلب اهتماما خاصا. يجب وضع الأنبوب والكواشف على الجليد قبل بدء التجربة وبعد خطوة التجانس. يجب إضافة PBS والمستضد إلى الأنبوب أولا ، متبوعا بالمساعد (CFA / IFA) ، لتجنب التركيزات المحلية العالية للمستضد عند الخلط مع مساعد الزيت. يجب شد الغطاء بإحكام عن طريق فتحه وإغلاقه عدة مرات لتجنب التسرب. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينبغي ملء المحقنة بالمستحلب تماما ، فقط حتى علامة 0.15 مل على برميل المحقنة لتجنب إهدار المستحلب. يجب إدخال المكبس في المحقنة بعناية فائقة ، باستخدام كلتا يديه. بعد ملء جميع المحاقن بالمستحلب ، يمكن تخزين المحاقن في درجة حرارة الغرفة إذا كان سيتم استخدامها في نفس اليوم ؛ خلاف ذلك ، يجب تخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
يمكن أن تبدو مستحلبات المستضد / CFA المحضرة بطريقة التجانس الاهتزازي أقل صلابة مقارنة بتلك المحضرة بطريقة الحقنة. يمكن إضافة خطوة اهتزاز إضافية (انظر الخطوة 2.5 في البروتوكول) ، والتي قد تزيد من سماكة المستحلب. ومع ذلك ، فإن المستحلبات التي تجتاز "اختبار السقوط" وفحص مجهر تباين الطور تحفز EAE بغض النظر عن الحالة الفيزيائية للمستحلب.
الاستثمار الأولي المطلوب في آلة تجانس الاهتزاز هو قيد. ومع ذلك ، فإن خطوات التحضير الموضحة هنا تضمن الحد الأدنى من إهدار المستحلب والمستضد ، والذي غالبا ما يكون مكلفا للشراء أو يستغرق وقتا طويلا للتحضير. لذلك ، على المدى الطويل ، هذه الطريقة أرخص في الاستخدام لأنها توفر الوقت والكواشف. يمكن أن يؤثر المستضد والمخزن المؤقت المستخدم في طريقة تجانس الاهتزاز على جودة المستحلب. الببتيد MOG35-55 المذاب في PBS بدون مستحلبات Ca 2+ / Mg2+ المتولدة باستمرار مع جزيئات صغيرة موحدة من الماء في الزيت (الشكل 2 أ). ومع ذلك ، فإن مستضدات الببتيد المذابة في PBS مع Ca2 + / Mg2+ ، أو الببتيدات التي تحتوي على العديد من بقايا الأحماض الأمينية المشحونة قد تولد مستحلبات أقل لزوجة. لم يتم اختبار ما إذا كانت هذه المستحلبات أقل عرضة للتسبب في المرض في النماذج الحيوانية. هناك قيد آخر لهذه الطريقة وهو أنه لا يمكن تحضير أكثر من 8 مل من مستحلب المستضد / CFA من أنبوب واحد. يجب عدم تحميل الأنابيب بأكثر من 9.6 مل في المجموع (4.8 مل من PBS / مستضد و 4.8 مل من CFA / IFA) ، والتي ستكون كافية لتحميل ثمانية محاقن سعة 1 مل. على الرغم من أن الأنبوب يمكن أن يحمل حجما أكبر ، إلا أنه يجب وجود بعض الهواء في الأنبوب ، وإلا فلن يتم إنشاء مستحلبات مثالية. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من المستحلب ، فيمكن تحضيره باستخدام أنابيب إضافية.
بالمقارنة مع الطرق الحالية ، لا يوجد فرق من شخص لآخر عند تحضير المستحلبات بطريقة التجانس الاهتزازي. الطريقة الأكثر استخداما لإعداد المستحلبات لتجارب EAE تستخدم المحاقن التي يتم دفعها ذهابا وإيابا باليد19. لا يمكن التحكم في القوة والوقت ودرجة الحرارة بشكل جيد ، وبالتالي من الصعب توحيد طريقة قائمة على المحاقن. طرق أخرى لصنع مستحلبات الماء في الزيت تستفيد من صوتيات حمام الماء بالموجات فوق الصوتية. المستحلبات المحضرة بطريقة صوتنة قادرة على تحفيز EAE في الفئران المقاومة بخلاف ذلك BALB / c8. يمكن توحيد الطريقة الموصوفة وبالتالي مفيدة. ومع ذلك ، فإن المشكلة مع حمام مائي بالموجات فوق الصوتية وصوتيات التحقيق بالموجات فوق الصوتية هي أنه من الصعب نقل المستحلب في الأنابيب إلى المحاقن المستخدمة للتحصين دون إدخال فقاعات الهواء. الأنابيب المستخدمة للطريقة المعروضة هنا تقضي على هذه المشكلة.
يمكن اعتبار طريقة الدوامة طريقة موحدة ذات سرعة ووقت ودرجة حرارة محددة. ومع ذلك ، فإن اختبار هذه الطريقة لتحضير مستحلب عن طريق دوامة تحضير MOG / CFA لمدة 10 دقائق لم ينتج عنه تحريض المرض في الفئران C57BL / 6J (البيانات غير معروضة). ومع ذلك ، يمكن تحفيز EAE بمزيج مستضد / CFA محضر عن طريق الدوامة لمدة 45 دقيقة18 ، وهو إجراء أطول بكثير مقارنة بالطريقة المعروضة في هذه المخطوطة.
ثبت أن مادة مساعدة أخرى قائمة على الزيت (انظر جدول المواد) ، معتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء لاستخدامها على البشر ، والتي تنتج مستحلب الماء في الزيت ، هي مادة مساعدة واعدة للقاحات السرطان والملاريا20،21،22. لذلك ، يمكن تكييف البروتوكول الموحد المقدم هنا للاستخدام في العيادة. كشفت التجارب الأولية أن طريقة التجانس المهتز تولد مستحلبات مع هذا الزيت المعتمد من إدارة الغذاء والدواء والتي تكون ذات جودة أفضل مقارنة بطريقة المحاقن اليدوية (البيانات غير معروضة).
في الختام ، توفر طريقة التجانس الاهتزازي المقدمة هنا عددا من الفوائد ، مثل التوليد الأسرع للمستحلبات التي يتم التحكم فيها بالجودة ، والتكاثر العالي في عدد من نماذج أمراض المناعة الذاتية ، وتقليل الكواشف باهظة الثمن اللازمة لإعداد مستحلبات المستضد / CFA. نظرا لعدم وجود فرق بين الأشخاص يولد مستحلبات الماء في الزيت هذه ، فإنه يوفر إمكانية توحيد هذه الطريقة اللازمة للبحوث الطبية الحيوية القابلة للتكرار واكتشاف الأدوية في مجال أمراض المناعة الذاتية وتطوير اللقاحات العلاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
قدمت BTB Emulsions AB طلب براءة اختراع لاستخدام جهاز وطريقة لإعداد المستحلبات للتحصين والحيوانات والبشر (رقم طلب البراءة الأوروبي: EP3836884A1). BTB هو الرئيس التنفيذي ومؤسس الشركة ، ومساهم في BTB Emulsions. تقوم Bertin-Instruments بتوزيع مجموعات المستحلب المستخدمة في هذا المنشور في جميع أنحاء العالم.
Acknowledgments
يود المؤلف أن يعرب عن تقديره لوحدات إيواء الحيوانات في جامعة لوند ، كاميلا بيوركلوف وأغنيسكا تشوبيك ، لدعمهم ، وريتشارد ويليامز ، معهد كينيدي لأمراض الروماتيزم ، جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة ، للنقد البناء والدعم اللغوي لإنتاج هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D.
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
