Summary
For å indusere eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, en dyremodell av multippel sklerose, immuniseres mus med en vann-i-olje-emulsjon som inneholder et autoantigen og fullfører Freunds adjuvans. Mens det finnes flere protokoller for fremstilling av disse emulsjonene, presenteres en rask, enkel og standardisert homogeniseringsprotokoll for emulsjonsfremstilling her.
Abstract
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) deler lignende immunologiske og kliniske trekk med multippel sklerose (MS), og er derfor mye brukt som modell for å identifisere nye legemiddelmål for bedre pasientbehandling. MS er preget av flere forskjellige sykdomsforløp: relapsing-remitting MS (RRMS), primær progressiv MS (PPMS), sekundær progressiv MS (SPMS), og en sjelden progressiv-relapsing form for MS (PRMS). Selv om dyremodeller ikke nøyaktig etterligner alle disse kontrasterende humane sykdomsfenotypene, er det EAE-modeller som gjenspeiler noen av de forskjellige kliniske manifestasjonene av MS. For eksempel etterligner myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) -indusert EAE i C57BL / 6J mus human PPMS, mens myelin proteolipidprotein (PLP) -indusert EAE i SJL / J mus ligner RRMS. Andre autoantigener, som myelin basisk protein (MBP), og en rekke forskjellige musestammer brukes også til å studere EAE. For å indusere sykdom i disse autoantigen-immunisering EAE-modellene, fremstilles en vann-i-olje-emulsjon og injiseres subkutant. De fleste EAE-modeller krever også en injeksjon av kikhostetoksin for at sykdommen skal utvikle seg. For konsistent og reproduserbar EAE-induksjon er det nødvendig med en detaljert protokoll for å fremstille reagensene for å produsere antigen / adjuvante emulsjoner. Metoden beskrevet her utnytter en standardisert metode for å generere vann-i-olje-emulsjoner. Det er enkelt og raskt og bruker en risting homogenisator i stedet for sprøyter for å forberede kvalitetskontrollerte emulsjoner.
Introduction
En sammenbrudd av immunologisk toleranse kan resultere i generering av autoimmune lidelser, som multippel sklerose (MS). Det anslås at 2,8 millioner mennesker lever medMS over hele verden 1. Selv om den eksakte årsaken til MS fortsatt i stor grad er ukjent, spiller dysregulering av autoreaktive T- og B-celler, samt defekter i Treg-funksjonen, viktige roller i patogenesen av sykdommen 2,3.
Dyremodeller av autoimmune sykdommer er viktige verktøy for å undersøke potensielle terapeutiske modaliteter. Den eksperimentelle autoimmune encefalomyelitt (EAE) -modellen har blitt brukt i nesten et århundre av forskere interessert i MS4. I tidlige eksperimenter var forekomsten av sykdommen relativt lav. Introduksjonen av komplett Freunds adjuvans (CFA), som inneholder Mycobacterium og kikhostetoksin, muliggjorde konsekvent induksjon av EAE hos mus4. Viktigst er det nødvendig å blande CFA med et sentralnervesystemet (CNS) -spesifikt antigen for å generere en homogen vann-i-olje-emulsjon for å indusere EAE. De vanligste tilgjengelige EAE-modellene er basert på aktiv immunisering av mus med encefalitogene peptider. Den genetiske bakgrunnen til musene spiller en viktig rolle i sykdomsfølsomhet, med myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG35-55) og myelin proteolipidprotein (PLP139-151) peptider som brukes til å indusere EAE i henholdsvis C57BL / 6J og SJL mus, henholdsvis5. Imidlertid kan andre musestammer og CNS-avledede peptider også brukes.
Kvaliteten på CFA/peptidemulsjonen er en kritisk faktor som bestemmer sykdomspenetrans i den aktive immuniseringen EAE modell6. En homogen vann-i-olje-emulsjon må fremstilles ved å blande de encefalitogene peptidene oppløst i vandig buffer med CFA, ellers vil dyr ikke utvikle sykdommen. Tallrike protokoller er publisert om fremstilling av CFA / peptidemulsjoner. Eksempler inkluderer bruk av en vortex7, sonikering8, sprøyter og en treveis T-kontakt9, eller en sprøyte bare5. Imidlertid er alle disse metodene vanskelige å standardisere og er ofte forbundet med lange og kompliserte protokoller.
Sammenlignet med alle de ovennevnte metodene, gir den enkle metoden beskrevet her for emulsjonsfremstilling fordelene ved å ikke ha noen person-til-person-forskjeller og være relativt rask. Emulsjonen genereres av en homogenisator som rister reagensene med en angitt hastighet, tid og temperatur, noe som sikrer raske og konsistente resultater. I tillegg til å indusere sykdom i EAE-modellen, kan denne metoden også brukes til å studere andre autoimmune sykdomsmodeller som kollagenindusert artritt (CIA) og antigenindusert artritt (AIA)6. Derfor forventes det at denne metoden kan brukes til konsekvent å indusere sykdom i andre dyremodeller som er avhengige av vann-i-olje-emulsjoner med autoantigener, som eksperimentell autoimmun neuritt (EAN)10, eksperimentell autoimmun tyroiditt (EAT)11, autoimmun uveitt (EAU)12 og myasthenia gravis (MG)13. Denne metoden induserer også generelle immunresponser som forsinket hypersensitivitet (DTH) konsekvent6, og kan derfor brukes til å levere kreft- og malariavaksiner (se diskusjon).
Således er det utviklet en rask (total forberedelsestid ~ 30 min), enkel (alle reagenser kan fremstilles på forhånd og lagres) og standardisert (emulsjonen oppnås ved hjelp av en risting homogenisator) metode og presenteres her. CFA / antigenemulsjonene fremstilt ved bruk av denne protokollen induserer konsekvent sykdom i autoimmune dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til praksisen til det svenske styret for dyreforsøk og ble godkjent av Animal Ethics Committee, Lund-Malmö, Sverige (Tillatelsesnummer: M126-16).
MERK: En skjematisk flyt av metoden er beskrevet i figur 1.
1. Materiell forberedelse
MERK: Forbered alle reagensene aseptisk i en steril hette, og aliquot og oppbevar ved den angitte temperaturen. Reagensene kan lagres opptil 2 år uten å miste effekten.
- Klargjør CFA inneholdende 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis som beskrevet nedenfor.
- Tilsett 100 mg frysetørket M. tuberculosis H37RA (se materialtabell) og fem 3,2 mm stålperler til et 7 ml rør (se materialtabell). Rist røret i en homogenisator (se materialtabell) i 60 s ved høyeste hastighetsinnstilling (5,000 o / min).
- Tilsett 5 ml ufullstendig Freunds adjuvans (IFA) i røret og rist igjen i 60 s med høyeste hastighet. Overfør oppslemmingen av homogenisert M. tuberculosis i IFA (nå kalt CFA) til et nytt rør med pipette, la perlene ligge igjen, og oppbevar ved 4 °C til bruk.
- Tilsett ultrarent vann til frysetørket pulver av MOG35-55 peptid (se materialtabell) for å oppnå en endelig peptidkonsentrasjon på 10 mg / ml. Steriliser løsningen ved å føre den gjennom et 0,2 μm filter. Tilbered 60 μL aliquots og oppbevar ved -20 °C til bruk.
MERK: MOG35-55-peptidet som brukes til dette eksperimentet er av immungrad renhet (~ 70%), er TFA-spaltet, oppløses lett i vann og inneholder et C-terminalt amid (-NH2) for å øke in vivo stabilitet14. Peptide aliquots ble aldri tint og frosset på nytt mer enn to ganger, og ble lagret ved -20 °C til bruk. - Forbered 100 ml kikhostetoksinbuffer: Løs opp 2,9 g NaCl i 80 ml 1x Ca 2+/Mg 2+ fri PBS og tilsett 100 μL 10 % Triton X-100. Juster volumet til 100 ml med PBS og steriliser oppløsningen ved å føre den gjennom et 0,2 μm filter. Tilbered 10 ml aliquots og oppbevar ved 4 °C til bruk.
2. Fremstilling av CFA / peptidemulsjoner
- Beregn mengden emulsjon som trengs for immunisering. I denne standardprotokollen mottar hver mus 50 μg MOG35-55 peptid og 300 μg M. tuberkulose spredt i Freunds adjuvans (CFA). Mengden av hvert reagens (MOG35-55 peptid, PBS, CFA og IFA) som kreves for fremstilling av emulsjonene, kan beregnes ved hjelp av tilleggsfil 1. Ytterligere 20% av alle reagenser, for å kompensere for det lille tapet av emulsjon, er inkludert i beregningen.
MERK: Det kommersielle emulsjonssettet (se materialtabell) som ble brukt i denne studien består av et rør, skrukork og et stempel i en sterilisert pose. Hvert rør i emulsjonssettet inneholder maksimalt 9,6 ml, noe som gjør det mulig å fremstille 8 x 1 ml sprøyter tilstrekkelig til immunisering av 40 mus (eller 80 mus hvis du bruker 100 μL emulsjon per dyr). - Plasser det skruekappede røret (fra det kommersielle emulsjonssettet) og reagensene som skal brukes på is.
- Tilsett emulsjonskomponentene i følgende rekkefølge i volumene beregnet i trinn 2.1: PBS, deretter peptidet, deretter M. tuberculosis i CFA, og til slutt IFA.
- Lukk røret med hetten godt ved å stramme og løsne det flere ganger. Rist røret kraftig i 5-10 s for hånd for å forhåndsblande reagensene.
- Plasser røret i den ristende homogenisatoren og fest den med stangen. Still hastigheten til den høyeste innstillingen og tiden til 60 s. Når løpet er ferdig, legg røret på is i 3 minutter. Gjenta kjøringen en eller to ganger til med de samme innstillingene.
- Sentrifuger røret ved 300 x g i 1 min for å fjerne fanget luft og komprimere emulsjonen.
- Fjern hetten fra røret, sett stempelet inn i slangen, og skyv det sakte ned til det når toppen av emulsjonen. Fjern snap off-lukkingen i bunnen av røret ved å vri den.
- Fjern stempelet fra en injeksjonssprøyte (1 ml; se materialtabell). Legg en kanyle (helst 25-27 G) til injeksjonssprøyten.
- Fest baksiden av injeksjonssprøyten til den dedikerte låsen i bunnen av slangen og lås den med en kort vri.
- Overfør emulsjonen fra slangen til injeksjonssprøyten ved å trykke forsiktig på stempelet. Stopp når emulsjonen når 0,15 ml gradering av injeksjonssprøyten.
- Skill injeksjonssprøyten fra slangen og sett stempelet forsiktig inn, pass på at det ikke kommer luft inn i sprøyten. Skyv stempelet til emulsjonen kommer ut av nålen.
MERK: På dette tidspunktet kan noe av emulsjonen brukes til kvalitetskontroll (se trinn 3). - Gjenta trinn 2.8-2.11 for resten av emulsjonen som er tilstede i røret.
MERK: For å minimere sløsing med dyre CFA / antigenemulsjoner, bør 1 ml sprøyter brukes. Andre sprøyter som passer til den dedikerte låsen i bunnen av røret kan brukes; Det kan imidlertid være nødvendig å fremstille et større volum emulsjon. CFA/MOG35-55 peptidemulsjonen kan lagres ved 4 °C i opptil 15 uker uten å miste sin EAE-induserende kapasitet.
3. Kvalitetskontroll av emulsjon
- Drop-test: Tilsett en liten dråpe av emulsjonen i et sterilt 50 ml konisk rør fylt med 20 ml kaldt vann. Lukk røret og rist det for hånd i et par sekunder. Utseendet til små distinkte dråper bekrefter dannelsen av en vann-i-olje-emulsjon.
- Undersøk emulsjonen ved hjelp av fasekontrastmikroskopi.
- For å analysere størrelsen på vann-i-olje-partiklene, tilsett en liten dråpe (2-3 μL) av emulsjonen til et mikroskopglass, smør det ut med en dekselglid, og skyv deretter hardt i en sirkulær bevegelse for å flate ut emulsjonen.
- Undersøk den smurte emulsjonen under et fasekontrastmikroskop (se materialtabell) med 400x forstørrelse og fokuser på et felt med et monolag av emulsjonen. Sørg for at små ensartede grå/hvite partikler er synlige (figur 2A).
- Analyser emulsjonspartikkelstørrelsen ved hjelp av laserdiffraksjon.
MERK: Laserdiffraksjon måler partikkelstørrelsesfordelinger ved hjelp av en laserstråle. Dette er den ultimate kvalitetskontrolltesten for emulsjoner. Et representativt resultat av partikkelstørrelsesfordelinger ved hjelp av metoden beskrevet her er vist i figur 2B (for en detaljert beskrivelse, se Topping et al.6). Likevel er dråpetesten og mikroskopundersøkelsen tilstrekkelig til å validere om en tilfredsstillende emulsjon er dannet.- Sett brytningsindeksene for både røde og blå lasere for dispergeringsmiddelet (se materialtabell) til 1,456 og for prøven til 1,33 på partikkelstørrelsesanalysatoren (se Materialtabell). Sett absorbansen til brytningsindeksen til 0,02.
- Tilsett en dråpe fra sprøyten som inneholder peptidemulsjonen til dispersjonsenheten som inneholder lett mineralolje. Start datainnsamlingen umiddelbart etter spredning av emulsjonen.
MERK: En generell modell ble brukt, og sfæriske partikler ble antatt, for estimering av partikkelstørrelsesfordeling.
4. EAE-induksjon ved bruk av MOG 35-55 peptidemulsjon i C57BL6 / J-mus
MERK: I alle eksperimenter ble fem 8-12 uker gamle kvinnelige C57BL6 / J-mus brukt.
- Før immunisering, bedøve musene ved hjelp av 2,5% fordampet isofluran og bekreft ved hjelp av en fast tåklemme.
- Injiser hver mus subkutant med 1 ml sprøyter på to forskjellige steder, på høyre og venstre side av bakflanken med 200 μL emulsjon inneholdende 50 μg MOG35-55 peptid i et 1:1 (v/v) forhold av peptid/CFA.
- Minst 1,5 timer etter immunisering med emulsjonen, og deretter igjen etter 24 timer, administrer totalt 80 ng Bordetella kikhostetoksin i 200 μL kikhostetoksinbuffer til hver mus, gjennom intraperitoneale injeksjoner (100 μL til venstre og 100 μL på høyre side av magen).
MERK: Nøyaktig lokalisering av intraperitoneal injeksjon med kikhostetoksin har vist seg å være avgjørende for aktivering av T-celler i drenerende lymfeknute15. - Valgfritt: Injiser MOG35-55 peptid igjen på dag 7 (som brukt i noen protokoller16) ved å gjenta trinn 4.2.
MERK: Viktigst av alt, sørg for at sprøytene og kanylene som brukes til immunisering som inneholder MOG/CFA eller kikhostetoksin, kastes tilstrekkelig i biohazard poser/beholdere. - Evaluer klinisk skår daglig, med en skala fra 0-6 som tidligere beskrevet6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den raske, enkle og standardiserte protokollen for fremstilling av CFA / MOG-emulsjoner er avbildet i figur 1. Denne metoden er nylig beskrevet andre steder6. CFA/MOG-emulsjonene kan også fremstilles med andre metoder, for eksempel den tradisjonelle sprøytemetoden eller ved vortexing. Disse metodene ble sammenlignet her ved å vurdere kvaliteten på emulsjonene. Alle metodene produserte vann-i-olje-emulsjoner; Homogeniteten og kvaliteten på disse emulsjonene ble vurdert ved å legge til en liten dråpe på et glassglass etterfulgt av observasjon under et fasekontrastmikroskop. Emulsjoner produsert ved risting homogeniseringsmetoden viste grå / hvite bønneformede partikler, som representerer små dråper vann-i-olje-emulsjoner. I motsetning til dette var emulsjonsdråpene produsert ved hjelp av sprøytemetoden større og hvitere. I virvelmetoden ble det observert store grå/svarte partikler, tilsvarende luftbobler fanget i emulsjonen (figur 2A).
For å teste den langsiktige stabiliteten til vann-i-olje-emulsjoner, kan endringene i partikkelstørrelsesfordeling over tid måles ved hjelp av en laserdiffraksjonspartikkelstørrelsesanalysator. Emulsjoner fremstilt med standardisert protokoll beskrevet her viste ingen endring i partikkelstørrelse over en periode på 6 uker (figur 2B). Derfor ble muligheten for at emulsjoner som inneholder MOG35-55 peptidet kan lagres ved 4 °C over lengre tid og fortsatt induserer sykdom testet. Emulsjoner inneholdende CFA/MOG35-55 peptidet ble fremstilt med denne metoden og brukt umiddelbart eller lagret ved 4 °C i 3 eller 15 uker (figur 3A). Mus ble injisert med 50 μg MOG35-55 peptid og skåret for kliniske tegn på sykdom som beskrevet i protokollen. Bemerkelsesverdig nok induserte de friske, 3 uker gamle og 15 uker gamle emulsjonene alle lignende EAE-sykdom hos alle dyr som ble testet gjennom hele forsøket (figur 3A). Dermed viste disse resultatene at emulsjoner som inneholder MOG35-55 peptider fremstilt ved bruk av risting homogeniseringsmetoden, kan lagres i minst 15 uker og fortsatt indusere EAE med sykdomspoeng sammenlignbare med de som oppnås med nytilberedte emulsjoner.
For å forenkle og fremskynde oppsettet av forsøkene og for å unngå mye-til-mye forskjell på reagenser, ble alle nødvendige komponenter fremstilt, aliquoted og lagret ved riktig temperatur på forhånd. Deretter ble fem eksperimenter utført over en periode på 6 måneder. C57BL6 / J-mus ble immunisert med MOG / CFA-emulsjonene fremstilt på immuniseringsdagen, ved bruk av emulsjonssett og evaluert for kliniske symptomer. Mus utviklet et lignende sykdomsmønster i alle eksperimenter (figur 3B), og avslørte at homogeniseringsmetoden som presenteres her produserte emulsjoner som induserte EAE på en konsistent og reproduserbar måte.
Den totale forberedelsestiden, fra henting av alle reagenser, tilsetning av dem og risting av røret tre ganger, og lasting av sprøytene med emulsjonen, klar for immunisering, tar ikke mer enn 30 minutter. I tillegg må bare 20% ekstra emulsjon fremstilles. Dette står i sterk kontrast til andre protokoller, hvor forberedelsestiden kan være opptil 1,5-2 timer og 50% -100% ekstra emulsjon må kanskje forberedes for å sikre tilstrekkelig materiale for immunisering16.
Figur 1: Skjematisk av prosessen med emulsjonsfremstilling ved bruk av et kommersielt emulsjonssett. Dette tallet er gjenbrukt fra Topping mfl.6 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av emulsjoner produsert ved ulike metoder. (A) Representative bilder fra tre forskjellige prepareringsmetoder: standard homogeniseringsmetode, tradisjonell sprøytemetode og virvelmetode. En liten mengde emulsjon ble plassert på et glassglass og observert under et fasekontrastmikroskop (400x). Skala bar = 50 μm. Et representativt preparat er vist for hver metode fra >15 eksperimenter. Gjennomsnittlig D [4, 3] (det volumvektede gjennomsnittet) ble målt med en partikkelstørrelsesanalysator til å være 0,7 μm for ristingshomogeniseringsmetoden, 1,4 μm for sprøytemetoden og 5,4 μm for virvelmetoden. (B) Stabiliteten til emulsjonen over tid ble målt ved hjelp av partikkelstørrelsesanalysatoren. En emulsjon av CFA / PBS ble fremstilt med ristingshomogenisatoren og emulsjonssettet, og partikkelstørrelsen bestemt ved bruk av laserdiffraksjon over tid. En prøve ble analysert umiddelbart, og deretter ble emulsjonene lagret ved 4 °C. Disse prøvene ble analysert 1, 2, 4 og 6 uker etter forberedelse. Gjennomsnittlig D [4, 3] volumvektet gjennomsnitt for alle prøvene var 0,73 μm ± 0,03 μm (SD). Dette tallet er gjenbrukt fra Topping mfl.6 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: EAE-induksjon hos mus immunisert med et MOG35-55 peptid / CFA-preparat ved bruk av et kommersielt emulsjonssett. (A) EAE-induksjon av den lagrede emulsjonen. Emulsjoner inneholdende CFA og 50 μg MOG35-55 peptid/mus ble fremstilt med homogeniseringsmetoden og lagret ved 4 °C i 3 eller 15 uker. De nytilberedte og lagrede emulsjonene ble injisert samme dag i C57BL / 6J-mus (n = 5 per gruppe). Musene fikk 80 ng kikhostetoksin samme dag og 24 timer senere, og ble skåret for tegn på sykdom ved hjelp av klinisk skår fra 0-6. (B) Konsistent induksjon av EAE med emulsjonene fremstilt ved bruk av homogeniseringsmetoden. Emulsjoner inneholdende CFA og 50 μg MOG35-55 peptid/mus ble fremstilt på forskjellige tidspunkter og injisert i C57BL/6J mus (n = 5 per gruppe). Musene fikk 80 ng kikhostetoksin samme dag og 24 timer senere, og ble skåret for tegn på sykdom. Dette tallet er gjenbrukt fra Topping mfl.6 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Beregning av mengden av hvert reagens (MOG35-55 peptid, PBS, CFA og IFA) for emulsjonsfremstilling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vann-i-olje-emulsjoner, som antigen / Freunds adjuvans, har blitt brukt i mer enn et halvt århundre for å indusere EAE17. Det er for tiden ingen standardisert metode for å fremstille antigenemulsjoner som er uavhengig av menneskelig påvirkning. Manuell blanding ved hjelp av sprøyter er standard for de fleste laboratorier, men denne metoden er tidkrevende, resulterer ofte i et overdreven tap av materiale, og kvaliteten varierer avhengig av forskeren som forbereder den.
Metoden som presenteres i dette manuskriptet bruker en standard risting homogeniseringsmaskin for å fremstille antigen / CFA-emulsjonene. I tillegg kan alle reagenser som brukes her aliquoted og lagres i lang tid, noe som gjør det praktisk og raskt å fremstille emulsjoner. Den totale tiden for fremstilling av emulsjoner for opptil 80 mus er ca. 30 minutter. Dette står i sterk kontrast til andre publiserte metoder, som krever 1-1,5 timer for fremstilling av MOG35-55 emulsjoner16,18. Andre manuelle metoder, som den ene sprøytemetoden, er ofte forbundet med innføring av luftbobler i sprøytene5. Metoden som presenteres her er utformet slik at emulsjonen skyves inn i sprøyter fra baksiden, noe som eliminerer innføring av luftbobler og minimerer tap av materiale.
For å sikre konsistente resultater og minimal sløsing med emulsjon, er det noen kritiske trinn i risting homogeniseringsmetoden som krever spesiell oppmerksomhet. Røret og reagensene skal plasseres på is før forsøket påbegynnes og etter homogeniseringstrinnet. PBS og antigen bør tilsettes røret først, etterfulgt av adjuvans (CFA / IFA), for å unngå høye lokale konsentrasjoner av antigen ved blanding med oljeadjuvansen. Lokket bør strammes godt ved å åpne og lukke det et par ganger for å unngå lekkasjer. I tillegg skal sprøyten ikke fylles med emulsjonen helt, bare til 0,15 ml merket på sprøytefatet for å unngå å kaste bort emulsjonen. Stempelet skal settes svært forsiktig inn i sprøyten med begge hender. Etter at alle sprøytene er fylt med emulsjonen, kan sprøytene oppbevares ved romtemperatur hvis de skal brukes samme dag; Ellers bør de oppbevares ved 4 °C til bruk.
Antigen / CFA-emulsjoner fremstilt ved risting homogeniseringsmetoden kan virke mindre faste sammenlignet med de som er fremstilt med sprøytemetoden. Et ekstra ristingstrinn kan legges til (se trinn 2.5 i protokollen), som kan tykne emulsjonen. Imidlertid induserer emulsjoner som består "dråpetesten" og fasekontrastmikroskopundersøkelsen EAE uavhengig av emulsjonens fysiske tilstand.
Den opprinnelige investeringen som kreves i en rystende homogeniseringsmaskin er en begrensning. Imidlertid sikrer forberedelsestrinnene beskrevet her minimal sløsing med emulsjon og antigenet, som ofte er dyrt å kjøpe eller tar lang tid å forberede. Derfor er denne metoden i det lange løp billigere å bruke siden den sparer tid og reagenser. Antigenet og bufferen som brukes i ristingshomogeniseringsmetoden kan påvirke emulsjonens kvalitet. MOG35-55-peptidet oppløst i PBS uten Ca 2+/Mg 2+ genererte konsekvent emulsjoner med små ensartede vann-i-olje-partikler (figur 2A). Imidlertid kan peptidantigener oppløst i PBS med Ca 2 + / Mg2 +, eller peptider som inneholder mange ladede aminosyrerester, generere emulsjoner som er mindre viskøse. Hvorvidt slike emulsjoner er mindre sannsynlig å indusere sykdom i dyremodeller, er ikke testet. En annen begrensning av denne metoden er at ikke mer enn 8 ml antigen / CFA-emulsjon kan fremstilles fra ett rør. Slangene skal ikke fylles med mer enn 9,6 ml totalt (4,8 ml PBS/antigen og 4,8 ml CFA/IFA), som vil være tilstrekkelig til å laste åtte 1 ml sprøyter. Selv om røret kan holde et større volum, må det være noe luft tilstede i røret, ellers vil det ikke bli generert perfekte emulsjoner. Hvis det er behov for mer emulsjon, kan den fremstilles ved hjelp av ekstra rør.
Sammenlignet med eksisterende metoder er det ingen person-til-person-forskjell ved fremstilling av emulsjonene med ristingshomogeniseringsmetoden. Den mest brukte metoden for å fremstille emulsjoner for EAE-eksperimenter benytter sprøyter som skyves frem og tilbake for hånd19. Kraften, tiden og temperaturen kan ikke kontrolleres godt, og det er derfor vanskelig å standardisere en sprøytebasert metode. Andre metoder for å lage vann-i-olje-emulsjoner dra nytte av ultralyd vannbad sonikatorer. Emulsjoner fremstilt med en sonikeringsmetode er i stand til å indusere EAE i ellers resistente BALB / c mus8. Den beskrevne metoden kan være standardisert og derfor nyttig. Problemet med ultralyd vannbad og ultralyd sonde sonikatorer er imidlertid at det er vanskelig å overføre emulsjonen i rørene til sprøyter som brukes til immunisering uten å introdusere luftbobler. Rørene som brukes til metoden som presenteres her, eliminerer dette problemet.
En virvelmetode kan betraktes som en standardisert metode med en bestemt hastighet, tid og temperatur. Testing av denne metoden for å fremstille en emulsjon ved å vortexere MOG/CFA-preparatet i 10 minutter resulterte imidlertid ikke i noen sykdomsinduksjon hos C57BL/6J-mus (data ikke vist). Likevel kan EAE induseres med en antigen/CFA-blanding fremstilt ved vortexing i 45 minutter18, noe som ville være en mye lengre prosedyre sammenlignet med metoden presentert i dette manuskriptet.
En annen oljebasert adjuvans (se materialtabell), godkjent av FDA for bruk på mennesker, som produserer en vann-i-olje-emulsjon, har vist seg å være en lovende adjuvans for kreft- og malariavaksiner20,21,22. Derfor kan den standardiserte protokollen som presenteres her tilpasses for bruk i klinikken. Foreløpige eksperimenter har vist at risting homogeniseringsmetoden genererer emulsjoner med denne FDA-godkjente oljen som er av bedre kvalitet sammenlignet med den manuelle sprøytemetoden (data ikke vist).
Avslutningsvis gir ristingshomogeniseringsmetoden som presenteres her en rekke fordeler, for eksempel raskere generering av kvalitetskontrollerte emulsjoner, høy reproduserbarhet i en rekke autoimmune sykdomsmodeller og en reduksjon av dyre reagenser som trengs for å fremstille antigen / CFA-emulsjoner. Siden det ikke er noen person-til-person-forskjell som genererer disse vann-i-olje-emulsjonene, gir den muligheten til å standardisere denne metoden som trengs for reproduserbar biomedisinsk forskning og narkotikaoppdagelse innen autoimmune sykdommer og terapeutisk vaksineutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BTB Emulsions AB har sendt inn en patentsøknad for bruk av en enhet og metode for fremstilling av emulsjoner for immunisering og dyr og mennesker (europeisk patentsøknadsnummer: EP3836884A1). BTB er administrerende direktør og grunnlegger av selskapet, og aksjonær i BTB Emulsions. Bertin-Instruments distribuerer emulsjonssettene som brukes i denne publikasjonen over hele verden.
Acknowledgments
Forfatteren ønsker å anerkjenne dyreboligene ved Lunds universitet, Camilla Björklöv og Agnieszka Czopek, for deres støtte, og Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Storbritannia, for konstruktiv kritikk og språklig støtte som produserer dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15 Unit 15.6 (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
