Summary
为了诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，一种多发性硬化症的动物模型，用含有自身抗原的油包水乳剂对小鼠进行免疫并完成弗氏佐剂。虽然存在用于制备这些乳液的几种方案，但本文介绍了一种用于乳液制备的快速、简单和标准化的均质化方案。
Abstract
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）与多发性硬化症（MS）具有相似的免疫学和临床特征，因此被广泛用作识别新药物靶点以更好地治疗患者的模型。MS 的特征是几种不同的病程：复发缓解型 MS （RRMS）、原发性进行性 MS （PPMS）、继发性进行性 MS （SPMS） 和罕见的进行性复发型 MS （PRMS）。虽然动物模型不能准确地模仿所有这些对比鲜明的人类疾病表型，但有一些EAE模型反映了MS的一些不同临床表现。例如，C57BL / 6J小鼠中髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导的EAE模仿人PPMS，而SJL / J小鼠中髓磷脂蛋白（PLP）诱导的EAE类似于RRMS。其他自身抗原，如髓鞘碱性蛋白（MBP）和许多不同的小鼠品系也用于研究EAE。为了在这些自身抗原免疫EAE模型中诱导疾病，制备油包水乳剂并皮下注射。大多数EAE模型还需要注射百日咳毒素才能发展疾病。为了获得一致且可重现的EAE诱导，需要详细的方案来制备试剂以产生抗原/佐剂乳剂。这里描述的方法利用标准化方法来生成油包水乳液。它简单快速，使用振荡均质机代替注射器来制备质量控制乳液。
Introduction
免疫耐受性的破坏可导致自身免疫性疾病的产生，例如多发性硬化症（MS）。据估计，全世界有280万人患有MS1。尽管MS的确切原因在很大程度上仍未知，但自身反应性T细胞和B细胞的失调以及Treg功能的缺陷在该疾病的发病机制中起着重要作用2，3。
自身免疫性疾病的动物模型是研究潜在治疗方式的重要工具。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型已被对MS4感兴趣的研究人员使用了近一个世纪。在早期的实验中，该疾病的发病率相对较低。引入含有 分枝杆菌 和百日咳毒素的完全弗氏佐剂（CFA）能够在小鼠中一致地诱导EAE4。最重要的是，有必要将CFA与中枢神经系统（CNS）特异性抗原混合，以产生均匀的油包水乳液以诱导EAE。目前最常见的EAE模型是基于用致脑肽对小鼠进行主动免疫。小鼠的遗传背景在疾病易感性中起重要作用，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）和髓鞘蛋白脂蛋白（PLP139-151）肽分别用于诱导C57BL / 6J和SJL小鼠的EAE，5。然而，也可以使用其他小鼠品系和CNS衍生的肽。
CFA/肽乳剂的质量是决定主动免疫EAE模型6中疾病外显率的关键因素。必须通过将溶解在水性缓冲液中的致脑肽与CFA混合来制备均匀的油包水乳液，否则动物不会患上这种疾病。关于CFA/肽乳液的制备已经发表了许多方案。实例包括使用涡旋7、超声处理8、注射器和三通T连接器9、或仅使用一个注射器5。然而，所有这些方法都难以标准化，并且通常与冗长而复杂的协议相关联。
与上述所有方法相比，此处描述的用于乳液制备的简单方法具有人与人之间没有差异且相对较快的优点。乳液由均质机以设定的速度、时间和温度摇动试剂产生，确保快速一致的结果。除了在EAE模型中诱导疾病外，该方法还可用于研究其他自身免疫性疾病模型，例如胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）和抗原诱导的关节炎（AIA）6。因此，预计该方法可用于在依赖于含有自身抗原的油包水乳剂的其他动物模型中持续诱导疾病，例如实验性自身免疫性神经炎（EAN）10，实验性自身免疫性甲状腺炎（EAT）11，自身免疫性葡萄膜炎（EAU）12和重症肌无力（MG）13。该方法还持续诱导一般免疫反应，例如延迟型超敏反应（DTH）6，因此可用于提供癌症和疟疾疫苗（见讨论）。
因此，已经开发了一种快速（总制备时间~30分钟），简单（所有试剂都可以提前制备并储存）和标准化（使用振荡均质器完成乳液）的方法，并在此介绍。使用该协议制备的CFA /抗原乳剂在自身免疫动物模型中始终诱导疾病。
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Protocol
所有动物程序均按照瑞典动物研究委员会的惯例进行，并得到瑞典隆德-马尔默动物伦理委员会的批准（许可证号：M126-16）。
注意：该方法的示意图如图 1所示。
1. 材料准备
注意：将所有试剂无菌准备在无菌罩中，并等分并储存在指定的温度下。试剂可以储存长达 2 年而不会失去其效果。
- 如下所述制备含有 20 mg/mL 结核分枝杆菌 的 CFA。
- 将100mg冻干结核分枝杆菌H37RA（见材料表）和五个3.2mm钢珠加入7mL管中（见材料表）。在均质器（见材料表）中以最高速度设置（5，000 rpm）摇动管子60秒。
- 向管中加入 5 mL 不完全弗氏佐剂 （IFA），并以最高速度再次摇动 60 秒。将IFA（现在称为CFA）中匀浆化的 结核分枝杆菌 的浆液转移到带有移液管的新鲜管中，留下珠子，并在4°C下储存直至使用。
- 将超纯水加入MOG35-55 肽的冻干粉末中（参见 材料表），以获得10mg / mL的最终肽浓度。通过0.2μm过滤器对溶液进行灭菌。准备60μL等分试样并储存在-20°C直至使用。
注意：用于本实验的MOG35-55 肽具有免疫级纯度（~70%），TFA切割，易溶于水，并含有C端酰胺（-NH2）以增加 体内 稳定性14。肽等分试样从未解冻和重新冷冻两次以上，并储存在-20°C直至使用。 - 准备 100 mL 百日咳毒素缓冲液：将 2.9 g NaCl 溶解在 80 mL 的 1x Ca 2+/Mg 2+ 游离 PBS 中，并加入 100 μL 10% Triton X-100。用PBS将体积调节至100 mL，并通过0.2μm过滤器对溶液进行灭菌。准备10mL等分试样并储存在4°C直至使用。
2. CFA/肽乳液的制备
- 计算免疫所需的乳液量。在该标准方案中，每只小鼠接受50μgMOG35-55 肽和300μg分散在弗氏佐剂（CFA）中的 结核分枝杆菌 。制备乳液所需的每种试剂（MOG35-55 肽、PBS、CFA 和 IFA）的量可以使用 补充文件 1 计算。计算中包括所有试剂的另外20%，以补偿乳液的少量损失。
注意：本研究中使用的商业乳液套件（见 材料表）包括灭菌袋中的管子、螺旋盖和柱塞。乳液试剂盒的每个管最多可容纳9.6 mL，因此可以制备8 x 1 mL注射器，足以免疫40只小鼠（如果每只动物使用100μL乳液，则为80只小鼠）。 - 将螺旋盖管（来自商业乳液套件）和要在冰上使用的试剂放在冰上。
- 在步骤2.1中计算的体积中按以下顺序添加乳液组分：PBS，然后是肽，然后是CFA中的 结核分枝杆菌 ，最后是IFA。
- 用盖子牢固地关闭管子，将其拧紧并松开几次。用手剧烈摇动试管5-10秒以预混合试剂。
- 将管子放入振荡均质器中，并用杆固定。将速度设置为最高设置，将时间设置为 60 秒。运行完成后，将管子放在冰上3分钟。使用相同的设置再重复运行一两次。
- 将管以300× g 离心1分钟以除去滞留的空气并压实乳液。
- 从管中取下盖子，将柱塞插入管中，然后缓慢向下推，直到到达乳液的顶部。通过扭转管子底部的卡扣开盖来取下它。
- 从注射器中取出柱塞（1 mL;参见 材料表）。向注射器中加入针头（优选25-27G）。
- 将注射器的后端连接到管底部的专用锁上，并以短促的扭转将其锁定。
- 通过轻轻推动柱塞将乳液从管转移到注射器中。当乳液达到注射器的0.15mL刻度时停止。
- 将注射器与管分开并小心插入柱塞，注意没有空气进入注射器。推动柱塞，直到乳液从针头中出来。
注意：此时，一些乳液可用于质量控制（见步骤3）。 - 对管中存在的其余乳液重复步骤2.8-2.11。
注意：为了尽量减少昂贵的CFA /抗原乳剂的浪费，应使用1 mL注射器。可以使用安装在管底部专用锁的其他注射器;然而，可能需要制备更大体积的乳液。CFA / MOG35-55 肽乳液可在4°C下储存长达15周，而不会失去其EAE诱导能力。
3. 乳液的质量控制
- 滴落测试：将一小滴乳液加入装有 20 mL 冷水的无菌 50 mL 锥形管中。关闭管子并用手摇晃几秒钟。微小的独特液滴的出现证实了油包水乳液的形成。
- 使用相衬显微镜检查乳液。
- 要分析油包水颗粒的大小，请将一小滴（2-3μL）乳液添加到显微镜载玻片中，用盖玻片将其涂抹，然后以圆周运动用力推动以压平乳液。
- 在相衬显微镜（见 材料表）下以400倍放大倍率检查涂抹的乳液，并聚焦在具有单层乳液的领域。确保可以看到均匀的灰色/白色小颗粒（图2A）。
- 使用激光衍射分析乳液粒度。
注意：激光衍射使用激光束测量粒度分布。这是乳液的终极质量控制测试。使用此处描述的方法进行粒度分布的代表性结果如图 2B 所示（有关详细说明，请参阅Topping等人6）。然而，跌落测试和显微镜检查足以验证是否形成了令人满意的乳液。- 在粒度分析仪上，将分散剂的红色和蓝色激光（参见材料表）的折射率设置为1.456，将样品的折射率设置为1.33（参见材料表）。将折射率的吸光度设置为0.02。
- 从含有肽乳液的注射器中加入一滴到含有轻矿物油的分散装置中。乳液分散后立即开始数据采集。
注意：应用通用模型，并假设球形颗粒，以估计粒度分布。
4. 在C57BL6 / J小鼠中使用MOG 35-55 肽乳液进行EAE诱导
注意：在所有实验中，使用五只8-12周龄的雌性C57BL6 / J小鼠。
- 在免疫之前，使用2.5%汽化异氟醚麻醉小鼠，并使用坚定的脚趾捏确认。
- 使用1 mL注射器将每只小鼠皮下注射到后胁右侧和左侧的两个不同部位，用200μL乳液注射，其中含有50μgMOG35-55 肽，肽/ CFA的比例为1：1（v / v）。
- 用乳液免疫后至少1.5小时，然后在24小时后再次，通过腹膜内注射（左侧100μL和腹部右侧部位100μL）向每只小鼠施用200μL百日咳毒素缓冲液中的总共80ng百日咳 博德特 氏菌毒素。
注意：用百日咳毒素腹膜内注射的精确定位已被证明对于引流淋巴结中T细胞的活化至关重要15。 - 可选：通过重复步骤4.2，在第7天再次注入MOG35-55 肽（在某些方案16中使用）。
注意：最重要的是，确保用于免疫含有MOG / CFA或百日咳毒素的注射器和针头充分处理在生物危害袋/容器中。 - 每天评估临床评分，使用前面描述的0-6 的量表6。
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Representative Results
用于制备CFA/MOG乳液的快速、简单和标准化方案如图 1所示。这种方法最近在别处有描述6.CFA / MOG乳液也可以用其他方法制备，例如传统的注射器方法或通过涡旋法制备。这里通过评估乳液的质量来比较这些方法。所有方法都生产油包水乳液;通过在载玻片上加入一小滴，然后在相差显微镜下观察来评估这些乳液的均匀性和质量。通过振荡均质法生产的乳液显示出灰色/白色豆形颗粒，代表油包水乳液的微小液滴。相比之下，使用注射器方法产生的乳液液滴更大更白。在涡旋法中，观察到大的灰色/黑色颗粒，对应于乳液中捕获的气泡（图2A）。
为了测试油包水乳液的长期稳定性，可以使用激光衍射粒度分析仪测量粒度分布随时间的变化。用此处描述的标准化方案制备的乳液在6周内未显示粒径的任何变化（图2B）。因此，测试了含有MOG35-55 肽的乳液可以在4°C下长时间储存并且仍然诱发疾病的可能性。用该方法制备含有CFA / MOG35-55 肽的乳液，并立即使用或在4°C下储存3或15周（图3A）。将小鼠注射50μgMOG35-55 肽，并按照协议中所述对疾病的临床症状进行评分。值得注意的是，新鲜，3周龄和15周龄的乳剂在整个实验过程中测试的所有动物中都诱导了类似的EAE疾病（图3A）。因此，这些结果表明，使用振荡均质方法制备的含有MOG35-55 肽的乳液可以储存至少15周，并且仍然诱导EAE，其疾病评分与新鲜制备的乳液相当。
为了简化和加快实验的设置，并避免试剂的批次间差异，所有必要的组分都提前制备、等分并储存在适当的温度下。然后，在6个月内进行了五次实验。C57BL6 / J小鼠用免疫当天制备的MOG / CFA乳剂免疫，使用乳液试剂盒，并评估临床症状。小鼠在所有实验中都产生了相似的疾病模式（图3B），这表明这里介绍的匀浆方法产生了以一致且可重复的方式诱导EAE的乳液。
从检索所有试剂，加入它们并摇动试管三次，以及用乳液装入注射器，准备免疫，总准备时间不超过30分钟。此外，只需制备20%的额外乳液。这与其他方案形成鲜明对比，其中制备时间可长达1.5-2小时，并且可能需要制备50%-100%的额外乳液以确保足够的免疫材料16。
图 1：使用商用乳液试剂盒制备乳液的过程示意图。 该图经许可从Topping等人6 中重复使用。 请点击此处查看此图的大图。
图2：使用不同方法生产的乳液的表征 。 （A）来自三种不同制备方法的代表性图像：标准均质法，传统注射器法和涡旋法。将少量乳液放在载玻片上，并在相差显微镜（400x）下观察。比例尺 = 50 μm。从>15个实验中显示了每种方法的代表性制备方法。用粒径分析仪测量的平均D [4，3]（体积加权平均值）对于振荡均质方法为0.7μm，对于注射器方法为1.4μm，对于涡旋方法为5.4μm。（B）使用粒度分析仪测量乳液随时间推移的稳定性。用振荡均质器和乳液试剂盒制备CFA/PBS乳液，并利用激光衍射随时间测定粒径。立即分析一个样品，然后将乳液储存在4°C。 在制备后1、2、4和6周分析这些样品。所有样品的平均D [4， 3]体积加权平均值为0.73μm±0.03μm（SD）。该图经许可从Topping等人6 中重复使用。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用商业乳液试剂盒用 MOG35-55 肽/CFA 制剂免疫的小鼠中的 EAE 诱导。 （A）EAE诱导储存的乳液。用匀浆法制备含有CFA和50μgMOG35-55 肽/小鼠的乳液，并在4°C下储存3或15周。将新鲜制备和储存的乳剂在同一天注射到C57BL / 6J小鼠中（每组n = 5）。小鼠在同一天和24小时后接受80ng百日咳毒素，并使用0-6的临床评分对疾病迹象进行评分。（B）使用均质方法制备的乳液一致诱导EAE。在不同时间点制备含有CFA和50μgMOG35-55 肽/小鼠的乳液，并注射到C57BL / 6J小鼠中（每组n = 5）。小鼠在同一天和24小时后接受80ng百日咳毒素，并对疾病迹象进行评分。该图经许可从Topping等人6 中重复使用。 请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：计算用于乳液制备的每种试剂（MOG35-55肽，PBS，CFA和IFA）的量。请点击此处下载此文件。
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Discussion
油包水乳剂，如抗原/弗氏佐剂，已被用于诱导EAE17超过半个世纪。目前还没有独立于人类影响的抗原乳剂制备标准化方法。使用注射器手动混合是大多数实验室的标准，但是这种方法非常耗时，通常会导致材料过度损失，并且质量因制备它的科学家而异。
本手稿中介绍的方法使用标准振荡均质机制备抗原/CFA 乳剂。此外，这里使用的所有试剂都可以等分并长期储存，方便快捷地制备乳液。制备多达80只小鼠的乳液的总时间约为30分钟。这与其他已发表的方法形成鲜明对比，后者需要1-1.5小时来制备MOG35-55 乳液16，18。其他手动方法，例如一种注射器方法，通常与注射器内引入气泡有关5。这里介绍的方法被设计成使乳液从后端推入注射器中，从而消除了气泡的引入并最大限度地减少了材料的损失。
为了确保一致的结果和最少的乳液浪费，振荡均质方法中的一些关键步骤需要特别注意。在开始实验之前和均质步骤之后，应将试管和试剂放在冰上。应首先将PBS和抗原添加到管中，然后加入佐剂（CFA / IFA），以避免与油佐剂混合时局部高浓度的抗原。盖子应通过打开和关闭几次来牢固地拧紧，以避免泄漏。此外，注射器不应完全充满乳液，只能直到注射器筒上的0.15 mL标记，以避免浪费乳液。柱塞应用双手非常小心地插入注射器中。在所有注射器中填充乳液后，如果注射器在同一天使用，则可以在室温下储存;否则，它们应储存在4°C直至使用。
与注射器法制备的抗原/CFA乳剂相比，通过振荡均质法制备的抗原/ CFA乳剂可能看起来不太坚硬。可以添加额外的振荡步骤（参见协议中的步骤2.5），这可能会使乳液变稠。然而，无论乳液的物理状态如何，通过“跌落测试”和相差显微镜检查的乳液都会诱导EAE。
振动均质机所需的初始投资是一个限制。然而，此处描述的制备步骤可确保乳液和抗原的最小浪费，而乳液和抗原的购买成本通常很高或需要很长时间才能制备。因此，从长远来看，这种方法使用起来更便宜，因为它节省了时间和试剂。振荡均质方法中使用的抗原和缓冲液会影响乳液的质量。将MOG35-55肽溶解在PBS中，不含Ca2 + / Mg 2+，一致地生成具有小而均匀的油包水颗粒的乳液（图2A）。然而，溶解在PBS中的Ca 2+/Mg2+肽抗原或含有许多带电氨基酸残基的肽可能会产生粘度较低的乳液。这种乳液是否不太可能在动物模型中诱发疾病尚未经过测试。该方法的另一个限制是，一个试管中制备的抗原/CFA 乳剂不得超过 8 mL。试管的总装载量不应超过 9.6 mL（4.8 mL PBS/抗原和 4.8 mL CFA/IFA），足以装载 8 个 1 mL 注射器。虽然管子可以容纳更大的体积，但管中必须存在一些空气，否则不会产生完美的乳液。如果需要更多乳液，可以使用额外的管制备。
与现有方法相比，使用振荡均质法制备乳液时没有人与人之间的差异。制备EAE实验乳液的最常用方法使用用手来回推动的注射器19。力、时间和温度无法很好地控制，因此很难标准化基于注射器的方法。制造油包水乳液的其他方法利用了超声波水浴超声仪。用超声方法制备的乳液能够在其他抗性BALB /c小鼠中诱导EAE。所描述的方法可以标准化，因此很有用。然而，超声波水浴和超声波探头超声仪的问题在于，很难在不引入气泡的情况下将管中的乳液转移到用于免疫的注射器中。用于此处介绍的方法的管子消除了这个问题。
涡旋法可以被认为是具有设定速度、时间和温度的标准化方法。然而，通过涡旋MOG / CFA制剂10分钟来测试该方法以制备乳液，在C57BL / 6J小鼠中没有疾病诱导（数据未显示）。然而，EAE可以用涡旋45分钟18制备的抗原/ CFA混合物诱导，与本手稿中介绍的方法相比，这将是一个更长的过程。
另一种油基佐剂（见材料表），经FDA批准用于人类，可产生油包水乳液，已被证明是癌症和疟疾疫苗的有前途的佐剂20，21，22。因此，这里介绍的标准化方案可以适应临床使用。初步实验表明，摇动均质方法用这种FDA批准的油产生乳液，与手动注射器方法相比，其质量更好（数据未显示）。
总之，这里介绍的振荡均质方法具有许多优点，例如质量控制乳液的生成速度更快，在许多自身免疫性疾病模型中具有高重现性，以及减少制备抗原/ CFA乳剂所需的昂贵试剂。由于产生这些油包水乳液的人与人之间没有差异，因此它提供了标准化该方法的可能性，该方法在自身免疫性疾病和治疗性疫苗开发领域进行可重复的生物医学研究和药物发现。
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Disclosures
BTB Emulsions AB已提交专利申请，用于使用一种设备和方法制备用于免疫和动物和人类的乳液（欧洲专利申请号：EP3836884A1）。BTB是该公司的首席执行官和创始人，也是BTB Emulsions的股东。Bertin-Instruments正在向全世界分发本出版物中使用的乳液套件。
Acknowledgments
作者要感谢隆德大学的动物饲养单位Camilla Björklöv和Agnieszka Czopek的支持，以及英国牛津大学肯尼迪风湿病研究所的Richard Williams的建设性批评和语言支持，以撰写这份手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
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