Mitofagie visualiseren met fluorescerende kleurstoffen voor mitochondriën en lysosoom
Summary
Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole. De evaluatie van mitofagie in vivo wordt echter belemmerd door het gebrek aan betrouwbare kwantitatieve testen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de observatie van mitofagie in levende cellen met behulp van een celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en een rood-fluorescerende lysosoomkleurstof.
Abstract
Mitochondriën, die de krachtpatsers van de cel zijn, spelen een belangrijke rol in de bio-energetica, het genereren van vrije radicalen, calciumhomeostase en apoptose. Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole en wordt over het algemeen bestudeerd met behulp van microscopische observatie, maar in vivo mitofagie-assays zijn moeilijk uit te voeren. Het evalueren van mitofagie door levende organellen in beeld te brengen is een alternatieve en noodzakelijke methode voor mitochondriaal onderzoek. Dit protocol beschrijft de procedures voor het gebruik van de celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof MitoTracker Green en de rood-fluorescerende lysosoomkleurstof LysoTracker Red in levende cellen, inclusief het laden van de kleurstoffen, visualisatie van de mitochondriën en het lysosoom, en verwachte resultaten. Gedetailleerde stappen voor de evaluatie van mitofagie in levende cellen, evenals technische opmerkingen over microscoopsoftware-instellingen, worden ook verstrekt. Deze methode kan onderzoekers helpen mitofagie te observeren met behulp van live-cell fluorescerende microscopie. Bovendien kan het worden gebruikt om mitochondriën en lysosomen te kwantificeren en mitochondriale morfologie te beoordelen.
Introduction
Mitochondriën zijn de krachtpatsers van bijna alle eukaryote cellen 1,2. Naast ATP-productie door oxidatieve fosforylering spelen mitochondriën een vitale rol in andere processen zoals bio-energetica, calciumhomeostase, vrije radicalengeneratie, apoptose en cellulaire homeostase 3,4,5. Omdat mitochondriën reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren uit meerdere complexen in de elektronentransportketen, worden ze voortdurend gestimuleerd door potentiële oxidatieve stress, wat uiteindelijk kan leiden tot structurele schade en disfunctie wanneer het antioxidantafweersysteem instort 6,7. Mitochondriale disfunctie blijkt bij te dragen aan vele ziekten, waaronder metabole stoornissen, neurodegeneratie en hart- en vaatziekten8. Daarom is het cruciaal om gezonde mitochondriale populaties en hun juiste functie te behouden. Mitochondriën zijn zeer plastische en dynamische organellen; hun morfologie en functie worden gecontroleerd door mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen, waaronder posttranslationele modificaties (PTM) van mitochondriale eiwitten, mitochondriale biogenese, fusie, splijting en mitofagie 9,10. Mitochondriale splijting gemedieerd door dynamin-gerelateerd eiwit 1 (DRP1), een GTPase van de dynamin superfamilie van eiwitten, resulteert in kleine en ronde mitochondriën en isoleert de disfunctionele mitochondriën, die kunnen worden opgeruimd en afgebroken door mitofagie11,12.
Mitofagie is een cellulair proces dat selectief mitochondriën afbreekt door autofagie, meestal optredend in beschadigde mitochondriën na letsel, veroudering of stress. Vervolgens worden deze mitochondriën aan lysosomen geleverd voor afbraak10. Mitofagie is dus een katabolisch proces dat helpt de kwantiteit en kwaliteit van mitochondriën in een gezonde toestand te behouden in een breed scala aan celtypen. Het speelt een cruciale rol bij het herstel van cellulaire homeostase onder normale fysiologische en stressomstandigheden13,14. Cellen worden gekenmerkt door een complex mitofagiemechanisme, dat wordt geïnduceerd door verschillende signalen van cellulaire stress en ontwikkelingsveranderingen. Mitofagie regulerende routes worden geclassificeerd als ubiquitine-afhankelijk of receptor-afhankelijk15,16; de ubiquitine-afhankelijke autofagie wordt gemedieerd door het kinase PINK1 en de rekrutering van ubiquitineligase Parkin E3 naar de mitochondriën 17,18, terwijl receptorafhankelijke autofagie de binding van autofagiereceptoren aan de microtubule-geassocieerde eiwitlichtketen LC3 omvat die mitofagie bemiddelt als reactie op mitochondriale schade19.
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is de meest gebruikte methode, en nog steeds een van de beste methoden, om mitofagie te observeren en te detecteren20. De morfologische kenmerken van mitofagie zijn autofagosomen of autolysosomen gevormd door de fusie van autofagosomen met lysosomen, die kunnen worden waargenomen op elektronenmicroscopiebeelden21. De zwakte van elektronenmicroscopie (EM) is echter het onvermogen om de dynamische processen van mitofagie, zoals mitochondriale depolarisatie, mitochondriale splijting en fusie van autofagosomen en lysosomen, in de levende celte volgen 20. Het evalueren van mitofagie door middel van beeldvorming van levende organellen is dus een aantrekkelijke alternatieve methode voor mitochondriaal onderzoek. De hier beschreven live cell imaging-techniek maakt gebruik van twee fluorescerende kleurstoffen om mitochondriën en lysosomen te kleuren. Wanneer mitofagie optreedt, worden beschadigde of overbodige mitochondriën die door autofagosomen worden overspoeld, groen gekleurd door de mitochondriale kleurstof, terwijl de rode kleurstof de lysosomen kleurt. De fusie van deze autofagosomen en lysosomen, aangeduid als autolysosomen, zorgt ervoor dat de groene en rode fluorescentie elkaar overlappen en zich manifesteren als gele stippen, wat wijst op het optreden van mitofagie22. De celpermeante mitochondriakleurstof (MitoTracker Green) bevat een mild thiol-reactieve chloromethylgroep om mitochondriën23 te labelen. Om mitochondriën te labelen, worden cellen eenvoudig geïncubeerd met de kleurstof, die passief over het plasmamembraan diffundeert en zich ophoopt in actieve mitochondriën. Deze mitochondriale kleurstof kan gemakkelijk levende cellen kleuren en is minder effectief in het kleuren van aldehyde-vaste of dode cellen. De lysosoomkleurstof (LysoTracker Red) is een fluorescerende acidotrope sonde die wordt gebruikt voor het labelen en volgen van zure organellen in levende cellen. Deze kleurstof vertoont een hoge selectiviteit voor zure organellen en kan levende cellen effectief labelen in nanomolaire concentraties24.
De procedures voor het gebruik van deze fluorescerende kleurstoffen in levende cellen, inclusief het laden van de kleurstoffen en de visualisatie van mitochondriën en lysosomen, worden hier gepresenteerd. Deze methode kan onderzoekers helpen mitofagie te observeren met behulp van live-cell fluorescerende microscopie. Het kan ook worden gebruikt om mitochondriën en lysosomen te kwantificeren en mitochondriale morfologie te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol biedt een methode voor het evalueren en monitoren van het dynamische proces van mitofagie in levende cellen, waarbij autofagosomen, lysosomen en mitochondriale splijting betrokken zijn, door co-kleuring met celpermeant mitochondriën en lysosoomkleurstoffen. De methode kan ook worden gebruikt om mitochondriën te identificeren en mitochondriale morfologie te beoordelen. Beide kleurstoffen die in dit onderzoek worden gebruikt, moeten worden beschermd tegen licht, meerdere vries-dooicycli moete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), de National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044) en het Program for Professor of Special Appointment aan Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
