미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화
Summary
미토파지는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘입니다. 그러나, 생체 내 미토파지의 평가는 신뢰할 수 있는 정량적 분석의 부족으로 인해 방해를 받는다. 여기에 제시된 것은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하기위한 프로토콜입니다.
Abstract
세포의 발전소 인 미토콘드리아는 생체 에너지, 자유 라디칼 생성, 칼슘 항상성 및 세포 사멸에 중요한 역할을합니다. Mitophagy는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘이며 일반적으로 현미경 관찰을 사용하여 연구되지만 생체 내 미토파지 분석은 수행하기가 어렵습니다. 살아있는 세포 소기관을 이미징하여 미토파지를 평가하는 것은 미토콘드리아 연구를 위한 대안적이고 필요한 방법입니다. 이 프로토콜은 염료의 로딩, 미토콘드리아 및 리소좀의 시각화 및 예상 결과를 포함하여 살아있는 세포에서 세포 투과성 녹색-형광 미토콘드리아 염료 MitoTracker Green 및 적색 형광 리소좀 염료 LysoTracker Red를 사용하는 절차를 설명합니다. 살아있는 세포에서 미토파지 평가를 위한 자세한 단계와 현미경 소프트웨어 설정에 대한 기술 참고 사항도 제공됩니다. 이 방법은 연구자들이 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 미토파지를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 미토콘드리아와 리소좀을 정량화하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포의 발전소입니다 1,2. 산화적 인산화를 통한 ATP 생산 외에도 미토콘드리아는 생물 에너지, 칼슘 항상성, 자유 라디칼 생성, 세포 사멸 및 세포 항상성 3,4,5와 같은 다른 과정에서 중요한 역할을 합니다. 미토콘드리아는 전자 수송 사슬의 여러 복합체에서 활성 산소 종 (ROS)을 생성하기 때문에 잠재적 인 산화 스트레스에 의해 지속적으로 자극되어 항산화 방어 시스템이 붕괴 될 때 결국 구조적 손상과 기능 장애를 유발할 수 있습니다 6,7. 미토콘드리아 기능 장애는 대사 장애, 신경 변성 및 심혈관 질환을 비롯한 많은 질병에 기여하는 것으로 밝혀졌습니다8. 따라서 건강한 미토콘드리아 개체군과 적절한 기능을 유지하는 것이 중요합니다. 미토콘드리아는 매우 가소성적이고 역동적 인 세포 기관입니다. 이들의 형태와 기능은 미토콘드리아 단백질의 번역 후 변형 (PTM), 미토콘드리아 생물 발생, 융합, 핵분열 및 미토파지 9,10을 포함한 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의해 제어됩니다. 다이나민 관련 단백질 1 (DRP1)에 의해 매개되는 미토콘드리아 분열은 다이나민 수퍼 패밀리의 GTPase로 작고 둥근 미토콘드리아를 생성하고 기능 장애 미토콘드리아를 분리하며, 이는 미토파지11,12에 의해 제거되고 분해 될 수 있습니다.
Mitophagy는 자가포식에 의해 미토콘드리아를 선택적으로 분해하는 세포 과정으로, 일반적으로 손상, 노화 또는 스트레스 후 손상된 미토콘드리아에서 발생합니다. 이어서, 이들 미토콘드리아는 분해10을 위해 리소좀으로 전달된다. 따라서 미토파지는 다양한 세포 유형에서 미토콘드리아의 양과 질을 건강한 상태로 유지하는 데 도움이 되는 이화 과정입니다. 그것은 정상적인 생리적 및 스트레스 조건 하에서 세포 항상성의 회복에 결정적인 역할을합니다13,14. 세포는 세포 스트레스와 발달 변화의 다른 신호에 의해 유도되는 복잡한 미토파지 메커니즘을 특징으로합니다. 미토파지 조절 경로는 유비퀴틴 의존성 또는 수용체 의존성15,16으로 분류됩니다. 유비퀴틴 의존성 자가포식은 키나아제 PINK1 및 유비퀴틴 리가아제 Parkin E3의 미토콘드리아 17,18로의 동원에 의해 매개되는 반면, 수용체-의존성 자가포식은 미토콘드리아 손상에 반응하여 미토포식을 매개하는 미세소관 관련 단백질 경쇄 LC3에 대한 자가포식 수용체의 결합을 포함합니다19.
투과 전자 현미경 (TEM)은 가장 일반적으로 사용되는 방법이며 여전히 mitophagy20을 관찰하고 검출하는 가장 좋은 방법 중 하나입니다. 미토파지의 형태학적 특징은 자가포식소체와 리소좀의 융합에 의해 형성된 자가포식체 또는 자가소좀이며, 이는 전자 현미경 이미지(21)로부터 관찰될 수 있다. 그러나, 전자 현미경(EM)의 약점은 살아있는 세포(20)에서 미토콘드리아 탈분극, 미토콘드리아 분열, 및 자가포식과 리소좀의 융합과 같은 미토포지의 동적 과정을 모니터링할 수 없다는 것이다. 따라서 살아있는 세포 기관 이미징을 통해 미토파지를 평가하는 것은 미토콘드리아 연구를 위한 매력적인 대안 방법입니다. 여기에 설명된 라이브 셀 이미징 기술은 두 가지 형광 염료를 사용하여 미토콘드리아와 리소좀을 염색합니다. 미토파지가 발생하면 자가포식소체에 의해 휩싸인 손상되거나 불필요한 미토콘드리아는 미토콘드리아 염료에 의해 녹색으로 염색되고 빨간색 염료는 리소좀을 염색합니다. 자가포식소체라고 하는 이러한 자가포식체와 리소좀의 융합은 녹색과 빨간색 형광이 겹쳐져 노란색 점으로 나타나 미토파지22의 발생을 나타냅니다. 세포 투과성 미토콘드리아 염료(MitoTracker Green)는 미토콘드리아23을 표지하기 위해 약한 티올 반응성 클로로메틸 잔기를 포함합니다. 미토콘드리아에 라벨을 붙이기 위해 세포는 단순히 염료와 함께 배양되며, 염료는 원형질막을 가로 질러 수동적으로 확산되어 활성 미토콘드리아에 축적됩니다. 이 미토콘드리아 염료는 살아있는 세포를 쉽게 염색 할 수 있으며 알데히드 고정 또는 죽은 세포를 염색하는 데 덜 효과적입니다. 리소좀 염료(LysoTracker Red)는 살아있는 세포에서 산성 소기관을 표지하고 추적하는 데 사용되는 형광 유산 탐침입니다. 이 염료는 산성 세포 기관에 대해 높은 선택성을 나타내며 나노몰 농도에서 살아있는 세포를 효과적으로 표지할 수 있습니다24.
살아있는 세포에서 이러한 형광 염료를 사용하는 절차, 즉 염료 로딩 및 미토콘드리아 및 리소좀의 시각화가 여기에 나와 있습니다. 이 방법은 연구자들이 살아있는 세포 형광 현미경을 사용하여 미토파지를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 미토콘드리아와 리소좀을 정량화하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 세포 투과성 미토콘드리아 및 리소좀 염료와의 공동 염색을 통해 자가포식, 리소좀 및 미토콘드리아 분열을 포함하는 살아있는 세포에서 미토파지의 동적 과정을 평가하고 모니터링하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 또한 미토콘드리아를 식별하고 미토콘드리아 형태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 두 염료는 빛으로부터 보호되어야하며, 여러 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), 중국 국립 자연 과학 재단 (81970333,31901044,) 및 상하이 고등 교육 기관 특별 임명 교수 프로그램 (GZ2020008).
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
