הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום
Summary
מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.
Abstract
מיטוכונדריה, בהיותה תחנות הכוח של התא, ממלאת תפקידים חשובים בביו-אנרגיה, יצירת רדיקלים חופשיים, הומאוסטזיס סידן ואפופטוזיס. מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית והיא נחקרת בדרך כלל באמצעות תצפית מיקרוסקופית, אולם מבחני מיטופגיה in vivo קשים לביצוע. הערכת מיטופגיה על ידי הדמיית אברונים חיים היא שיטה חלופית והכרחית למחקר מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לשימוש בצבע המיטוכונדריה הירוק-פלואורסצנטי של התאים MitoTracker Green ובצבע הליזוזום האדום-פלואורסצנטי LysoTracker Red בתאים חיים, כולל העמסת הצבעים, הדמיה של המיטוכונדריה והליזוזום, והתוצאות הצפויות. שלבים מפורטים להערכת mitophagy בתאים חיים, כמו גם הערות טכניות על הגדרות תוכנה מיקרוסקופ, מסופקים גם. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לצפות במיטופגיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי לכמת מיטוכונדריה וליזוזומים ולהעריך מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.
Introduction
מיטוכונדריה הם תחנות הכוח של כמעט כל התאים האאוקריוטים 1,2. בנוסף לייצור ATP באמצעות פוספורילציה חמצונית, המיטוכונדריה ממלאת תפקיד חיוני בתהליכים אחרים כגון ביו-אנרגיה, הומאוסטזיס סידן, יצירת רדיקלים חופשיים, אפופטוזיס והומאוסטזיס תאי 3,4,5. כאשר המיטוכונדריה מייצרת מיני חמצן תגובתי (ROS) ממספר קומפלקסים בשרשרת הובלת האלקטרונים, הם מגורה כל הזמן על ידי עקה חמצונית פוטנציאלית, מה שעלול להוביל בסופו של דבר לנזק מבני ולתפקוד לקוי כאשר מערכת ההגנה נוגדת החמצון קורסת 6,7. נמצא כי תפקוד לקוי של המיטוכונדריה תורם למחלות רבות, כולל הפרעות מטבוליות, ניוון עצבי ומחלות לב וכלי דם8. לכן, חיוני לשמור על אוכלוסיות מיטוכונדריאליות בריאות ועל תפקודן התקין. מיטוכונדריה הם אברונים פלסטיים ודינמיים מאוד; המורפולוגיה והתפקוד שלהם נשלטים על ידי מנגנוני בקרת איכות מיטוכונדריאליים, כולל שינויים לאחר תרגום (PTM) של חלבונים מיטוכונדריאליים, ביוגנזה מיטוכונדריאלית, איחוי, ביקוע ומיטופגיה 9,10. ביקוע מיטוכונדריאלי בתיווך חלבון 1 הקשור לדינמין (DRP1), GTPase של משפחת-העל של הדינמין של חלבונים, יוצר מיטוכונדריה קטנה ועגולה ומבודד את המיטוכונדריה הלא מתפקדת, אשר ניתנת לניקוי ולפירוק על ידי מיטופגיה11,12.
מיטופגיה היא תהליך תאי המפרק באופן סלקטיבי את המיטוכונדריה על ידי אוטופגיה, המתרחשת בדרך כלל במיטוכונדריה פגומה בעקבות פציעה, הזדקנות או סטרס. לאחר מכן, מיטוכונדריה אלה מועברים לליזוזומים לצורך פירוק10. לפיכך, מיטופגיה היא תהליך קטבולי המסייע בשמירה על כמות ואיכות המיטוכונדריה במצב בריא במגוון רחב של סוגי תאים. הוא ממלא תפקיד מכריע בשיקום הומאוסטזיס תאי בתנאי פיזיולוגיה ועקה רגילים13,14. התאים מאופיינים במנגנון מיטופגיה מורכב, המושרה על ידי אותות שונים של לחץ תאי ושינויים התפתחותיים. מסלולי ויסות מיטופגיים מסווגים כתלויי יוביקוויטין או תלויי קולטן15,16; האוטופגיה התלויה באוביקוויטין מתווכת על ידי קינאז PINK1 וגיוס של אוביקוויטין ליגאז פרקין E3 למיטוכונדריה 17,18, בעוד שאוטופגיה תלוית קולטן כרוכה בקשירת קולטני אוטופגיה לשרשרת האור החלבונית הקשורה למיקרוטובול LC3 המתווכת מיטופגיה בתגובה לנזק למיטוכונדריה19.
מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) היא השיטה הנפוצה ביותר, ועדיין אחת השיטות הטובות ביותר, כדי לבחון ולזהות mitophagy20. המאפיינים המורפולוגיים של מיטופגיה הם אוטופגוזומים או אוטוליזוזומים הנוצרים על ידי היתוך של אוטופגוזומים עם ליזוזומים, אשר ניתן לצפות בהם מתמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים21. החולשה של מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM), לעומת זאת, היא חוסר היכולת לנטר את התהליכים הדינמיים של מיטופגיה, כגון דה-פולריזציה של המיטוכונדריה, ביקוע מיטוכונדריאלי ואיחוי של אוטופגוזומים וליזוזומים, בתא החי20. לפיכך, הערכת מיטופגיה באמצעות הדמיה של אברונים חיים היא שיטה חלופית אטרקטיבית למחקר מיטוכונדריאלי. טכניקת הדמיית התאים החיים המתוארת כאן משתמשת בשני צבעים פלואורסצנטיים כדי להכתים את המיטוכונדריה ואת הליזוזומים. כאשר מתרחשת מיטופגיה, מיטוכונדריה פגומה או מיותרת שנבלעת על ידי אוטופגוזומים מוכתמת בירוק על ידי הצבע המיטוכונדריאלי, בעוד שהצבע האדום מכתים את הליזוזומים. ההיתוך של אוטופגוזומים וליזוזומים אלה, המכונים אוטוליזוזומים, גורם לפלואורסצנציה הירוקה והאדומה לחפוף ולהתבטא כנקודות צהובות, ובכך מצביע על התרחשות של מיטופגיה22. צבע המיטוכונדריה בעל התכולה (MitoTracker Green) מכיל מואטי כלורומתיל בעל תגובת קלה של תיול כדי לסמן את המיטוכונדריה23. כדי לתייג את המיטוכונדריה, התאים פשוט דוגרים עם הצבע, אשר מתפזר באופן פסיבי על פני קרום הפלזמה ומצטבר במיטוכונדריה פעילה. צבע מיטוכונדריה זה יכול בקלות להכתים תאים חיים, והוא פחות יעיל בהכתמת תאים קבועים או מתים של אלדהיד. צבע ליזוזום (LysoTracker Red) הוא גשושית פלואורסצנטית חומצית המשמשת לתיוג ומעקב אחר אברונים חומציים בתאים חיים. צבע זה מפגין סלקטיביות גבוהה עבור אברונים חומציים ויכול לסמן ביעילות תאים חיים בריכוזים ננומולריים24.
ההליכים לשימוש בצבעים פלואורסצנטיים אלה בתאים חיים, כולל טעינת הצבעים והדמיה של מיטוכונדריה וליזוזומים, מוצגים כאן. שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים לצפות במיטופגיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים. ניתן להשתמש בו גם לכימות מיטוכונדריה וליזוזומים, ולהערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה להערכה ולניטור התהליך הדינמי של מיטופגיה בתאים חיים, הכולל אוטופגוזומים, ליזוזומים וביקוע מיטוכונדריאלי, באמצעות צביעה משותפת עם מיטוכונדריה וצבעי ליזוזום המיועדים לתאים. השיטה יכולה לשמש גם לזיהוי מיטוכונדריה ולהערכת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית. שני הצבע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81970333,31901044,), והתוכנית לפרופסור למינוי מיוחד במוסדות להשכלה גבוהה בשנחאי (GZ2020008).
Materials
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
