Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий. Однако оценке митофагии in vivo препятствует отсутствие надежных количественных анализов. Здесь представлен протокол наблюдения митофагии в живых клетках с использованием клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий и красителя красных флуоресцентных лизосом.
Митохондрии, будучи электростанциями клетки, играют важную роль в биоэнергетике, генерации свободных радикалов, гомеостазе кальция и апоптозе. Митофагия является основным механизмом контроля качества митохондрий и обычно изучается с использованием микроскопических наблюдений, однако анализы митофагии in vivo трудно выполнить. Оценка митофагии путем визуализации живых органелл является альтернативным и необходимым методом митохондриальных исследований. Этот протокол описывает процедуры использования клеточного проникающего зелено-флуоресцентного красителя митохондрий MitoTracker Green и красного флуоресцентного лизосомного красителя LysoTracker Red в живых клетках, включая загрузку красителей, визуализацию митохондрий и лизосом, а также ожидаемые результаты. Также приведены подробные шаги по оценке митофагии в живых клетках, а также технические примечания о настройках программного обеспечения микроскопа. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Кроме того, он может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.
Митохондрии являются электростанциями почти всех эукариотических клеток 1,2. В дополнение к производству АТФ путем окислительного фосфорилирования, митохондрии играют жизненно важную роль в других процессах, таких как биоэнергетика, гомеостаз кальция, генерация свободных радикалов, апоптоз и клеточный гомеостаз 3,4,5. Поскольку митохондрии генерируют активные формы кислорода (АФК) из нескольких комплексов в цепи переноса электронов, они постоянно стимулируются потенциальным окислительным стрессом, который в конечном итоге может привести к структурным повреждениям и дисфункции, когда система антиоксидантной защиты разрушается 6,7. Было обнаружено, что митохондриальная дисфункция способствует развитию многих заболеваний, включая метаболические нарушения, нейродегенерацию и сердечно-сосудистые заболевания8. Поэтому крайне важно поддерживать здоровые митохондриальные популяции и их правильную функцию. Митохондрии являются высокопластичными и динамичными органеллами; их морфология и функция контролируются механизмами контроля качества митохондрий, включая посттрансляционные модификации (ПТМ) митохондриальных белков, митохондриальный биогенез, слияние, деление и митофагию 9,10. Митохондриальное деление, опосредованное связанным с динамином белком 1 (DRP1), ГТФазой надсемейства динаминов белков, приводит к малым и круглым митохондриям и изолирует дисфункциональные митохондрии, которые могут быть очищены и деградированы митофагией11,12.
Митофагия — это клеточный процесс, который избирательно разрушает митохондрии путем аутофагии, обычно происходящей в поврежденных митохондриях после травмы, старения или стресса. Впоследствии эти митохондрии доставляются в лизосомы для деградации10. Таким образом, митофагия является катаболическим процессом, который помогает поддерживать количество и качество митохондрий в здоровом состоянии в широком диапазоне типов клеток. Он играет решающую роль в восстановлении клеточного гомеостаза в нормальных физиологических и стрессовых условиях13,14. Клетки характеризуются сложным механизмом митофагии, который индуцируется различными сигналами клеточного стресса и изменений в развитии. Регуляторные пути митофагии классифицируются как убиквитин-зависимые илирецептор-зависимые 15,16; убиквитин-зависимая аутофагия опосредована киназой PINK1 и рекрутированием убиквитин-лигазы Parkin E3 в митохондрии17,18, в то время как рецептор-зависимая аутофагия включает связывание рецепторов аутофагии с микротрубочкой-ассоциированной белковой легкой цепью LC3, которая опосредует митофагию в ответ на повреждение митохондрий19.
Просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) является наиболее часто используемым методом и до сих пор одним из лучших методов для наблюдения и обнаружения митофагии20. Морфологическими особенностями митофагии являются аутофагосомы или аутолизосомы, образованные слиянием аутофагосом с лизосомами, что можно наблюдать по изображениям электронной микроскопии21. Слабость электронной микроскопии (ЭМ), однако, заключается в неспособности контролировать динамические процессы митофагии, такие как деполяризация митохондрий, деление митохондрий и слияние аутофагосом и лизосом, в живой клетке20. Таким образом, оценка митофагии с помощью визуализации живых органелл является привлекательным альтернативным методом митохондриальных исследований. Метод визуализации живых клеток, описанный здесь, использует два флуоресцентных красителя для окрашивания митохондрий и лизосом. Когда происходит митофагия, поврежденные или лишние митохондрии, поглощенные аутофагосомами, окрашиваются в зеленый цвет митохондриальным красителем, в то время как красный краситель окрашивает лизосомы. Слияние этих аутофагосом и лизосом, называемых аутолизосомами, приводит к тому, что зеленая и красная флуоресценция перекрываются и проявляются в виде желтых точек, что указывает на возникновение митофагии22. Клеточно-проницаемый краситель митохондрий (MitoTracker Green) содержит умеренно тиол-реактивный хлорметиловый фрагмент для маркировки митохондрий23. Чтобы метить митохондрии, клетки просто инкубируются с красителем, который пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и накапливается в активных митохондриях. Этот краситель митохондрий может легко окрашивать живые клетки и менее эффективен при окрашивании альдегидно-фиксированных или мертвых клеток. Лизосомный краситель (LysoTracker Red) представляет собой флуоресцентный ацидотропный зонд, используемый для маркировки и отслеживания кислых органелл в живых клетках. Этот краситель проявляет высокую селективность для кислых органелл и может эффективно маркировать живые клетки при наномолярных концентрациях24.
Здесь представлены процедуры использования этих флуоресцентных красителей в живых клетках, включая загрузку красителей и визуализацию митохондрий и лизосом. Этот метод может помочь исследователям наблюдать митофагию с помощью флуоресцентной микроскопии живых клеток. Он также может быть использован для количественной оценки митохондрий и лизосом и оценки морфологии митохондрий.
Протокол, описанный здесь, предоставляет метод оценки и мониторинга динамического процесса митофагии в живых клетках, включая аутофагосомы, лизосомы и деление митохондрий, путем совместного окрашивания с клеточными проницаемыми митохондриями и лизосомными красителями. Метод также м…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично профинансирована Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), Национальным фондом естественных наук Китая (81970333,31901044, и Программой для профессора специального назначения в Шанхайских высших учебных заведениях (GZ2020008).
Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |