Visualisation de la mitophagie avec des colorants fluorescents pour les mitochondries et le lysosome

Summary

La mitophagie est le principal mécanisme du contrôle de la qualité mitochondriale. Cependant, l’évaluation de la mitophagie in vivo est entravée par le manque de tests quantitatifs fiables. Un protocole d’observation de la mitophagie dans les cellules vivantes est présenté ici à l’aide d’un colorant mitochondrial vert-fluorescent perméable de cellules et d’un colorant lysosome fluorescent rouge.

Abstract

Les mitochondries, étant les centrales électriques de la cellule, jouent un rôle important dans la bioénergétique, la génération de radicaux libres, l’homéostasie du calcium et l’apoptose. La mitophagie est le principal mécanisme de contrôle de la qualité mitochondriale et est généralement étudiée à l’aide d’observations microscopiques, mais les tests de mitophagie in vivo sont difficiles à réaliser. L’évaluation de la mitophagie par imagerie d’organites vivants est une méthode alternative et nécessaire pour la recherche mitochondriale. Ce protocole décrit les procédures d’utilisation du colorant mitochondrial vert-fluorescent MitoTracker Green et du colorant lysosome rouge-fluorescent LysoTracker Red dans les cellules vivantes, y compris le chargement des colorants, la visualisation des mitochondries et du lysosome, et les résultats attendus. Des étapes détaillées pour l’évaluation de la mitophagie dans les cellules vivantes, ainsi que des notes techniques sur les paramètres du logiciel de microscope, sont également fournies. Cette méthode peut aider les chercheurs à observer la mitophagie à l’aide de la microscopie fluorescente à cellules vivantes. En outre, il peut être utilisé pour quantifier les mitochondries et les lysosomes et évaluer la morphologie mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries sont les centrales électriques de presque toutes les cellules eucaryotes ^1,2. En plus de la production d’ATP par phosphorylation oxydative, les mitochondries jouent un rôle essentiel dans d’autres processus tels que la bioénergétique, l’homéostasie du calcium, la génération de radicaux libres, l’apoptose et l’homéostasie cellulaire ^3,4,5. Comme les mitochondries génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS) à partir de multiples complexes dans la chaîne de transport d’électrons, elles sont constamment stimulées par un stress oxydatif potentiel, ce qui peut éventuellement entraîner des dommages structurels et un dysfonctionnement lorsque le système de défense antioxydant s’effondre ^6,7. Il a été constaté que le dysfonctionnement mitochondrial contribue à de nombreuses maladies, notamment les troubles métaboliques, la neurodégénérescence et les maladies cardiovasculaires⁸. Par conséquent, il est crucial de maintenir des populations mitochondriales saines et leur bon fonctionnement. Les mitochondries sont des organites hautement plastiques et dynamiques; Leur morphologie et leur fonction sont contrôlées par des mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale, y compris les modifications post-traductionnelles (PTM) des protéines mitochondriales, la biogenèse mitochondriale, la fusion, la fission et la mitophagie ^9,10. La fission mitochondriale médiée par la protéine 1 liée à la dynamine (DRP1), une GTPase de la superfamille des protéines dynamin, donne des mitochondries petites et rondes et isole les mitochondries dysfonctionnelles, qui peuvent être éliminées et dégradées par la mitophagie^11,12.

La mitophagie est un processus cellulaire qui dégrade sélectivement les mitochondries par autophagie, se produisant généralement dans les mitochondries endommagées à la suite d’une blessure, du vieillissement ou du stress. Par la suite, ces mitochondries sont livrées aux lysosomes pour dégradation¹⁰. Ainsi, la mitophagie est un processus catabolique qui aide à maintenir la quantité et la qualité des mitochondries dans un état sain dans un large éventail de types de cellules. Il joue un rôle crucial dans la restauration de l’homéostasie cellulaire dans des conditions physiologiques et de stress normales^13,14. Les cellules sont caractérisées par un mécanisme de mitophagie complexe, qui est induit par différents signaux de stress cellulaire et de changements développementaux. Les voies de régulation de la mitophagine sont classées comme dépendantes de l’ubiquitine ou des récepteurs^15,16; l’autophagie dépendante de l’ubiquitine est médiée par la kinase PINK1 et le recrutement de l’ubiquitine ligase Parkin E3 dans les mitochondries 17,18^, tandis que l’autophagie dépendante des récepteurs implique la liaison des récepteurs de l’autophagie à la chaîne légère de protéines associée aux microtubules LC3 qui intervient dans la mitophagie en réponse aux dommages mitochondriaux¹⁹.

La microscopie électronique à transmission (MET) est la méthode la plus couramment utilisée, et toujours l’une des meilleures, pour observer et détecter la mitophagie²⁰. Les caractéristiques morphologiques de la mitophagie sont les autophagosomes ou autolysosomes formés par la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, ce qui peut être observé à partir d’images de microscopie électronique²¹. La faiblesse de la microscopie électronique (EM), cependant, est l’incapacité de surveiller les processus dynamiques de la mitophagie, tels que la dépolarisation mitochondriale, la fission mitochondriale et la fusion des autophagosomes et des lysosomes, dans la cellule vivante²⁰. Ainsi, l’évaluation de la mitophagie par imagerie des organites vivants est une méthode alternative intéressante pour la recherche mitochondriale. La technique d’imagerie de cellules vivantes décrite ici utilise deux colorants fluorescents pour colorer les mitochondries et les lysosomes. Lorsque la mitophagie se produit, les mitochondries endommagées ou superflues englouties par les autophagosomes sont colorées en vert par le colorant mitochondrial, tandis que le colorant rouge colore les lysosomes. La fusion de ces autophagosomes et lysosomes, appelés autolysosomes, provoque le chevauchement de la fluorescence verte et rouge et se manifeste par des points jaunes, indiquant ainsi l’apparition de la mitophagie²². Le colorant mitochondrial perméable aux cellules (MitoTracker Green) contient une fraction chlorométhyle légèrement réactive au thiol pour marquer les mitochondries²³. Pour marquer les mitochondries, les cellules sont simplement incubées avec le colorant, qui diffuse passivement à travers la membrane plasmique et s’accumule dans les mitochondries actives. Ce colorant mitochondrial peut facilement colorer les cellules vivantes et est moins efficace pour colorer les cellules aldéhydes ou mortes. Le colorant lysosome (LysoTracker Red) est une sonde acidotrope fluorescente utilisée pour marquer et suivre les organites acides dans les cellules vivantes. Ce colorant présente une sélectivité élevée pour les organites acides et peut marquer efficacement les cellules vivantes à des concentrations nanomolaires²⁴.

Les procédures d’utilisation de ces colorants fluorescents dans les cellules vivantes, y compris le chargement des colorants et la visualisation des mitochondries et des lysosomes, sont présentées ici. Cette méthode peut aider les chercheurs à observer la mitophagie à l’aide de la microscopie fluorescente à cellules vivantes. Il peut également être utilisé pour quantifier les mitochondries et les lysosomes, et évaluer la morphologie mitochondriale.

Protocol

1. Culture cellulaire et passage REMARQUE: Le protocole est décrit en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) en culture de routine comme exemple. Culture de cellules MEF dans des boîtes de culture cellulaire de 10 cm avec 10 ml de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 et surveiller les cellules au microscope à un grossissement de 100x. Effectuer le passage de cellule de routine.Lorsq…

Representative Results

MitoTracker Green est une coloration mitochondriale verte-fluorescente capable de se localiser avec précision dans les mitochondries. Le colorant peut facilement colorer les cellules vivantes et est moins efficace pour colorer les cellules mortes ou fixées à l’aldéhyde (Figure 2). Le colorant lysosome fluorescent rouge LysoTracker Red est capable de marquer et de suivre les organites lysosomales acides et ne peut colorer que les cellules vivantes (Figure 2…

Discussion

Le protocole décrit ici fournit une méthode d’évaluation et de surveillance du processus dynamique de mitophagie dans les cellules vivantes, impliquant les autophagosomes, les lysosomes et la fission mitochondriale, par co-coloration avec des mitochondries perméables aux cellules et des colorants lysosomes. La méthode peut également être utilisée pour identifier les mitochondries et évaluer la morphologie mitochondriale. Les deux colorants utilisés dans cette étude doivent être protégés de la lumière, le…

Materials

Automated cell counter	Countstar	IC1000
Cell counting chamber slides	Countstar	12-0005-50
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CVC
Glass bottom cell culture dish (confocal dish)	NEST	801002
Image J (Rasband, NIH)	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Krebs–Henseleit(KHB) buffer			Self-prepared
LysoTracker Red	Invitrogen	1818430	100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye
MitoTracker Green	Invitrogen	1842298	200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye
Mouse Embryonic Fibroblasts			Self-prepared
Objective (63x oil lens)	ZEISS	ZEISS LSM 880
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibico	Cat# 25200056
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope	ZEISS	ZEISS LSM 880
ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software)	ZEISS	ZEN 2.1