ट्रांसपोसन गतिविधि पर IS200/IS605 परिवार-संबद्ध TNPB के प्रभावों का वास्तविक समय परिमाणीकरण
Summary
लाइव रियल-टाइम इमेजिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सहायक प्रोटीन टीएनपीबी व्यक्तिगत जीवित एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं में ट्रांसपोज़ेशन की गतिशीलता को कैसे प्रभावित करता है।
Abstract
यहां, एक प्रोटोकॉल को ट्रांसपोज़ेशन के लिए युग्मित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के सूट का उपयोग करके जीवित जीवाणु कोशिकाओं में ट्रांसपोसेबल तत्व गतिविधि की लाइव, रीयल-टाइम इमेजिंग करने के लिए रेखांकित किया गया है। विशेष रूप से, यह दर्शाता है कि ट्रांसपोसेबल तत्व आईएस 608 की गतिविधि पर सहायक प्रोटीन टीएनपीबी के प्रभावों का आकलन करने के लिए वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग कैसे किया जा सकता है, जो ट्रांसपोसेबल तत्वों के आईएस 200 / आईएस 605 परिवार का सदस्य है। ट्रांसपोसेबल तत्वों का आईएस 200 / आईएस 605 परिवार प्रकृति में पाए जाने वाले सबसे असंख्य जीनों में से एक, टीएनपीबी से जुड़े प्रचुर मात्रा में मोबाइल तत्व हैं। अनुक्रम होमोलॉजी का प्रस्ताव है कि टीएनपीबी प्रोटीन सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 सिस्टम के लिए एक विकासवादी अग्रदूत हो सकता है। इसके अतिरिक्त, टीएनपीबी को नए सिरे से रुचि प्राप्त हुई है, जिसे कैस जैसे आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है। IS608 की ट्रांसपोज़ेशन दरों पर TnpB के प्रभावों को परिमाणित किया जाता है, और यह प्रदर्शित किया जाता है कि IS608 के TNPB की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप TNPB अभिव्यक्ति की कमी वाली कोशिकाओं की तुलना में ~ 5x ट्रांसपोसन गतिविधि में वृद्धि होती है।
Introduction
ट्रांसपोसेबल तत्व (टीई) आनुवंशिक तत्व हैं जो जीनोमिक पुन: एकीकरण के बाद नकल को छांटने या उत्प्रेरित करके अपने मेजबान जीनोम के भीतर जुटाते हैं। टीई जीवन के सभी डोमेन में मौजूद हैं, और मेजबान जीनोम को ट्रांसपोज़िशन पुनर्गठित करता है, कोडिंग और नियंत्रणक्षेत्रों को परिवर्तित करता है। यह उत्परिवर्तन और विविधता उत्पन्न करता है जो विकास2,3, विकास 4,5, और कई मानव रोगों 6 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें कैंसर 7 भी शामिल है।
फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के लिए ट्रांसपोजिशनल गतिविधि के कुछ पहलुओं को जोड़ने वाले नए आनुवंशिक निर्माणों का उपयोग करते हुए, हमारे पिछले काम ने बैक्टीरियल टीई आईएस 608 पर आधारित एक प्रयोगात्मक प्रणाली के विकास का वर्णन किया, जो टीई के व्यापक आईएस 200 / आईएस 605 परिवार का प्रतिनिधि है, जो व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं में ट्रांसपोज़ेशन के वास्तविक समय के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है8 (चित्रा 1)। टीई प्रणाली चित्रा 1 ए में प्रदर्शित किया गया है। टीई में ट्रांसपोसेस कोडिंग अनुक्रम, टीएनपीए शामिल है, जो लेफ्ट एंड (एलई) और राइट एंड (आरई) इम्परफेक्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (आईपी) से घिरा हुआ है, जो टीएनपीए के लिए मान्यता और एक्सिशन साइटें हैं। टीएनपीए को प्रमोटर पीएलटीईटीओ 1 का उपयोग करके व्यक्त किया जाता है, जिसे टेट रिप्रेसर द्वारा दमित किया जाता है और यह एनहाइड्रोटेट्रासाइक्लिन (एटीसी) 9 के साथ इंड्यूसेबल होता है। टीई ब्लू रिपोर्टर एमसेरुलियन 3 11 के लिए एक संवैधानिक पीलासीक्यू 1 प्रमोटर10 के -10 और-35 अनुक्रमों को विभाजित करता है। जैसा कि चित्रा 1 सी में दिखाया गया है, जब टीएनपीए का उत्पादन प्रेरित होता है, तो टीई को उत्पादित किया जा सकता है, जिससे प्रमोटर पुनर्गठन होता है। उत्पादित कोशिका mCerulean3 और फ्लोरेसेस नीले रंग को व्यक्त करती है। टीएनपीए के एन-टर्मिनस को पीले रिपोर्टर वीनस12 से जोड़ा जाता है, जिससे पीले प्रतिदीप्ति द्वारा टीएनपीए स्तरों के माप की अनुमति मिलती है।
IS608 और IS200/IS605 ट्रांसपोसंस परिवार के अन्य सदस्य भी आमतौर पर अब तक अज्ञात फ़ंक्शन, tnpB13 के दूसरे जीन को एन्कोड करते हैं। टीएनपीबी प्रोटीन कई जीवाणु और आर्कियल टीई14,15 द्वारा एन्कोड किए गए न्यूक्लियस का एक जबरदस्त प्रचुर लेकिन अपूर्ण रूप से विशेषता वाला परिवार है, जिसमें अक्सर केवल टीएनपीबी16 होता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों ने टीएनपीबी में रुचि को नवीनीकृत किया है, यह पाते हुए कि टीएनपीबी सीआरआईएसपीआर / सीएएस जैसे प्रोग्रामेबल आरएनए-निर्देशित एंडोन्यूक्लिज़ के रूप में कार्य करता है जो विभिन्न परिस्थितियों में डीएसडीएनए या एसएसडीएनए ब्रेक उत्पन्नकरेगा। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि ट्रांसपोज़िशन को विनियमित करने में टीएनपीबी क्या भूमिका निभा सकता है। आईएस 608 ट्रांसपोज़ेशन पर टीएनपीबी के प्रभावों का वास्तविक समय विज़ुअलाइज़ेशन करने के लिए, ट्रांसपोसन का एक संस्करण, जिसमें लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एमचेरी के लिए एन-टर्मिनल संलयन के साथ टीएनपीबी का कोडिंग क्षेत्र शामिल है, बनाया गया था।
कुहलमैन लैब19 द्वारा किए गए अधिक विस्तृत थोक-स्तरीय अध्ययनों के पूरक के रूप में, यह यहां दिखाया गया है कि ट्रांसपोसन गतिविधि की वास्तविक समय इमेजिंग मात्रात्मक रूप से ट्रांसपोजिशनल गतिशीलता पर टीएनपीबी या किसी अन्य सहायक प्रोटीन के प्रभाव को कैसे प्रकट कर सकती है। टीएनपीबी को एमचेरी में फ्यूज करके, व्यक्तिगत ट्रांसपोजिशनल घटनाओं को नीले प्रतिदीप्ति द्वारा पहचाना जाता है और टीएनपीए (पीले प्रतिदीप्ति) और टीएनपीबी (लाल प्रतिदीप्ति) के अभिव्यक्ति स्तरों के साथ सहसंबद्ध किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीवित कोशिकाओं में ट्रांसपोसेबल तत्व गतिविधि की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए यहां प्रस्तुत अनूठी विधि एक संवेदनशील परख है जो सीधे जीवित कोशिकाओं में और वास्तविक समय में ट्रांसपोज़ेशन का पता लगा सकती …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध के लिए वित्तीय सहायता कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय से स्टार्टअप फंड द्वारा प्रदान की गई थी।
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
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