Summary
Viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale per quantificare come la proteina accessoria TnpB influenzi la dinamica della trasposizione nelle singole cellule vive di Escherichia coli .
Abstract
Qui, viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili in cellule batteriche vive utilizzando una suite di reporter fluorescenti accoppiati alla trasposizione. In particolare, dimostra come l'imaging in tempo reale possa essere utilizzato per valutare gli effetti della proteina accessoria TnpB sull'attività dell'elemento trasponibile IS608, un membro della famiglia di elementi trasponibili IS200/IS605. La famiglia IS200/IS605 di elementi trasponibili sono abbondanti elementi mobili collegati con uno degli innumerevoli geni presenti in natura, tnpB. Le omologie di sequenza propongono che la proteina TnpB possa essere un precursore evolutivo dei sistemi CRISPR/Cas9. Inoltre, TnpB ha ricevuto un rinnovato interesse, avendo dimostrato di agire come un'endonucleasi del DNA guidata da RNA simile al Cas. Gli effetti di TnpB sui tassi di trasposizione di IS608 sono quantificati ed è dimostrato che l'espressione di TnpB di IS608 si traduce in ~5 volte maggiore attività di trasposone rispetto alle cellule prive di espressione di TnpB.
Introduction
Gli elementi trasponibili (TE) sono elementi genetici che si mobilitano all'interno dei loro genomi ospiti per escissione o copia catalizzata seguita da reintegrazione genomica. I TE esistono in tutti i domini della vita e la trasposizione ristruttura il genoma ospite, mutando le regioni codificanti e di controllo1. Ciò genera mutazioni e diversità che svolgono un ruolo importante nell'evoluzione2,3, nello sviluppo 4,5 e in diverse malattie umane6, incluso il cancro7.
Utilizzando nuovi costrutti genetici che accoppiano aspetti dell'attività trasposizionale a reporter fluorescenti, il nostro lavoro precedente ha descritto lo sviluppo di un sistema sperimentale basato sul batterico TE IS608, un rappresentante della diffusa famiglia di TE IS200/IS605, che consente la visualizzazione in tempo reale della trasposizione in singole cellule vive8 (Figura 1). Il sistema TE è mostrato nella Figura 1A. Il TE comprende la sequenza codificante della trasposasi, tnpA, affiancata da ripetizioni palindromiche imperfette (IP) dell'estremità sinistra (LE) e dell'estremità destra (RE), che sono i siti di riconoscimento ed escissione per TnpA. tnpA è espresso utilizzando il promotore PLTetO1, che viene represso dal repressore tet ed è inducibile con aniidrotetraciclina (aTc)9. Il TE divide le sequenze -10 e -35 di un promotore costitutivo PlacIQ1 10 per il reporter blu mCerulean311. Come mostrato nella figura 1C, quando viene indotta la produzione di tnpA, il TE può essere asportato, portando alla ricostituzione del promotore. La cellula prodotta esprime mCerulean3 e fluoresce di blu. L'N-terminale del TnpA è fuso al reporter giallo Venere12, permettendo la misurazione dei livelli di TnpA mediante fluorescenza gialla.
IS608 e altri membri della famiglia di trasposoni IS200/IS605 codificano tipicamente anche un secondo gene della funzione finora sconosciuta, tnpB13. Le proteine TnpB sono una famiglia di nucleasi tremendamente abbondante ma non perfettamente caratterizzata codificata da diversi TE batterici e archeali 14,15, che spesso consistono solo di tnpB 16. Inoltre, studi recenti hanno rinnovato l'interesse per il TnpB scoprendo che il TnpB funziona come un'endonucleasi programmabile guidata da RNA simile a CRISPR / Cas che produrrà rotture di dsDNA o ssDNA in diverse condizioni17,18. Tuttavia, non è chiaro quale ruolo possa svolgere il TnpB nella regolamentazione del recepimento. Per eseguire la visualizzazione in tempo reale degli effetti di TnpB sulla trasposizione IS608, è stata creata una versione del trasposone, inclusa la regione codificante di TnpB con una fusione N-terminale alla proteina fluorescente rossa mCherry.
A complemento di studi più dettagliati a livello di massa eseguiti dal laboratorio Kuhlman19, viene mostrato qui come l'imaging in tempo reale dell'attività dei trasposoni possa rivelare quantitativamente l'impatto di TnpB o di qualsiasi altra proteina accessoria sulla dinamica trasposizionale. Fondendo TnpB a mCherry, i singoli eventi trasposizionali sono identificati dalla fluorescenza blu e correlati con i livelli di espressione di TnpA (fluorescenza gialla) e TnpB (fluorescenza rossa).
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Protocol
1. Preparazione di colture batteriche
- Coltivare E. coli ceppo MG1655 con costrutti di trasposone plasmidico (precedentemente descritti in Kim et al.8) durante la notte in LB con gli antibiotici appropriati (25 μg/mL di kanamicina, vedi Tabella dei materiali) a 37 °C.
NOTA: Le sequenze dei costrutti utilizzati e le relative sequenze sono disponibili come numeri di adesione GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 e OP717085. - Per ottenere una crescita esponenziale allo stato stazionario, colture diluite ≥100 volte nel mezzo M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg/mL tiamina [vitamina B1]) integrate con una fonte di carbonio (0,5% p/v di glucosio qui) e antibiotici appropriati (vedi Tabella dei materiali).
- Coltivare colture a 37 °C fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD600) raggiunge ~ 0,2. Le colture sono pronte per l'uso.
2. Preparazione della diapositiva
- Preparare un vetrino facendo bollire M63 con 0,5% p/v di glucosio e 1,5% p/v di agarosio nel microonde per sciogliere l'agarosio e assicurarsi che sia completamente fuso e ben miscelato.
- Lasciare raffreddare la miscela a ~55 °C prima di aggiungere antibiotici e induttori (25 μg/mL di kanamicina e 10 ng/μL di aniidrotetraciclina [aTc], vedere la tabella dei materiali).
- Posizionare un vetrino da microscopio sul banco di lavoro. Impila altre due diapositive perpendicolari alla prima e posizionane un'altra in alto, parallela alla diapositiva inferiore. Assicurarsi che vi sia uno spazio pari allo spessore di una diapositiva tra le diapositive inferiore e superiore. Pipettare ~ 1 mL della miscela di agarosio M63 in questo spazio tra i vetrini lentamente per creare un piccolo quadrato di gel.
- Una volta che il gel si è solidificato (~ 10-15 min), fai scorrere il vetrino superiore per rimuoverlo. Tagliare il tampone di agarosio con una lama di rasoio o un coltello. Quindi pipettare 2,5 μL della coltura (fase 1.3) e mettere il coprislip sopra.
- Sigillare lo spazio tra la slitta e la vetrina con resina epossidica (vedi Tabella dei materiali). Lasciare asciugare la resina epossidica e depositare le cellule sul tampone di agarosio per almeno 1 ora a 37 °C.
3. Microscopia a fluorescenza timelapse
- Porre il campione preparato (fase 1.3) su un microscopio a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali) in un ambiente riscaldato e mantenuto a 37 °C.
- Impostare i tempi di esposizione appropriati per la fotocamera utilizzata per l'acquisizione delle immagini. Regolare l'intensità dell'illuminazione per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
NOTA: Per il presente studio è stato utilizzato un tempo di esposizione di 2 s per ciascuna lunghezza d'onda. - Per ogni lunghezza d'onda, trova un campo visivo (FOV) contenente fluorescenza minima. Acquisire immagini da utilizzare durante l'analisi per la sottrazione dello sfondo.
- Impostare i tempi di esposizione appropriati per la fotocamera utilizzata per l'acquisizione delle immagini. Regolare l'intensità dell'illuminazione per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
- Impostare un protocollo per acquisire immagini in una griglia a diverse lunghezze d'onda e a intervalli di tempo regolari.
- Codifica la fotografia timelapse nel protocollo. Impostare la frequenza di acquisizione sull'intervallo di tempo desiderato (20 minuti qui) e la durata totale del timelapse sulla lunghezza desiderata (24 ore).
- Codificare le lunghezze d'onda appropriate nel protocollo (a seconda del costrutto utilizzato).
NOTA: Il picco di eccitazione di mCherry è a 587 nm e il picco di emissione a 610 nm21; mVenus è a 515 nm e 527 nm12, mentre mCerulean3 è a 433 nm e 475 nm11. - Impostare la dimensione della griglia da acquisire tra il numero desiderato di FOV.
NOTA: i dati rappresentativi mostrati qui hanno utilizzato 8 x 8 FOV.
4. Analisi delle immagini
- Eseguire la sottrazione dello sfondo su ciascun canale di colore utilizzando le rispettive immagini di sfondo acquisite nel passaggio 3.1.2. Per tutte le fasi di analisi, utilizziamo moduli standard nella piattaforma open source Fiji22 (vedi Tabella dei materiali).
- Approssimare la popolazione totale in ogni momento sospendendo il canale mCeruleo e dividendo l'area di soglia per l'area cellulare media.
- Per contare gli eventi di escissione unici, prendere la derivata temporale del canale mCerulean3. Esegui questa operazione sottraendo le immagini successive nel canale mCerulean3. Gli eventi di escissione saranno rilevati nella derivata temporale come un lampo luminoso di fluorescenza.
- Soglia la pila di eventi di escissione per eliminare la fluorescenza indesiderata. Si noti che questo processo eliminerà parti delle escissioni stesse. Per risolvere questo problema, dilatare le immagini per ripristinare le escissioni alle loro dimensioni originali.
NOTA: Analisi che utilizzano tecniche simili di soglia e analisi delle immagini possono essere eseguite anche su altri canali di fluorescenza (ad esempio, correlare gli eventi di escissione con i livelli di trasposasi TnpA [fluorescenza di Venere gialla] e TnpB [fluorescenza mCherry rossa].
- Soglia la pila di eventi di escissione per eliminare la fluorescenza indesiderata. Si noti che questo processo eliminerà parti delle escissioni stesse. Per risolvere questo problema, dilatare le immagini per ripristinare le escissioni alle loro dimensioni originali.
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Representative Results
Questo metodo di visualizzazione dell'attività del trasposone nelle cellule vive mediante microscopia a fluorescenza, pur avendo un rendimento inferiore rispetto alle misurazioni di fluorescenza di massa, consente la visualizzazione diretta dell'attività del trasposone nelle singole cellule vive. Gli eventi di escissione del trasposone determinano la ricostituzione del promotore per mCerulean3 (Figura 1), consentendo l'identificazione delle cellule sottoposte ad attività di trasposone mediante fluorescenza blu brillante (Figura 2, TnpB+: Filmato supplementare 1 e TnpB-: Filmato supplementare 2).
Si è riscontrato che le cellule che esprimono la proteina accessoria TnpB (Figura 3, arancione) sperimentano livelli 4-5 volte superiori di attività trasposonale rispetto a quelle che non lo fanno (Figura 3, blu), coerentemente con gli studi più dettagliati a livello di massa19. Ciò è particolarmente notevole in quanto l'inclusione della sequenza codificante di mCherry-tnpB aumenta la lunghezza del trasposone di ~ 2.000 bp, mentre studi precedenti hanno scoperto che l'escissione del trasposone IS608 è una funzione esponenzialmente decrescente della lunghezza del trasposone23.
Un vantaggio dell'imaging in tempo reale è che, una volta identificate, le cellule che subiscono eventi trasposizionali possono essere ulteriormente monitorate e analizzate per determinare altri parametri caratteristici, come il tasso di crescita, per determinare la distribuzione degli effetti di fitness o il livello di espressione delle proteine accessorie per determinare il loro impatto sull'attività trasposizionale. Ad esempio, nelle cellule TnpB+, le cellule sottoposte a eventi di escissione trasposonale hanno livelli di espressione più elevati di mCherry-TnpB rispetto alla popolazione generale (Figura 4A). Inoltre, per le cellule sottoposte a eventi di escissione (Figura 4B, giallo scuro), le cellule TnpB+ (Figura 4B, in basso) esprimono solo livelli marginalmente più elevati di Venere-TnpA trasposasi rispetto alle cellule TnpB- (Figura 4B, in alto) (TnpB- 158,3 ± 68,2 UA, TnpB+: 193 ± 79,9 UA), che è superiore alla fluorescenza gialla della popolazione generale (Figura 4B , giallo chiaro). Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che la proteina TnpB è responsabile dei livelli più elevati osservati di attività trasposizionale.
Figura 1: Costrutti genetici per l'imaging della dinamica dei trasposoni in tempo reale. (A) Il promotore mCerulean3 è disturbato dal TE, le cui estremità sono affiancate dalle sequenze palindromiche difettose dell'estremità sinistra e dell'estremità destra (LE IP e RE IP). La trasposasi, tnpA (grigio), è espressa da PLtetO1, che è regolato dal repressore del tet (grigio) ed è inducibile con aniidrotetraciclina (aTc). Le sequenze della giunzione Promotore/TE e delle sequenze -10 e -35 del promotore (caselle rosse) e dei siti di scissione TnpA sono mostrate da frecce. (B) Il costrutto TnpB+ è dove mCherry-tnpB è stato trascrizionalmente fuso a venere-tnpA in modo tale che entrambi siano trascritti come un mRNA policistronico, imitando la configurazione naturale di IS608. (C) Dopo l'escissione, il promotore mCerulean3 viene riparato e la cellula mostra fluorescenza blu. La sequenza del promotore ricostituita viene visualizzata sotto il diagramma. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Visualizzazione degli eventi di escissione del trasposone. Il campo visivo di esempio di TnpB+ con le cellule (A) immediatamente prima e (B) dopo aver rilevato eventi di escissione trasposonali mediante fluorescenza blu. Le frecce bianche indicano gli eventi di escissione. La differenza di tempo tra i due fotogrammi è di 20 min. Barra di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: TnpB aumenta il tasso di escissione del trasposone. Il tasso di escissione per le cellule TnpB + (arancione) e TnpB- (blu) cellule. Il tasso medio di tre repliche è mostrato come punti con regioni ombreggiate con un intervallo di confidenza del 95%. I dati sono allineati in modo che le cellule inizino ad asportare a t = 0. Il tasso massimo misurato per le cellule TnpB+ era 5,1 ± 2,4 x 10-2 eventi per cella all'ora, mentre per TnpB- era 1,4 ± 0,48 x 10-2 eventi per cella all'ora. Il tasso medio durante l'intero intervallo mostrato è stato di 2,6 ± 1,8 x 10-2 eventi per cella all'ora per le cellule TnpB + e 5,3 ± 2,9 x 10-3 eventi per cella all'ora per le cellule TnpB-. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Statistiche di espressione proteica per l'astensione delle cellule rispetto alla popolazione cellulare totale. Ogni frame è stato diviso in 64 blocchi uguali e la fluorescenza è stata misurata per le cellule che si asportano all'interno del blocco e per tutte le cellule contenute all'interno del blocco indipendentemente dall'attività di escissione. La probabilità, come tracciata sull'asse y, è misurata come il numero di pixel dell'intensità indicata in ciascun tipo di cella diviso per il numero totale di pixel. La dimensione del blocco per ogni fotogramma è stata impostata su 445 x 445 pixel. (A) Le cellule che subiscono eventi di escissione (rosso scuro) esprimono più TnpB rispetto alla popolazione generale (rosso chiaro). La fluorescenza rossa media per l'assoluzione delle cellule era di 51,3 ± 15,4 UA (rosso scuro), mentre quella per tutte le cellule era di 42,5 ± 7,4 UA (rosso chiaro). (B) I livelli di trasposasi Venere-TnpA sono simili nelle cellule TnpB- (in alto) e TnpB+ (in basso). I set di dati sono normalizzati in modo che le fluorescenze gialle medie della popolazione cellulare totale (giallo chiaro) siano uguali per TnpB+/- a 105,7 UA. Le cellule che sono state identificate come sottoposte a eventi di escissione trasposonale (giallo scuro) mostrano una fluorescenza gialla più elevata rispetto alla popolazione generale, con distribuzioni simili per TnpB- (in alto) e TnpB+ (in basso). Le fluorescenze gialle medie delle popolazioni che si asportano sono TnpB-: 158,3 ± 68,2 UA e TnpB+: 193 ± 79,9 UA. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Filmato supplementare 1: Dinamica in tempo reale dell'escissione IS608 con espressione TnpB. Un filmato che mostra un segmento di 5 ore di dinamiche IS608 in tempo reale; un fotogramma viene catturato ogni 20 minuti. L'escissione IS608 viene visualizzata come lo sviluppo della fluorescenza blu brillante. Le celle mostrate in questo filmato includono l'espressione di TnpB. Clicca qui per scaricare questo file.
Filmato supplementare 2: Dinamica in tempo reale dell'escissione di IS608 senza espressione di TnpB. Un filmato che mostra un segmento di 5 ore di dinamiche IS608 in tempo reale; un fotogramma viene catturato ogni 20 minuti. L'escissione IS608 viene visualizzata come lo sviluppo della fluorescenza blu brillante. Le celle mostrate in questo filmato non includono l'espressione di TnpB. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il metodo unico presentato qui per l'imaging in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili nelle cellule vive è un saggio sensibile in grado di rilevare direttamente la trasposizione nelle cellule vive e in tempo reale e correlare questa attività con l'espressione di proteine accessorie. Mentre il throughput è inferiore a quello che può essere ottenuto con metodi di massa, questo metodo raggiunge misurazioni dettagliate dell'attività TE e dell'espressione proteica nelle singole cellule viventi.
Una varietà di strumenti e tecniche possono essere impiegati per far crescere le cellule direttamente al microscopio per l'imaging in tempo reale. Il metodo utilizzato qui di crescita cellulare su cuscinetti di agarosio ha il vantaggio di essere veloce, economico e facile da eseguire. Un possibile svantaggio, a seconda dello stato di crescita cellulare di interesse, è che le risorse disponibili per sostenere la crescita cellulare nel cuscinetto di agarosio sono limitate, e quindi le cellule esauriranno naturalmente queste risorse e smetteranno di crescere dopo un periodo di tempo relativamente breve (12-24 ore). Di conseguenza, è necessario prestare attenzione a preparare le cellule in crescita allo stato stazionario e inoculare il tampone ad una densità sufficientemente bassa da dare ampio tempo per la misurazione. La microfluidica può essere impiegata per mantenere le cellule in crescita esponenziale allo stato stazionario per lunghi periodi di tempo24, sebbene questi metodi richiedano ulteriori competenze, attrezzature e configurazione per essere efficaci.
A complemento del lavoro più dettagliato del laboratorio Kuhlman19, è illustrato qui che la proteina associata alla famiglia IS200 / IS605 TE TnpB aumenta il tasso di escissione di IS608 fino a cinque volte e che l'aumento dell'escissione è direttamente correlato con livelli di espressione più elevati di TnpB. Questi metodi sono un esempio di tecniche di analisi migliorate che possono aiutare a far luce sull'attività dei trasposoni e sul suo impatto sulle dinamiche mutazionali ed evolutive.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Il sostegno finanziario per questa ricerca è stato fornito da fondi di avvio dell'Università della California.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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