Viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale per quantificare come la proteina accessoria TnpB influenzi la dinamica della trasposizione nelle singole cellule vive di Escherichia coli .
Qui, viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale dell’attività degli elementi trasponibili in cellule batteriche vive utilizzando una suite di reporter fluorescenti accoppiati alla trasposizione. In particolare, dimostra come l’imaging in tempo reale possa essere utilizzato per valutare gli effetti della proteina accessoria TnpB sull’attività dell’elemento trasponibile IS608, un membro della famiglia di elementi trasponibili IS200/IS605. La famiglia IS200/IS605 di elementi trasponibili sono abbondanti elementi mobili collegati con uno degli innumerevoli geni presenti in natura, tnpB. Le omologie di sequenza propongono che la proteina TnpB possa essere un precursore evolutivo dei sistemi CRISPR/Cas9. Inoltre, TnpB ha ricevuto un rinnovato interesse, avendo dimostrato di agire come un’endonucleasi del DNA guidata da RNA simile al Cas. Gli effetti di TnpB sui tassi di trasposizione di IS608 sono quantificati ed è dimostrato che l’espressione di TnpB di IS608 si traduce in ~5 volte maggiore attività di trasposone rispetto alle cellule prive di espressione di TnpB.
Gli elementi trasponibili (TE) sono elementi genetici che si mobilitano all’interno dei loro genomi ospiti per escissione o copia catalizzata seguita da reintegrazione genomica. I TE esistono in tutti i domini della vita e la trasposizione ristruttura il genoma ospite, mutando le regioni codificanti e di controllo1. Ciò genera mutazioni e diversità che svolgono un ruolo importante nell’evoluzione2,3, nello sviluppo 4,5 e in diverse malattie umane6, incluso il cancro7.
Utilizzando nuovi costrutti genetici che accoppiano aspetti dell’attività trasposizionale a reporter fluorescenti, il nostro lavoro precedente ha descritto lo sviluppo di un sistema sperimentale basato sul batterico TE IS608, un rappresentante della diffusa famiglia di TE IS200/IS605, che consente la visualizzazione in tempo reale della trasposizione in singole cellule vive8 (Figura 1). Il sistema TE è mostrato nella Figura 1A. Il TE comprende la sequenza codificante della trasposasi, tnpA, affiancata da ripetizioni palindromiche imperfette (IP) dell’estremità sinistra (LE) e dell’estremità destra (RE), che sono i siti di riconoscimento ed escissione per TnpA. tnpA è espresso utilizzando il promotore PLTetO1, che viene represso dal repressore tet ed è inducibile con aniidrotetraciclina (aTc)9. Il TE divide le sequenze -10 e -35 di un promotore costitutivo PlacIQ1 10 per il reporter blu mCerulean311. Come mostrato nella figura 1C, quando viene indotta la produzione di tnpA, il TE può essere asportato, portando alla ricostituzione del promotore. La cellula prodotta esprime mCerulean3 e fluoresce di blu. L’N-terminale del TnpA è fuso al reporter giallo Venere12, permettendo la misurazione dei livelli di TnpA mediante fluorescenza gialla.
IS608 e altri membri della famiglia di trasposoni IS200/IS605 codificano tipicamente anche un secondo gene della funzione finora sconosciuta, tnpB13. Le proteine TnpB sono una famiglia di nucleasi tremendamente abbondante ma non perfettamente caratterizzata codificata da diversi TE batterici e archeali 14,15, che spesso consistono solo di tnpB 16. Inoltre, studi recenti hanno rinnovato l’interesse per il TnpB scoprendo che il TnpB funziona come un’endonucleasi programmabile guidata da RNA simile a CRISPR / Cas che produrrà rotture di dsDNA o ssDNA in diverse condizioni17,18. Tuttavia, non è chiaro quale ruolo possa svolgere il TnpB nella regolamentazione del recepimento. Per eseguire la visualizzazione in tempo reale degli effetti di TnpB sulla trasposizione IS608, è stata creata una versione del trasposone, inclusa la regione codificante di TnpB con una fusione N-terminale alla proteina fluorescente rossa mCherry.
A complemento di studi più dettagliati a livello di massa eseguiti dal laboratorio Kuhlman19, viene mostrato qui come l’imaging in tempo reale dell’attività dei trasposoni possa rivelare quantitativamente l’impatto di TnpB o di qualsiasi altra proteina accessoria sulla dinamica trasposizionale. Fondendo TnpB a mCherry, i singoli eventi trasposizionali sono identificati dalla fluorescenza blu e correlati con i livelli di espressione di TnpA (fluorescenza gialla) e TnpB (fluorescenza rossa).
Il metodo unico presentato qui per l’imaging in tempo reale dell’attività degli elementi trasponibili nelle cellule vive è un saggio sensibile in grado di rilevare direttamente la trasposizione nelle cellule vive e in tempo reale e correlare questa attività con l’espressione di proteine accessorie. Mentre il throughput è inferiore a quello che può essere ottenuto con metodi di massa, questo metodo raggiunge misurazioni dettagliate dell’attività TE e dell’espressione proteica nelle singole cellule viventi.
<p cl…The authors have nothing to disclose.
Il sostegno finanziario per questa ricerca è stato fornito da fondi di avvio dell’Università della California.
2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
ProScan III Stage | Prior | ||
Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |