IS200/IS605 Ailesi ile İlişkili TnpB'nin Transpozon Aktivitesi Üzerindeki Etkilerinin Gerçek Zamanlı Ölçümü
Summary
Aksesuar protein TnpB’nin bireysel canlı Escherichia coli hücrelerinde transpozisyon dinamiklerini nasıl etkilediğini ölçmek için canlı gerçek zamanlı görüntüleme yapmak için bir protokol özetlenmiştir.
Abstract
Burada, transpozisyona bağlı bir dizi floresan muhabir kullanarak canlı bakteri hücrelerinde transpoze edilebilir element aktivitesinin canlı, gerçek zamanlı görüntülenmesini gerçekleştirmek için bir protokol özetlenmiştir. Özellikle, TnpB aksesuar proteininin, IS200/IS605 transpoze edilebilir element ailesinin bir üyesi olan transpoze edilebilir element IS608’in aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için gerçek zamanlı görüntülemenin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. IS200 / IS605 transpoze edilebilir element ailesi, doğada bulunan en sayısız genden biri olan tnpB ile bağlantılı bol miktarda mobil elementtir. Sekans homolojileri, TnpB proteininin CRISPR / Cas9 sistemlerinin evrimsel bir öncüsü olabileceğini öne sürmektedir. Ek olarak, TnpB, Cas benzeri RNA rehberliğinde DNA endonükleazı olarak hareket ettiği gösterilerek yenilenmiş bir ilgi görmüştür. TnpB’nin IS608’in transpozisyon oranları üzerindeki etkileri ölçülmüştür ve IS608’in TnpB ekspresyonunun, TnpB ekspresyonundan yoksun hücrelere kıyasla ~ 5x artmış transpozon aktivitesi ile sonuçlandığı gösterilmiştir.
Introduction
Transpoze edilebilir elementler (TE’ler), konakçı genomlarında eksizyon veya katalizör kopyalama ve ardından genomik yeniden entegrasyon ile harekete geçen genetik elementlerdir. TE’ler yaşamın tüm alanlarında bulunur ve transpozisyon, konakçı genomunu yeniden yapılandırır, kodlamayı mutasyona uğratır ve bölgelerikontrol eder 1. Bu, evrim2,3, gelişim 4,5 ve kanser7 dahil olmak üzere çeşitli insan hastalıklarındaönemli bir rol oynayan mutasyonlar ve çeşitlilik üretir.
Transpozisyonel aktivitenin yönlerini floresan muhabirlere bağlayan yeni genetik yapıları kullanarak, önceki çalışmamız, yaygın IS200 / IS605 TE’ler ailesinin bir temsilcisi olan bakteriyel TE IS608’e dayanan deneysel bir sistemin geliştirilmesini tanımladı ve bu da bireysel canlı hücrelerde transpozisyonun gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi8 (Şekil 1). TE sistemi Şekil 1A’da gösterilmiştir. TE, TnpA’nın tanıma ve eksizyon bölgeleri olan Sol Uç (LE) ve Sağ Uç (RE) kusurlu palindromik tekrarlar (IP’ler) ile çevrili transpozaz kodlama dizisi tnpA’yı içerir. tnpA, tet baskılayıcı tarafından bastırılan ve anhidrotetrasiklin (aTc)9 ile indüklenebilen promotör PLTetO1 kullanılarak ifade edilir. TE, mavi muhabir mCerulean3 11 için kurucu bir PlacIQ1 promotörü 10’un –10 ve -35 dizilerini böler. Şekil 1C’de gösterildiği gibi, tnpA üretimi indüklendiğinde, TE, promotör resulanmasına yol açacak şekilde eksize edilebilir. Üretilen hücre mCerulean3 eksprese eder ve mavi floresan yapar. TnpA’nın N-terminüsü, sarı muhabir Venüs12 ile kaynaştırılır ve TnpA seviyelerinin sarı floresan ile ölçülmesine izin verir.
IS608 ve IS200/IS605 transpozon ailesinin diğer üyeleri de tipik olarak şimdiye kadar bilinmeyen fonksiyonun ikinci bir geni olan tnpB13’ü kodlar. TnpB proteinleri, genellikle sadece tnpB16’dan oluşan birkaç bakteri ve arkeal TE’ler14,15 tarafından kodlanan muazzam derecede bol fakat kusurlu bir şekilde karakterize edilmiş bir nükleaz ailesidir. Ayrıca, son zamanlarda yapılan çalışmalar, TnpB’nin çeşitli koşullar altında dsDNA veya ssDNA kırılmaları verecek CRISPR / Cas benzeri programlanabilir RNA rehberliğinde endonükleaz olarak işlev gördüğünü bularak TnpB’ye olan ilgiyi yenilemiştir17,18. Bununla birlikte, TnpB’nin transpozisyonun düzenlenmesinde hangi rolü oynayabileceği belirsizliğini korumaktadır. TnpB’nin IS608 transpozisyonu üzerindeki etkilerinin gerçek zamanlı görselleştirmesini gerçekleştirmek için, kırmızı floresan protein mCherry’ye N-terminal füzyonu ile TnpB’nin kodlama bölgesi de dahil olmak üzere transpozonun bir versiyonu oluşturuldu.
Kuhlman laboratuvarı19 tarafından gerçekleştirilen daha ayrıntılı toplu düzey çalışmaları tamamlayarak, transpozon aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesinin TnpB’nin veya diğer aksesuar proteinlerin transpozisyonel dinamikler üzerindeki etkisini nicel olarak nasıl ortaya çıkarabileceği burada gösterilmiştir. TnpB’yi mCherry ile kaynaştırarak, bireysel transpozisyonel olaylar mavi floresan ile tanımlanır ve TnpA (sarı floresan) ve TnpB (kırmızı floresan) ekspresyon seviyeleri ile ilişkilendirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Canlı hücrelerde transpoze edilebilir element aktivitesinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için burada sunulan benzersiz yöntem, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak transpozisyonu doğrudan tespit edebilen ve bu aktiviteyi aksesuar proteinlerin ekspresyonu ile ilişkilendirebilen hassas bir testtir. Verim, toplu yöntemlerle elde edilebilenden daha düşük olsa da, bu yöntem bireysel canlı hücrelerde TE aktivitesinin ve protein ekspresyonunun ayrıntılı ölçümlerini sağlar.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma için finansal destek, Kaliforniya Üniversitesi’nden başlangıç fonları tarafından sağlandı.
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
