Summary
Es wird ein Protokoll skizziert, um Live-Echtzeit-Bildgebung durchzuführen, um zu quantifizieren, wie das akzessorische Protein TnpB die Dynamik der Transposition in einzelnen lebenden Escherichia coli-Zellen beeinflusst.
Abstract
Hier wird ein Protokoll skizziert, um eine Live-Echtzeit-Bildgebung der transponierbaren Elementaktivität in lebenden Bakterienzellen unter Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Reportern durchzuführen, die mit der Transposition gekoppelt sind. Insbesondere wird gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung verwendet werden kann, um die Auswirkungen des akzessorischen Proteins TnpB auf die Aktivität des transponierbaren Elements IS608, einem Mitglied der IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente, zu bewerten. Die IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente sind reichlich vorhandene mobile Elemente, die mit einem der unzähligen Gene in der Natur, tnpB, verbunden sind. Sequenzhomologien deuten darauf hin, dass das TnpB-Protein ein evolutionärer Vorläufer von CRISPR/Cas9-Systemen sein könnte. Darüber hinaus hat TnpB erneut Interesse geweckt, da gezeigt wurde, dass es als Cas-ähnliche RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease wirkt. Die Auswirkungen von TnpB auf die Transpositionsraten von IS608 werden quantifiziert, und es wird gezeigt, dass die Expression von TnpB von IS608 zu ~5x erhöhter Transposonaktivität im Vergleich zu Zellen ohne TnpB-Expression führt.
Introduction
Transposable Elements (TEs) sind genetische Elemente, die innerhalb ihres Wirtsgenoms durch Exzision mobilisieren oder kopieren und anschließend genomische Reintegration katalysieren. TEs existieren in allen Lebensbereichen, und die Transposition strukturiert das Wirtsgenom um und mutiert kodierende und Kontrollregionen1. Dies erzeugt Mutationen und Diversität, die eine wichtige Rolle in der Evolution2,3, der Entwicklung4,5 und mehreren menschlichen Krankheiten6, einschließlich Krebs7, spielen.
Unter Verwendung neuartiger genetischer Konstrukte, die Aspekte der Transpositionsaktivität an fluoreszierende Reporter koppeln, beschrieben unsere früheren Arbeiten die Entwicklung eines experimentellen Systems basierend auf dem bakteriellen TE IS608, einem Vertreter der weit verbreiteten IS200/IS605-Familie von TEs, das die Echtzeitvisualisierung der Transposition in einzelnen lebenden Zellen ermöglicht8 (Abbildung 1). Das TE-System ist in Abbildung 1A dargestellt. Die TE umfasst die Transposase-kodierende Sequenz, tnpA, flankiert von Left End (LE) und Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IPs), die die Erkennungs- und Exzisionsstellen für TnpA sind. tnpA wird unter Verwendung des Promotors PLTetO1 exprimiert, der durch den Tet-Repressor unterdrückt wird und mit Anhydrotetracyclin (aTc)9 induzierbar ist. Der TE teilt die -10- und -35-Sequenzen eines konstitutiven PlacI Q1-Promotors10 für den blauen Reporter mCerulean3 11 auf. Wie in Abbildung 1C gezeigt, kann der TE herausgeschnitten werden, wenn die Produktion von tnpA induziert wird, was zu einer Rekonstitution des Promotors führt. Die produzierte Zelle exprimiert mCerulean3 und fluoresziert blau. Der N-Terminus von TnpA ist mit dem gelben Reporter Venus12 verschmolzen, was die Messung der TnpA-Spiegel durch gelbe Fluoreszenz ermöglicht.
IS608 und andere Mitglieder der IS200/IS605-Familie von Transposons kodieren typischerweise auch für ein zweites Gen der bisher unbekannten Funktion, tnpB13. Die TnpB-Proteine sind eine enorm häufige, aber unvollkommen charakterisierte Familie von Nukleasen, die von mehreren bakteriellen und archaealen TEs14,15 kodiert werden, die oft nur aus tnpB16 bestehen. Darüber hinaus haben neuere Studien das Interesse an TnpB erneuert, indem sie festgestellt haben, dass TnpB als CRISPR / Cas-ähnliche programmierbare RNA-gesteuerte Endonuklease fungiert, die unter verschiedenen Bedingungen entweder dsDNA- oder ssDNA-Brüche erzeugt17,18. Es bleibt jedoch unklar, welche Rolle TnpB bei der Regulierung der Umsetzung spielen könnte. Um die Auswirkungen von TnpB auf die IS608-Transposition in Echtzeit zu visualisieren, wurde eine Version des Transposons, einschließlich der kodierenden Region von TnpB mit einer N-terminalen Fusion zum rot fluoreszierenden Protein mCherry, erstellt.
Ergänzend zu detaillierteren Bulk-Level-Studien, die vom Kuhlman-Labor19 durchgeführt wurden, wird hier gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung der Transposonaktivität den Einfluss von TnpB oder anderen akzessorischen Proteinen auf die Transpositionsdynamik quantitativ aufdecken kann. Durch die Fusion von TnpB zu mCherry werden die einzelnen transpositionalen Ereignisse durch blaue Fluoreszenz identifiziert und mit Expressionsniveaus von TnpA (gelbe Fluoreszenz) und TnpB (rote Fluoreszenz) korreliert.
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Protocol
1. Vorbereitung von Bakterienkulturen
- E. coli-Stamm MG1655 mit Plasmidtransposon-Konstrukten (zuvor beschrieben in Kim et al.8) über Nacht in LB mit den entsprechenden Antibiotika (25 μg/ml Kanamycin, siehe Materialtabelle) bei 37 °C züchten.
HINWEIS: Die Sequenzen der verwendeten Konstrukte und die zugehörigen Sequenzen sind als GenBank20-Zugangsnummern OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 und OP717085 verfügbar. - Um ein exponentielles Wachstum im stationären Zustand zu erreichen, verdünnen Sie Kulturen ≥100-fach in das M63-Medium (100 mMKH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg / ml Thiamin [Vitamin B1]), ergänzt mit einer Kohlenstoffquelle (0,5% w/v Glukose hier) und geeigneten Antibiotika (siehe Tabelle der Materialien).
- Züchten Sie Kulturen bei 37 °C, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD600) ~0,2 erreicht. Die Kulturen sind einsatzbereit.
2. Objektträgervorbereitung
- Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie M63 mit 0,5% w/v Glucose und 1,5% w/v Agarose in der Mikrowelle kochen, um die Agarose zu schmelzen und sicherzustellen, dass sie vollständig geschmolzen und gut gemischt ist.
- Lassen Sie die Mischung auf ~55 °C abkühlen, bevor Sie Antibiotika und Induktoren (25 μg/ml Kanamycin und 10 ng/μL Anhydrotetracyclin [aTc], siehe Materialtabelle) hinzufügen.
- Legen Sie einen Objektträger auf die Werkbank. Stapeln Sie zwei weitere Folien senkrecht zur ersten und legen Sie eine weitere oben parallel zur unteren Folie auf. Stellen Sie sicher, dass zwischen den unteren und oberen Folien ein Spalt vorhanden ist, der einer Objektträgerstärke entspricht. Pipettieren Sie ~1 mL der M63-Agarosemischung langsam in diesen Spalt zwischen den Objektträgern, um ein kleines Gelquadrat zu erzeugen.
- Sobald das Gel erstarrt ist (~10-15 min), schieben Sie den oberen Objektträger, um ihn zu entfernen. Schneiden Sie das Agarosettenkissen mit einer Rasierklinge oder einem Messer ab. Dann pipetten Sie 2,5 μL der Kultur (Schritt 1.3) und legen Sie das Deckglas darauf.
- Verschließen Sie den Raum zwischen Objektträger und Deckglas mit Epoxidharz (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Epoxidharz trocknen und die Zellen setzen sich mindestens 1 h bei 37 °C auf dem Agarosepad ab.
3. Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie
- Die vorbereitete Probe (Schritt 1.3) wird auf ein Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) in einer auf 37 °C erhitzten und gehaltenen Umgebung gelegt.
- Stellen Sie die Belichtungszeiten entsprechend der Kamera ein, die für die Bildaufnahme verwendet wird. Stellen Sie die Beleuchtungsintensität ein, um das Photobleichen zu minimieren.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde eine Expositionszeit von 2 s für jede Wellenlänge verwendet. - Suchen Sie für jede Wellenlänge ein Sichtfeld (FOV) mit minimaler Fluoreszenz. Erfassen Sie Bilder, die während der Analyse für die Hintergrundsubtraktion verwendet werden sollen.
- Stellen Sie die Belichtungszeiten entsprechend der Kamera ein, die für die Bildaufnahme verwendet wird. Stellen Sie die Beleuchtungsintensität ein, um das Photobleichen zu minimieren.
- Richten Sie ein Protokoll ein, um Bilder in einem Raster bei verschiedenen Wellenlängen und in regelmäßigen Zeitintervallen zu erfassen.
- Kodieren Sie Zeitrafferaufnahmen in das Protokoll. Stellen Sie die Erfassungsfrequenz auf das gewünschte Zeitintervall (hier 20 min) und die gesamte Zeitrafferdauer auf die gewünschte Länge (24 h) ein.
- Kodieren Sie geeignete Wellenlängen in das Protokoll (abhängig vom verwendeten Konstrukt).
HINWEIS: Der mCherry-Anregungspeak liegt bei 587 nm und der Emissionspeak bei 610 nm21; mVenus liegt bei 515 nm und 527 nm12, während mCerulean3 bei 433 nm und 475 nm11 liegt. - Legen Sie die Rastergröße fest, die zwischen der gewünschten Anzahl von FOVs erfasst werden soll.
HINWEIS: Die hier gezeigten repräsentativen Daten verwendeten 8 x 8 FOVs.
4. Bildanalyse
- Führen Sie die Hintergrundsubtraktion für jeden Farbkanal durch, indem Sie die entsprechenden Hintergrundbilder verwenden, die in Schritt 3.1.2 erfasst wurden. Für alle Analyseschritte verwenden wir Standardmodule der Open-Source-Plattform Fiji22 (siehe Materialtabelle).
- Nähern Sie sich der Gesamtpopulation zu jedem Zeitpunkt an, indem Sie den mCerulean-Kanal schwellieren und den Schwellenwertbereich durch die durchschnittliche Zellfläche dividieren.
- Um die eindeutigen Exzisionsereignisse zu zählen, nehmen Sie die Zeitableitung des mCerulean3-Kanals. Tun Sie dies, indem Sie aufeinanderfolgende Bilder im mCerulean3-Kanal subtrahieren. Die Exzisionsereignisse werden in der Zeitableitung als heller Fluoreszenzblitz detektiert.
- Schwelle des Stapels von Exzisionsereignissen, um unerwünschte Fluoreszenz zu eliminieren. Beachten Sie, dass dieser Prozess Teile der Exzisionen selbst ausschließt. Um dies zu beheben, erweitern Sie die Bilder, um die Exzisionen auf ihre ursprüngliche Größe wiederherzustellen.
HINWEIS: Analysen mit ähnlichen Schwellenwert- und Bildanalysetechniken können auch an den anderen Fluoreszenzkanälen durchgeführt werden (z. B. Korrelation von Exzisionsereignissen mit Transposase-TnpA [gelbe Venusfluoreszenz] und TnpB [rote mCherry-Fluoreszenz].
- Schwelle des Stapels von Exzisionsereignissen, um unerwünschte Fluoreszenz zu eliminieren. Beachten Sie, dass dieser Prozess Teile der Exzisionen selbst ausschließt. Um dies zu beheben, erweitern Sie die Bilder, um die Exzisionen auf ihre ursprüngliche Größe wiederherzustellen.
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Representative Results
Diese Methode zur Visualisierung der Transposonaktivität in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht bei geringerem Durchsatz als Massenfluoreszenzmessungen die direkte Visualisierung der Transposonaktivität in einzelnen lebenden Zellen. Transposon-Exzisionsereignisse führen zur Rekonstitution des Promotors für mCerulean3 (Abbildung 1), was die Identifizierung von Zellen ermöglicht, die Transposonaktivität durch hellblaue Fluoreszenz durchlaufen (Abbildung 2, TnpB+: Supplementary Movie 1 und TnpB-: Supplementary Movie 2).
Es wurde festgestellt, dass Zellen, die das akzessorische Protein TnpB exprimieren (Abbildung 3, orange), 4-5 mal höhere Transposonaktivität aufweisen als solche, die dies nicht tun (Abbildung 3, blau), was mit den detaillierteren Bulk-Level-Studien übereinstimmt19. Dies ist besonders bemerkenswert, da die Einbeziehung der kodierenden Sequenz von mCherry-tnpB die Länge des Transposons um ~ 2.000 bp erhöht, während frühere Studien gezeigt haben, dass die IS608-Transposon-Exzision eine exponentiell abnehmende Funktion der Transposonlänge23 ist.
Ein Vorteil der Echtzeit-Bildgebung besteht darin, dass nach der Identifizierung Zellen, die transpositionale Ereignisse durchlaufen, weiter verfolgt und analysiert werden können, um andere charakteristische Parameter wie die Wachstumsrate zu bestimmen, um die Verteilung von Fitnesseffekten oder das Expressionsniveau von akzessorischen Proteinen zu bestimmen, um ihren Einfluss auf die Transpositionsaktivität zu bestimmen. Zum Beispiel haben in TnpB+-Zellen Zellen, die Transposon-Exzisionsereignisse durchlaufen, höhere Expressionsniveaus von mCherry-TnpB als die allgemeine Bevölkerung (Abbildung 4A). Darüber hinaus exprimieren TnpB+-Zellen (Abbildung 4B, dunkelgelb) für Zellen, die Exzisionsereignisse durchlaufen (Abbildung 4B, dunkelgelb), nur geringfügig höhere Venus-TnpA-Transposase-Spiegel als TnpB-Zellen (Abbildung 4B, oben) (TnpB- 158,3 ± 68,2 AE, TnpB+: 193 ± 79,9 AE), was höher ist als die gelbe Fluoreszenz der Allgemeinbevölkerung (Abbildung 4B) , hellgelb). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass das TnpB-Protein für die beobachteten höheren Transpositionsaktivitäten verantwortlich ist.
Abbildung 1: Genetische Konstrukte zur Abbildung der Echtzeit-Transposondynamik. (A) Der mCerulean3-Promotor wird durch den TE gestört, dessen Enden vom linken und rechten Ende fehlerhaften palindromischen Sequenzen (LE IP und RE IP) flankiert werden. Die Transposase, tnpA (grau), wird aus PLtetO1 exprimiert, das durch den tet-Repressor (grau) reguliert wird und mit Anhydrotetracyclin (aTc) induzierbar ist. Die Sequenzen der Promoter/TE-Übergangs- und Promotor-10- und -35-Sequenzen (rote Kästchen) sowie der TnpA-Spaltungsstellen sind durch Pfeile dargestellt. (B) Beim TnpB+-Konstrukt wurde mCherry-tnpB transkriptionell mit Venus-tnpA verschmolzen, so dass beide als polycistronische mRNA transkribiert werden, die die natürliche Konfiguration von IS608 nachahmt. (C) Nach der Exzision wird der mCerulean3-Promotor repariert und die Zelle weist eine blaue Fluoreszenz auf. Die rekonstituierte Promotorsequenz ist unterhalb des Diagramms dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Visualisierung von Transposon-Exzisionsereignissen. Das Beispielsichtfeld von TnpB+ mit Zellen (A) unmittelbar vor und (B) nach Detektion von Transposon-Exzisionsereignissen durch blaue Fluoreszenz. Weiße Pfeile zeigen Exzisionsereignisse an. Der Zeitunterschied zwischen den beiden Frames beträgt 20 min. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: TnpB erhöht die Transposon-Exzisionsrate. Die Exzisionsrate für TnpB+ Zellen (orange) und TnpB- (blau) Zellen. Die mittlere Rate von drei Replikaten wird als Punkte mit schattierten Bereichen mit einem Konfidenzintervall von 95 % angezeigt. Die Daten werden so ausgerichtet, dass Zellen bei t = 0 mit dem Ausschneiden beginnen. Die maximale gemessene Rate für TnpB+-Zellen betrug 5,1 ± 2,4 x 10-2 Ereignisse pro Zelle pro Stunde, während für TnpB- 1,4 ± 0,48 x 10-2 Ereignisse pro Zelle pro Stunde betrug. Die durchschnittliche Rate über das gesamte gezeigte Intervall betrug 2,6 ± 1,8 x 10-2 Ereignisse pro Zelle und Stunde für TnpB+-Zellen und 5,3 ± 2,9 x 10-3 Ereignisse pro Zelle pro Stunde für TnpB-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Proteinexpressionsstatistik für die Exzision von Zellen im Vergleich zur gesamten Zellpopulation. Jeder Rahmen wurde in 64 gleiche Blöcke unterteilt, und die Fluoreszenz wurde für Zellen gemessen, die innerhalb des Blocks exzisierten, und für alle Zellen, die innerhalb des Blocks enthalten waren, unabhängig von der Exzisionsaktivität. Die Wahrscheinlichkeit, wie sie auf der y-Achse dargestellt wird, wird als Anzahl der Pixel der angegebenen Intensität in jedem Zelltyp dividiert durch die Gesamtzahl der Pixel gemessen. Die Blockgröße für jeden Frame wurde auf 445 x 445 Pixel festgelegt. (A) Die Zellen, die Exzisionsereignisse unterliegen (dunkelrot), exprimieren mehr TnpB als die Allgemeinbevölkerung (hellrot). Die durchschnittliche rote Fluoreszenz für Exzisionszellen betrug 51,3 ± 15,4 AE (dunkelrot), während die für alle Zellen 42,5 ± 7,4 AE (hellrot) betrug. (B) Venus-TnpA-Transposase-Spiegel sind in TnpB- (oben) und TnpB+ (unten) Zellen ähnlich. Die Datensätze werden so normalisiert, dass die mittleren gelben Fluoreszenzen der gesamten Zellpopulation (hellgelb) für TnpB+/- bei 105,7 AE gleich sind. Die Zellen, bei denen Transposon-Exzisionsereignisse (dunkelgelb) identifiziert wurden, weisen eine höhere gelbe Fluoreszenz auf als die Allgemeinbevölkerung, mit ähnlichen Verteilungen für TnpB- (oben) und TnpB + (unten). Die mittleren gelben Fluoreszenzen der exciszierenden Populationen sind TnpB-: 158,3 ± 68,2 AE und TnpB+: 193 ± 79,9 AE. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzender Film 1: Echtzeitdynamik der IS608-Exzision mit TnpB-Ausdruck. Ein Film, der ein 5-Stunden-Segment der Echtzeit-IS608-Dynamik zeigt; Alle 20 Minuten wird ein Bild erfasst. Die IS608-Exzision wird als Entwicklung einer hellblauen Fluoreszenz visualisiert. Die in diesem Film gezeigten Zellen enthalten den Ausdruck TnpB. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzender Film 2: Echtzeitdynamik der IS608-Exzision ohne TnpB-Ausdruck. Ein Film, der ein 5-Stunden-Segment der Echtzeit-IS608-Dynamik zeigt; Alle 20 Minuten wird ein Bild erfasst. Die IS608-Exzision wird als Entwicklung einer hellblauen Fluoreszenz visualisiert. Die in diesem Film gezeigten Zellen enthalten nicht den Ausdruck von TnpB. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die hier vorgestellte einzigartige Methode zur Echtzeit-Bildgebung der Aktivität transponierbarer Elemente in lebenden Zellen ist ein empfindlicher Assay, der die Transposition in lebenden Zellen und in Echtzeit direkt nachweisen und diese Aktivität mit der Expression akzessorischer Proteine korrelieren kann. Während der Durchsatz geringer ist, als dies mit Massenmethoden erreicht werden kann, erreicht diese Methode detaillierte Messungen der TE-Aktivität und Proteinexpression in einzelnen lebenden Zellen.
Eine Vielzahl von Werkzeugen und Techniken kann eingesetzt werden, um Zellen direkt am Mikroskop für die Echtzeit-Bildgebung zu züchten. Die hier verwendete Methode des Zellwachstums auf Agarosetten hat den Vorteil, dass sie schnell, kostengünstig und einfach durchzuführen ist. Ein möglicher Nachteil, abhängig vom interessierenden Zellwachstumszustand, besteht darin, dass die verfügbaren Ressourcen zur Unterstützung des Zellwachstums im Agarosenpolster begrenzt sind und die Zellen daher diese Ressourcen auf natürliche Weise erschöpfen und nach relativ kurzer Zeit (12-24 h) aufhören zu wachsen. Folglich muss darauf geachtet werden, die Zellen auf stationäres Wachstum vorzubereiten und das Pad mit einer ausreichend niedrigen Dichte zu impfen, um genügend Zeit für die Messung zu haben. Mikrofluidik kann eingesetzt werden, um Zellen über längere Zeiträume in stationärem exponentiellem Wachstum zu halten24, obwohl diese Methoden zusätzliches Fachwissen, Ausrüstung und Aufbau erfordern, um effektiv zu sein.
Ergänzend zu detaillierteren Arbeiten aus dem Kuhlman-Labor19 wird hier veranschaulicht, dass das IS200/IS605 TE-assoziierte Protein TnpB die Rate der IS608-Exzision um das bis zu Fünffache erhöht und dass eine erhöhte Exzision direkt mit höheren Expressionsniveaus von TnpB korreliert. Diese Methoden sind ein Beispiel für verbesserte Assay-Techniken, die helfen können, die Transposonaktivität und ihre Auswirkungen auf die Mutations- und Evolutionsdynamik zu beleuchten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Finanzielle Unterstützung für diese Forschung wurde durch Startkapital der University of California bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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