Summary
Um protocolo é delineado para realizar imagens ao vivo em tempo real para quantificar como a proteína acessória TnpB afeta a dinâmica de transposição em células vivas individuais de Escherichia coli .
Abstract
Aqui, um protocolo é delineado para realizar imagens ao vivo e em tempo real da atividade de elementos transponíveis em células bacterianas vivas usando um conjunto de repórteres fluorescentes acoplados à transposição. Em particular, demonstra como a imagem em tempo real pode ser usada para avaliar os efeitos da proteína acessória TnpB na atividade do elemento transponível IS608, um membro da família de elementos transponíveis IS200/IS605. A família de elementos transponíveis IS200/IS605 são elementos móveis abundantes conectados a um dos mais inúmeros genes encontrados na natureza, o tnpB. As homologias de sequência propõem que a proteína TnpB pode ser um precursor evolutivo dos sistemas CRISPR/Cas9. Além disso, o TnpB recebeu interesse renovado, tendo sido mostrado para atuar como uma endonuclease de DNA guiada por RNA semelhante a Cas. Os efeitos do TnpB sobre as taxas de transposição do IS608 são quantificados, e demonstra-se que a expressão do TnpB do IS608 resulta em ~5x maior atividade de transposon em comparação com as células sem expressão do TnpB.
Introduction
Elementos transponíveis (TEs) são elementos genéticos que se mobilizam dentro de seus genomas hospedeiros por excisão ou catalisação de cópia seguida de reintegração genômica. Os TEs existem em todos os domínios da vida, e a transposição reestrutura o genoma do hospedeiro, mutando regiões de codificação e controle1. Isso gera mutações e diversidade que desempenham um papel importante na evolução2,3, desenvolvimento4,5 e diversas doenças humanas6, incluindo o câncer7.
Usando novas construções genéticas que acoplam aspectos da atividade transposicional a repórteres fluorescentes, nosso trabalho anterior descreveu o desenvolvimento de um sistema experimental baseado na bactéria TE IS608, um representante da ampla família de TEs IS200/IS605, que permite a visualização em tempo real da transposição em células vivas individuais 8 (Figura 1). O sistema TE é exibido na Figura 1A. O TE compreende a sequência de codificação da transposase, tnpA, ladeada por repetições palindrômicas imperfeitas (IPs) da extremidade esquerda (LE) e da extremidade direita (RE), que são os locais de reconhecimento e excisão para TnpA. O tnpA é expresso usando o promotor PLTetO1, que é reprimido pelo repressor tet e é induzível com anidrotetraciclina (aTc)9. O TE divide as sequências -10 e -35 de um promotor constitutivo PlacIQ1 10 para o repórter azul mCerulean311. Como mostra a Figura 1C, quando a produção de tnpA é induzida, o TE pode ser extirpado, levando à reconstituição do promotor. A célula produzida expressa mCerulean3 e fluoresce azul. O N-terminal de TnpA é fundido ao repórter amarelo Vênus12, permitindo a medição dos níveis de TnpA por fluorescência amarela.
IS608 e outros membros da família de transposons IS200/IS605 também codificam tipicamente um segundo gene da função até agora desconhecida, tnpB13. As proteínas TnpB são uma família de nucleases tremendamente abundante, mas imperfeitamente caracterizadas, codificadas por vários TEs bacterianos e arqueais 14,15, que muitas vezes consistem apenas em tnpB 16. Além disso, estudos recentes renovaram o interesse no TnpB ao descobrir que o TnpB funciona como uma endonuclease guiada por RNA programável semelhante à CRISPR/Cas que produzirá quebras de dsDNA ou ssDNA sob diversas condições17,18. No entanto, ainda não está claro qual o papel que o TnpB pode desempenhar na regulação da transposição. Para realizar a visualização em tempo real dos efeitos do TnpB na transposição do IS608, foi criada uma versão do transposon, incluindo a região codificadora do TnpB com uma fusão N-terminal para a proteína fluorescente vermelha mCherry.
Complementando estudos mais detalhados em nível de volume realizados pelo laboratório Kuhlman19, é mostrado aqui como a imagem em tempo real da atividade do transposon pode revelar quantitativamente o impacto do TnpB ou de quaisquer outras proteínas acessórias na dinâmica transposicional. Ao fundir TnpB a mCherry, os eventos transposicionais individuais são identificados por fluorescência azul e correlacionados com os níveis de expressão de TnpA (fluorescência amarela) e TnpB (fluorescência vermelha).
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Protocol
1. Preparação de culturas bacterianas
- Cultivar a cepa MG1655 de E. coli com construções de transposon plasmídico (descritas anteriormente em Kim et al.8) durante a noite em LB com os antibióticos apropriados (25 μg/mL de canamicina, ver Tabela de Materiais) a 37 °C.
NOTA: As sequências das construções utilizadas e as sequências relacionadas estão disponíveis como números de adesão do GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 e OP717085. - Para alcançar o crescimento exponencial em estado estacionário, diluir as culturas ≥100 vezes no meio M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg/mL de tiamina [vitamina B1]) suplementada com uma fonte de carbono (0,5% p/v de glicose aqui) e antibióticos apropriados (ver Tabela de Materiais).
- Cultivar culturas a 37 °C até que a densidade óptica a 600 nm (OD600) atinja ~0,2. As culturas estão prontas para uso.
2. Preparação de slides
- Prepare uma lâmina fervendo M63 com 0,5% p/v de glicose e 1,5% p/v de agarose no micro-ondas para derreter a agarose e garantir que ela esteja completamente derretida e bem misturada.
- Deixe a mistura arrefecer a ~55 °C antes de adicionar antibióticos e indutores (25 μg/ml de canamicina e 10 ng/μL de anidrotetraciclina [aTc], ver Tabela de Materiais).
- Coloque uma lâmina de microscópio na bancada de trabalho. Empilhe mais dois slides perpendiculares ao primeiro e coloque outro em cima, paralelo ao slide inferior. Verifique se há um espaço igual a uma espessura de slide entre os slides inferior e superior. Pipeta ~1 mL da mistura de agarose M63 nesta lacuna entre as lâminas lentamente para criar um pequeno quadrado de gel.
- Uma vez que o gel tenha solidificado (~ 10-15 min), deslize a parte superior para removê-lo. Apare a almofada de agarose com uma lâmina de barbear ou faca. Em seguida, pipetar 2,5 μL da cultura (passo 1.3) e colocar a tampa por cima.
- Sele o espaço entre a lâmina e a folha de cobertura com epóxi (consulte Tabela de materiais). Deixe secar o epóxi e as células se depositem na almofada de agarose durante, pelo menos, 1 h a 37 °C.
3. Microscopia de fluorescência Timelapse
- Colocar a amostra preparada (etapa 1.3) num microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais) num ambiente aquecido e mantido a 37 °C.
- Defina os tempos de exposição apropriados para a câmera usada para aquisição de imagem. Ajuste a intensidade da iluminação para minimizar o fotobranqueamento.
NOTA: Um tempo de exposição de 2 s para cada comprimento de onda foi utilizado para o presente estudo. - Para cada comprimento de onda, encontre um Campo de Visão (FOV) contendo fluorescência mínima. Adquira imagens para usar durante a análise para subtração de fundo.
- Defina os tempos de exposição apropriados para a câmera usada para aquisição de imagem. Ajuste a intensidade da iluminação para minimizar o fotobranqueamento.
- Configure um protocolo para adquirir imagens em uma grade em diferentes comprimentos de onda e em intervalos de tempo regulares.
- Codifique a fotografia de timelapse no protocolo. Defina a frequência de aquisição para o intervalo de tempo desejado (20 min aqui) e a duração total do timelapse para o comprimento desejado (24 h).
- Codifique comprimentos de onda apropriados no protocolo (dependendo da construção usada).
NOTA: O pico de excitação mCherry está a 587 nm e o pico de emissão a 610 nm21; mVenus está em 515 nm e 527 nm12, enquanto mCerulean3 está em 433 nm e 475 nm11. - Defina o tamanho da grade a ser capturado entre o número desejado de FOVs.
NOTA: Os dados representativos mostrados aqui usaram 8 x 8 FOVs.
4. Análise de imagem
- Execute a subtração de plano de fundo em cada canal de cor usando as respectivas imagens de plano de fundo adquiridas na etapa 3.1.2. Para todas as etapas de análise, usamos módulos padrão na plataforma de código aberto Fiji22 (consulte Tabela de Materiais).
- Aproxime a população total em cada ponto no tempo, limitando o canal mCerulean e dividindo a área limiar pela área celular média.
- Para contar os eventos de excisão exclusivos, pegue a derivada de tempo do canal mCerulean3. Execute isso subtraindo imagens sucessivas no canal mCerulean3. Os eventos de excisão serão detectados na derivada do tempo como um flash brilhante de fluorescência.
- Limite da pilha de eventos de excisão para eliminar a fluorescência indesejada. Observe que esse processo limitará partes das próprias excisão. Para corrigir isso, dilate as imagens para restaurar as excisões aos seus tamanhos originais.
NOTA: Análises usando técnicas semelhantes de limiares e análise de imagem também podem ser realizadas nos outros canais de fluorescência (por exemplo, correlacionar eventos de excisão com níveis de transposase TnpA [fluorescência amarela de Vênus] e TnpB [fluorescência mCherry vermelha].
- Limite da pilha de eventos de excisão para eliminar a fluorescência indesejada. Observe que esse processo limitará partes das próprias excisão. Para corrigir isso, dilate as imagens para restaurar as excisões aos seus tamanhos originais.
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Representative Results
Este método de visualização da atividade de transposon em células vivas por microscopia de fluorescência, embora tenha menor rendimento do que as medições de fluorescência em massa, permite a visualização direta da atividade de transposon em células vivas individuais. Os eventos de excisão do transposon resultam na reconstituição do promotor para mCerulean3 (Figura 1), permitindo a identificação de células submetidas à atividade do transposon por fluorescência azul brilhante (Figura 2, TnpB+: Filme Suplementar 1 e TnpB-: Filme Suplementar 2).
Verificou-se que as células que expressam a proteína acessória TnpB (Figura 3, laranja) experimentam níveis 4-5 vezes maiores de atividade de transposon em comparação com aquelas que não o fazem (Figura 3, azul), consistente com os estudos mais detalhados em nível de volume19. Isto é particularmente notável como a inclusão da sequência de codificação de mCherry-tnpB aumenta o comprimento do transposon em ~ 2.000 pb, enquanto estudos anteriores descobriram que a excisão de transposon IS608 é uma função exponencialmente decrescente do comprimento do transposon23.
Uma vantagem da imagem em tempo real é que, uma vez identificadas, as células submetidas a eventos transposicionais podem ser rastreadas e analisadas para determinar outros parâmetros característicos, como a taxa de crescimento, para determinar a distribuição dos efeitos de aptidão ou o nível de expressão de proteínas acessórias para determinar seu impacto na atividade transposicional. Por exemplo, em células TnpB+, células submetidas a eventos de excisão de transposon têm níveis de expressão mais elevados de mCherry-TnpB do que a população em geral (Figura 4A). Além disso, para as células submetidas a eventos de excisão (Figura 4B, amarelo escuro), as células TnpB+ (Figura 4B, inferior) expressam apenas níveis marginalmente mais elevados de transposase Vênus-TnpA do que as células TnpB- (Figura 4B, acima) (TnpB- 158,3 ± 68,2 UA, TnpB+: 193 ± 79,9 UA), que é maior do que a fluorescência amarela da população em geral (Figura 4B , amarelo claro). Tomados em conjunto, esses dados sugerem que a proteína TnpB é responsável pelos níveis mais altos observados de atividade transposicional.
Figura 1: Construtos genéticos para imagem da dinâmica do transposon em tempo real. (A) O promotor mCerulean3 é interrompido pelo TE, cujas extremidades são flanqueadas pelas sequências palindrômicas defeituosas da extremidade esquerda e da extremidade direita (LE IP e RE IP). A transposase, tnpA (cinza), é expressa a partir de PLtetO1, que é regulado pelo repressor tet (cinza) e é induzível com anidrotetraciclina (aTc). As sequências das sequências da junção Promotor/TE e do promotor -10 e -35 (caixas vermelhas) e dos locais de clivagem TnpA são mostradas por setas. (B) A construção TnpB+ é onde mCherry-tnpB foi transcricionalmente fundido a venus-tnpA de tal forma que ambos são transcritos como um mRNA policistrônico, imitando a configuração natural do IS608. (C) Após a excisão, o promotor mCerulean3 é reparado e a célula exibe fluorescência azul. A sequência promotora reconstituída é exibida abaixo do diagrama. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visualização dos eventos de excisão de transposon. O campo de visão de exemplo de TnpB+ com células (A) imediatamente antes e (B) após a detecção de eventos de excisão de transposon por fluorescência azul. Setas brancas indicam eventos de excisão. A diferença de tempo entre os dois quadros é de 20 min. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O TnpB aumenta a taxa de excisão de transposon. A taxa de excisão para células TnpB+ (laranja) e células TnpB- (azul). A taxa média de três repetições é mostrada como pontos com regiões sombreadas com um intervalo de confiança de 95%. Os dados são alinhados para que as células comecem a extirpar em t = 0. A taxa máxima medida para células TnpB+ foi de 5,1 ± 2,4 x 10-2 eventos por célula por hora, enquanto para TnpB- foi de 1,4 ± 0,48 x 10-2 eventos por célula por hora. A taxa média ao longo de todo o intervalo mostrado foi de 2,6 ± 1,8 x 10-2 eventos por célula por hora para células TnpB + e 5,3 ± 2,9 x 10-3 eventos por célula por hora para células TnpB-. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Estatísticas de expressão proteica para células excisantes versus população celular total. Cada quadro foi dividido em 64 blocos iguais, e a fluorescência foi medida para as células excisantes dentro do bloco e para todas as células contidas dentro do bloco, independentemente da atividade de excisão. A probabilidade, conforme plotada no eixo y, é medida como o número de pixels da intensidade indicada em cada tipo de célula dividido pelo número total de pixels. O tamanho do bloco para cada quadro foi definido para 445 x 445 pixels. (A) As células que sofrem eventos de excisão (vermelho escuro) expressam mais TnpB do que a população em geral (vermelho claro). A fluorescência vermelha média para as células excisantes foi de 51,3 ± 15,4 UA (vermelho escuro), enquanto que para todas as células foi de 42,5 ± 7,4 UA (vermelho claro). (B) Os níveis de transposase Vênus-TnpA são semelhantes nas células TnpB- (superior) e TnpB+ (inferior). Os conjuntos de dados são normalizados de modo que as fluorescências amarelas médias da população celular total (amarelo claro) sejam iguais para TnpB+/- a 105,7 UA. As células que foram identificadas como submetidas a eventos de excisão de transposon (amarelo escuro) exibem maior fluorescência amarela do que a população em geral, com distribuições semelhantes para TnpB- (acima) e TnpB+ (inferior). As fluorescências amarelas médias das populações excisantes são TnpB-: 158,3 ± 68,2 UA e TnpB+: 193 ± 79,9 UA. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme Suplementar 1: Dinâmica em tempo real da excisão IS608 com expressão TnpB. Um filme mostrando um segmento de 5 horas de dinâmica IS608 em tempo real; um quadro é capturado a cada 20 min. A excisão IS608 é visualizada como o desenvolvimento de fluorescência azul brilhante. As células mostradas neste filme incluem a expressão de TnpB. Clique aqui para baixar este arquivo.
Filme Suplementar 2: Dinâmica em tempo real da excisão IS608 sem expressão TnpB. Um filme mostrando um segmento de 5 horas de dinâmica IS608 em tempo real; um quadro é capturado a cada 20 min. A excisão IS608 é visualizada como o desenvolvimento de fluorescência azul brilhante. As células mostradas neste filme não incluem a expressão de TnpB. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O método único apresentado aqui para imagens em tempo real da atividade de elementos transponíveis em células vivas é um ensaio sensível que pode detectar diretamente a transposição em células vivas e em tempo real e correlacionar essa atividade com a expressão de proteínas acessórias. Embora a taxa de transferência seja menor do que pode ser realizada por métodos a granel, este método alcança medições detalhadas da atividade de ET e da expressão de proteínas em células vivas individuais.
Uma variedade de ferramentas e técnicas podem ser empregadas para cultivar células diretamente no microscópio para imagens em tempo real. O método usado aqui de crescimento celular em almofadas de agarose tem a vantagem de ser rápido, barato e fácil de executar. Uma possível desvantagem, dependendo do estado de crescimento celular de interesse, é que os recursos disponíveis para apoiar o crescimento celular na almofada de agarose são limitados e, portanto, as células naturalmente esgotarão esses recursos e deixarão de crescer após um período relativamente curto de tempo (12-24 h). Consequentemente, deve-se tomar cuidado para preparar as células em crescimento em estado estacionário e inocular a almofada em uma densidade baixa o suficiente para dar tempo suficiente para a medição. A microfluídica pode ser empregada para manter as células em crescimento exponencial em estado estacionário por longos períodos de tempo24, embora esses métodos exijam conhecimento, equipamentos e configuração adicionais para serem eficazes.
Complementando o trabalho mais detalhado do laboratório Kuhlman19, é ilustrado aqui que a proteína associada à família IS200/IS605 TE TnpB aumenta a taxa de excisão IS608 em até cinco vezes, e que o aumento da excisão está diretamente correlacionado com níveis mais altos de expressão de TnpB. Esses métodos são um exemplo de técnicas de ensaio aprimoradas que podem ajudar a lançar luz sobre a atividade de transposon e seu impacto na dinâmica mutacional e evolutiva.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
O apoio financeiro para esta pesquisa foi fornecido por fundos de inicialização da Universidade da Califórnia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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