Cuantificación en tiempo real de los efectos de la TnpB asociada a la familia IS200/IS605 sobre la actividad de transposones
Summary
Se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo en tiempo real para cuantificar cómo la proteína accesoria TnpB afecta la dinámica de transposición en células vivas individuales de Escherichia coli .
Abstract
Aquí, se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo y en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células bacterianas vivas utilizando un conjunto de reporteros fluorescentes acoplados a la transposición. En particular, demuestra cómo se pueden utilizar las imágenes en tiempo real para evaluar los efectos de la proteína accesoria TnpB sobre la actividad del elemento transponible IS608, un miembro de la familia de elementos transponibles IS200/IS605. La familia de elementos transponibles IS200/IS605 son elementos móviles abundantes conectados con uno de los genes más innumerables que se encuentran en la naturaleza, tnpB. Las homologías de secuencia proponen que la proteína TnpB puede ser un precursor evolutivo de los sistemas CRISPR/Cas9. Además, TnpB ha recibido un renovado interés, habiéndose demostrado que actúa como una endonucleasa de ADN guiada por ARN similar a Cas. Se cuantifican los efectos de TnpB en las tasas de transposición de IS608, y se demuestra que la expresión de TnpB de IS608 da como resultado ~ 5 veces mayor actividad de transposones en comparación con las células que carecen de expresión de TnpB.
Introduction
Los elementos transponibles (ET) son elementos genéticos que se movilizan dentro de sus genomas del huésped por escisión o copia catalizada seguida de reintegración genómica. Los TE existen en todos los dominios de la vida, y la transposición reestructura el genoma del huésped, mutando las regiones codificantes y de control1. Esto genera mutaciones y diversidad que juegan un papel importante en la evolución2,3, el desarrollo4,5 y varias enfermedades humanas6, incluyendo el cáncer7.
Utilizando nuevas construcciones genéticas que acoplan aspectos de la actividad transposicional a reporteros fluorescentes, nuestro trabajo anterior describió el desarrollo de un sistema experimental basado en el TE IS608 bacteriano, un representante de la familia generalizada de TE IS200 / IS605, que permite la visualización en tiempo real de la transposición en células vivas individuales8 (Figura 1). El sistema TE se muestra en la Figura 1A. El TE comprende la secuencia codificante de transposasa, tnpA, flanqueada por repeticiones palindrómicas imperfectas (IPs) del extremo izquierdo (LE) y del extremo derecho (RE), que son los sitios de reconocimiento y escisión para TnpA. La tnpA se expresa utilizando el promotor PLTetO1, que es reprimido por el represor tet y es inducible con anhidrotetraciclina (aTc)9. El TE divide las secuencias -10 y -35 de un promotor constitutivo PlacIQ1 10 para el reportero azul mCerulean311. Como se muestra en la Figura 1C, cuando se induce la producción de tnpA, el TE puede ser extirpado, lo que lleva a la reconstitución del promotor. La célula producida expresa mCerulean3 y fluoresce azul. El extremo N de TnpA está fusionado con el reportero amarillo Venus12, lo que permite la medición de los niveles de TnpA por fluorescencia amarilla.
IS608 y otros miembros de la familia de transposones IS200/IS605 también codifican típicamente un segundo gen de la función hasta ahora desconocida, tnpB13. Las proteínas TnpB son una familia de nucleasas tremendamente abundantes pero imperfectamente caracterizadas codificadas por varias ETs bacterianas y arqueales 14,15, que a menudo consisten solo en tnpB16. Además, estudios recientes han renovado el interés en TnpB al encontrar que TnpB funciona como una endonucleasa guiada por ARN programable similar a CRISPR / Cas que producirá roturas de dsDNA o ssDNA en diversas condiciones17,18. Sin embargo, no está claro qué papel puede desempeñar TnpB en la regulación de la transposición. Para realizar la visualización en tiempo real de los efectos de TnpB en la transposición de IS608, se creó una versión del transposón, incluida la región codificante de TnpB con una fusión N-terminal a la proteína fluorescente roja mCherry.
Complementando estudios más detallados a nivel de masa realizados por el laboratorio de Kuhlman19, se muestra aquí cómo las imágenes en tiempo real de la actividad de transposones pueden revelar cuantitativamente el impacto de TnpB o cualquier otra proteína accesoria en la dinámica transposicional. Al fusionar TnpB con mCherry, los eventos transposicionales individuales se identifican por fluorescencia azul y se correlacionan con los niveles de expresión de TnpA (fluorescencia amarilla) y TnpB (fluorescencia roja).
Protocol
Representative Results
Discussion
El método único presentado aquí para obtener imágenes en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células vivas es un ensayo sensible que puede detectar directamente la transposición en células vivas y en tiempo real y correlacionar esta actividad con la expresión de proteínas accesorias. Si bien el rendimiento es menor que el que se puede lograr con métodos a granel, este método logra mediciones detalladas de la actividad de TE y la expresión de proteínas en células vivas individuales.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo financiero para esta investigación fue proporcionado por fondos iniciales de la Universidad de California.
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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