トランスポゾン活性に対するIS200/IS605ファミリー関連TnpBの影響のリアルタイム定量
Summary
アクセサリータンパク質TnpBが個々の生きた 大腸菌 細胞の転位のダイナミクスにどのように影響するかを定量化するために、ライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルが概説されています。
Abstract
ここでは、転位に結合された一連の蛍光レポーターを使用して、生細菌細胞における転移因子活性のライブリアルタイムイメージングを実行するためのプロトコルの概要を説明します。特に、トランスポーズ可能なエレメントのIS200/IS605ファミリーのメンバーであるトランスポザブルエレメントIS608の活性に対するアクセサリータンパク質TnpBの影響を評価するために、リアルタイムイメージングをどのように使用できるかを示しています。IS200/IS605ファミリーの転移性エレメントは、自然界に見られる最も無数の遺伝子の1つであるtnpBと結合した豊富な可動エレメントです。配列相同性は、TnpBタンパク質がCRISPR/Cas9システムの進化的前駆体である可能性があることを示唆しています。さらに、TnpBは、Cas様RNA誘導DNAエンドヌクレアーゼとして作用することが示され、新たな関心を集めています。IS608の転位率に対するTnpBの効果は定量化され、IS608のTnpBの発現は、TnpB発現を欠く細胞と比較してトランスポゾン活性を~5倍増加させることが実証されています。
Introduction
転移要素(TE)は、切除または触媒コピーとそれに続くゲノム再統合によって宿主ゲノム内で動員される遺伝的要素です。TEは生命のすべてのドメインに存在し、転位は宿主ゲノムを再構築し、コード領域と制御領域を変異させます1。これにより、進化2,3、発生4,5、および癌7を含むいくつかのヒト疾患6において重要な役割を果たす突然変異と多様性が生成されます。
転位活性の側面を蛍光レポーターに結合する新しい遺伝子構築物を使用して、私たちの以前の研究では、広く普及しているIS200/IS605ファミリーのTEファミリーの代表である細菌TE IS608に基づく実験システムの開発について説明しました。 TE システムを図 1A に示します。TEは、トランスポザーゼコード配列tnpAで構成され、TnpAの認識部位と切除部位である左端(LE)と右端(RE)の不完全な回文反復(IP)が挟まれています。tnpAは、テットリプレッサーによって抑制され、アンヒドロテトラサイクリン(aTc)9で誘導されるプロモーターPLTetO1を用いて発現されます。TEは、構成的PlacIQ1プロモーター10の-10および-35配列を青色レポーターmCerulean311のために分割する。図1Cに示すように、tnpAの産生が誘導されると、TEを切除することができ、プロモーター再構成につながる。産生された細胞はmCerulean3を発現し、青色を発する。TnpAのN末端は黄色レポーターVenus12に融合しており、黄色蛍光によるTnpAレベルの測定が可能です。
IS608およびIS200/IS605ファミリーのトランスポゾンの他のメンバーも、これまで知られていなかった機能の2番目の遺伝子であるtnpB13を典型的にコードする。TnpBタンパク質は、非常に豊富ではあるが不完全に特徴付けられたヌクレアーゼファミリーであり、いくつかの細菌および古細菌のTE14,15によってコードされており、多くの場合tnpB16のみで構成されています。さらに、最近の研究では、TnpBがCRISPR/Cas様プログラマブルRNAガイドエンドヌクレアーゼとして機能し、さまざまな条件下でdsDNAまたはssDNA切断のいずれかを生成することを発見することにより、TnpBへの関心が新たになっています17,18。しかし、転位の調節においてTnpBがどのような役割を果たすかは不明である。IS608転位に対するTnpBの影響をリアルタイムで可視化するために、赤色蛍光タンパク質mCherryへのN末端融合を有するTnpBのコード領域を含むトランスポゾンのバージョンが作成された。
Kuhlman lab19によって実施されたより詳細なバルクレベルの研究を補完するために、トランスポゾン活性のリアルタイムイメージングが転位ダイナミクスに対するTnpBまたは他のアクセサリータンパク質の影響を定量的に明らかにする方法がここで示されています。TnpBをmCherryに融合させることにより、個々の転位事象を青色蛍光によって同定し、TnpA(黄色蛍光)およびTnpB(赤色蛍光)の発現レベルと相関させる。
Protocol
Representative Results
Discussion
生細胞における転移因子活性のリアルタイムイメージングのためにここで紹介するユニークな方法は、生細胞における転位をリアルタイムで直接検出し、この活性をアクセサリータンパク質の発現と相関させることができる高感度アッセイです。スループットはバルク法で達成できるよりも低くなりますが、この方法では個々の生細胞におけるTE活性とタンパク質発現の詳細な測定が可能に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究への財政的支援は、カリフォルニア大学のスタートアップ資金によって提供されました。
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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