Summary
Er wordt een protocol geschetst om live real-time beeldvorming uit te voeren om te kwantificeren hoe het accessoire-eiwit TnpB de dynamiek van transpositie in individuele levende Escherichia coli-cellen beïnvloedt.
Abstract
Hier wordt een protocol geschetst om live, real-time beeldvorming uit te voeren van transponeerbare elementactiviteit in levende bacteriële cellen met behulp van een reeks fluorescerende melders gekoppeld aan transpositie. Het laat met name zien hoe real-time beeldvorming kan worden gebruikt om de effecten van het accessoire eiwit TnpB op de activiteit van het transponeerbare element IS608, een lid van de IS200/IS605-familie van transponeerbare elementen, te beoordelen. De IS200/IS605 familie van transponeerbare elementen zijn overvloedige mobiele elementen verbonden met een van de meest ontelbare genen in de natuur, tnpB. Sequentie homologieën suggereren dat het TnpB-eiwit een evolutionaire voorloper kan zijn van CRISPR / Cas9-systemen. Bovendien heeft TnpB hernieuwde interesse gekregen, waarvan is aangetoond dat het fungeert als een Cas-ACHTIG RNA-geleid DNA-endonuclease. De effecten van TnpB op de transpositiesnelheden van IS608 worden gekwantificeerd en er wordt aangetoond dat de expressie van TnpB van IS608 resulteert in ~ 5x verhoogde transposonactiviteit in vergelijking met cellen zonder TnpB-expressie.
Introduction
Transponeerbare elementen (TSE's) zijn genetische elementen die in hun gastheergenomen mobiliseren door excisie of katalyseren kopiëren gevolgd door genomische re-integratie. TSE's bestaan in alle domeinen van het leven en transpositie herstructureert het gastheergenoom, muteert coderings- en controlegebieden1. Dit genereert mutaties en diversiteit die een belangrijke rol spelen in evolutie 2,3, ontwikkeling 4,5 en verschillende menselijke ziekten6, waaronder kanker7.
Met behulp van nieuwe genetische constructies die aspecten van transpositieve activiteit koppelen aan fluorescerende verslaggevers, beschreef ons eerdere werk de ontwikkeling van een experimenteel systeem op basis van de bacteriële TE IS608, een vertegenwoordiger van de wijdverspreide IS200 / IS605-familie van TSE's, die de real-time visualisatie van transpositie in individuele levende cellenmogelijk maakt 8 (figuur 1). Het TE-systeem wordt weergegeven in figuur 1A. De TE bestaat uit de transposasecoderingssequentie, tnpA, geflankeerd door Left End (LE) en Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IP's), die de herkennings- en excisieplaatsen voor TnpA zijn. tnpA wordt uitgedrukt met behulp van de promotor PLTetO1, die wordt onderdrukt door de tet-repressor en induceerbaar is met anhydrotetracycline (aTc)9. De TE splitst de -10 en -35 sequenties van een constitutieve PlacIQ1 promotor10 voor de blauwe reporter mCerulean311. Zoals te zien is in figuur 1C, kan de TE worden weggesneden wanneer de productie van tnpA wordt geïnduceerd, wat leidt tot reconstructie van promotors. De geproduceerde cel drukt mCerulean3 uit en fluoresceert blauw. De N-terminus van TnpA is gefuseerd met de gele reporter Venus12, waardoor de TnpA-niveaus kunnen worden gemeten door gele fluorescentie.
IS608 en andere leden van de IS200/IS605-familie van transposons coderen meestal ook voor een tweede gen van de tot nu toe onbekende functie, tnpB13. De TnpB-eiwitten zijn een enorm overvloedige maar onvolmaakt gekarakteriseerde familie van nucleasen gecodeerd door verschillende bacteriële en archaeale TSE's 14,15, die vaak alleen uit tnpB16 bestaan. Bovendien hebben recente studies hernieuwde interesse in TnpB door te vinden dat TnpB functioneert als een CRISPR / Cas-achtige programmeerbare RNA-geleide endonuclease die dsDNA- of ssDNA-pauzes onder verschillende omstandigheden zal opleveren17,18. Het blijft echter onduidelijk welke rol TnpB kan spelen bij het reguleren van de omzetting. Om real-time visualisatie van de effecten van TnpB op IS608-transpositie uit te voeren, werd een versie van de transposon gemaakt, inclusief het coderende gebied van TnpB met een N-terminale fusie tot het rode fluorescerende eiwit mCherry.
Als aanvulling op meer gedetailleerde studies op bulkniveau uitgevoerd door het Kuhlman-lab19, wordt hier getoond hoe real-time beeldvorming van transposonactiviteit kwantitatief de impact van TnpB of andere accessoire eiwitten op transpositiedynamiek kan onthullen. Door TnpB te fuseren met mCherry, worden de individuele transpositiegebeurtenissen geïdentificeerd door blauwe fluorescentie en gecorreleerd met expressieniveaus van TnpA (gele fluorescentie) en TnpB (rode fluorescentie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van bacterieculturen
- Kweek E. coli stam MG1655 met plasmide transposon constructen (eerder beschreven in Kim et al.8) 's nachts in LB met de juiste antibiotica (25 μg/ml kanamycine, zie Materiaaltabel) bij 37 °C.
OPMERKING: De sequenties van de gebruikte constructen en de bijbehorende sequenties zijn beschikbaar als GenBank20 toetredingsnummers OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 en OP717085. - Om een exponentiële groei in steady-state te bereiken, ≥100 vouwen in het M63-medium (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,8 μM FeSO4, 15 mM [NH4] 2SO4, 0,5 μg / ml thiamine [vitamine B1]) aangevuld met een koolstofbron (0,5% w / v glucose hier) en geschikte antibiotica (zie Materiaaltabel).
- Kweek culturen bij 37 °C totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) ~0,2 bereikt. De culturen zijn klaar voor gebruik.
2. Dia voorbereiding
- Bereid een dia door M63 met 0,5% w/v glucose en 1,5% w/v agarose in de magnetron te koken om de agarose te smelten en ervoor te zorgen dat deze volledig gesmolten en goed gemengd is.
- Laat het mengsel afkoelen tot ~55 °C voordat u antibiotica en inductoren toevoegt (25 μg/ml Kanamycine en 10 ng/μL anhydrotetracycline [aTc], zie Materiaaltabel).
- Plaats een microscoopglaasje op de werkbank. Stapel nog twee dia's loodrecht op de eerste en plaats een andere op de bovenkant, parallel aan de onderste dia. Zorg ervoor dat er een opening is die gelijk is aan één schuifdikte tussen de onderste en bovenste dia's. Pipet ~ 1 ml van het M63 agarose mengsel in deze opening tussen de dia's langzaam om een klein gel vierkant te creëren.
- Zodra de gel is gestold (~ 10-15 min), schuift u de bovenste schuif om deze te verwijderen. Trim de agarose pad met een scheermes of mes. Pipetteer vervolgens 2,5 μL van de kweek (stap 1.3) en leg de deklip erop.
- Sluit de ruimte tussen de glijbaan en de afdekplaat af met epoxy (zie Materiaalopgave). Laat de epoxy drogen en de cellen minstens 1 uur bij 37 °C op de agarose pad bezinken.
3. Timelapse fluorescentiemicroscopie
- Plaats het bereide monster (stap 1.3) op een fluorescentiemicroscoop (zie materiaaltabel) in een omgeving die verwarmd en op 37 °C wordt gehouden.
- Stel de belichtingstijden in die geschikt zijn voor de camera die wordt gebruikt voor beeldacquisitie. Pas de verlichtingsintensiteit aan om fotobleaching te minimaliseren.
OPMERKING: Voor dit onderzoek werd een blootstellingstijd van 2 s voor elke golflengte gebruikt. - Zoek voor elke golflengte een gezichtsveld (FOV) met minimale fluorescentie. Verkrijg afbeeldingen om te gebruiken tijdens de analyse voor achtergrondaftrek.
- Stel de belichtingstijden in die geschikt zijn voor de camera die wordt gebruikt voor beeldacquisitie. Pas de verlichtingsintensiteit aan om fotobleaching te minimaliseren.
- Stel een protocol op om afbeeldingen in een raster op verschillende golflengten en met regelmatige tijdsintervallen te verkrijgen.
- Codeer timelapse-fotografie in het protocol. Stel de acquisitiefrequentie in op het gewenste tijdsinterval (20 min hier) en de totale timelapse-duur op de gewenste lengte (24 uur).
- Codeer de juiste golflengten in het protocol (afhankelijk van de gebruikte constructie).
OPMERKING: De mCherry excitatiepiek ligt op 587 nm en de emissiepiek op 610 nm21; mVenus is op 515 nm en 527 nm12, terwijl mCerulean3 op 433 nm en 475 nm11 ligt. - Stel de rastergrootte in om vast te leggen tussen het gewenste aantal FOV's.
OPMERKING: De hier getoonde representatieve gegevens gebruikten 8 x 8 FOV's.
4. Beeldanalyse
- Voer achtergrondaftrek uit op elk kleurkanaal met behulp van de respectieve achtergrondafbeeldingen die zijn verkregen in stap 3.1.2. Voor alle analysestappen gebruiken we standaardmodules in het open-source platform Fiji22 (zie Materiaalopgave).
- Benader de totale populatie op elk moment in de tijd door het mCerulean-kanaal te drempelen en het drempelgebied te delen door het gemiddelde celoppervlak.
- Om de unieke excisiegebeurtenissen te tellen, neemt u de tijdsderivaat van het mCerulean3-kanaal. Voer dit uit door opeenvolgende afbeeldingen in het mCerulean3-kanaal af te trekken. De excisiegebeurtenissen worden gedetecteerd in de tijdderivaat als een heldere flits van fluorescentie.
- Drempel de stapel excisiegebeurtenissen om ongewenste fluorescentie te elimineren. Merk op dat dit proces delen van de excisies zelf zal drempelen. Om dit op te lossen, verwijdt u de afbeeldingen om de excisies in hun oorspronkelijke grootte te herstellen.
OPMERKING: Analyses met vergelijkbare drempel- en beeldanalysetechnieken kunnen ook op de andere fluorescentiekanalen worden uitgevoerd (bijv. excisiegebeurtenissen correleren met niveaus van transposase TnpA [gele Venusfluorescentie] en TnpB [rode mCherry-fluorescentie].
- Drempel de stapel excisiegebeurtenissen om ongewenste fluorescentie te elimineren. Merk op dat dit proces delen van de excisies zelf zal drempelen. Om dit op te lossen, verwijdt u de afbeeldingen om de excisies in hun oorspronkelijke grootte te herstellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode voor het visualiseren van transposon-activiteit in levende cellen door fluorescentiemicroscopie, terwijl het een lagere doorvoer heeft dan bulkfluorescentiemetingen, maakt directe visualisatie van transposon-activiteit in individuele levende cellen mogelijk. Transposon-excisiegebeurtenissen resulteren in de reconstitutie van de promotor voor mCerulean3 (figuur 1), waardoor cellen die transposonactiviteit ondergaan door felblauwe fluorescentie kunnen worden geïdentificeerd (Figuur 2, TnpB+: Aanvullende film 1 en TnpB-: Aanvullende film 2).
Het is gebleken dat cellen die het accessoire-eiwit TnpB tot expressie brengen (figuur 3, oranje) 4-5 keer hogere niveaus van transposonactiviteit ervaren in vergelijking met cellen die dat niet doen (figuur 3, blauw), in overeenstemming met de meer gedetailleerde studies op bulkniveau19. Dit is vooral opmerkelijk omdat de opname van de coderende sequentie van mCherry-tnpB de lengte van het transposon met ~ 2.000 bp verhoogt, terwijl eerdere studies hebben aangetoond dat IS608 transposon excisie een exponentieel afnemende functie is van transposonlengte23.
Een voordeel van real-time beeldvorming is dat eenmaal geïdentificeerd, cellen die transpositieve gebeurtenissen ondergaan, verder kunnen worden gevolgd en geanalyseerd om andere karakteristieke parameters te bepalen, zoals groeisnelheid, om de verdeling van fitnesseffecten of het expressieniveau van accessoire eiwitten te bepalen om hun impact op transpositieve activiteit te bepalen. In TnpB+-cellen hebben cellen die transposon-excisiegebeurtenissen ondergaan bijvoorbeeld hogere expressieniveaus van mCherry-TnpB dan de algemene populatie (figuur 4A). Bovendien drukken TnpB+-cellen (figuur 4B+-cellen (figuur 4B, onder) voor cellen die excisiegebeurtenissen ondergaan (figuur 4B+ figuur 4B+ (figuur 4B, boven) slechts marginaal hogere niveaus van Venus-TnpA-transposase uit dan TnpB-cellen (figuur 4B, boven) (TnpB- 158,3 ± 68,2 AU, TnpB+: 193 ± 79,9 AU), wat hoger is dan de gele fluorescentie van de algemene bevolking (figuur 4BB) , lichtgeel). Alles bij elkaar suggereren deze gegevens dat TnpB-eiwit verantwoordelijk is voor de waargenomen hogere niveaus van transpositieve activiteit.
Figuur 1: Genetische constructen voor beeldvorming van real-time transposondynamica. (A) De mCerulean3-promotor wordt verstoord door de TE, waarvan de uiteinden worden geflankeerd door de linker- en rechterkant defecte palindromische sequenties (LE IP en RE IP). De transposase, tnpA (grijs), wordt uitgedrukt uit PLtetO1, die wordt gereguleerd door de tet-repressor (grijs) en induceerbaar is met anhydrotetracycline (aTc). De sequenties van de Promoter/TE-junctie en promotor -10 en -35-reeksen (rode vakken) en TnpA-splitsingssites worden weergegeven met pijlen. (B) De TnpB+ constructie is waar mCherry-tnpB transcriptioneel is gefuseerd tot venus-tnpA, zodat beide worden getranscribeerd als een polycistronisch mRNA, waarbij de natuurlijke configuratie van IS608 wordt nagebootst. (C) Bij excisie wordt de mCerulean3-promotor gerepareerd en vertoont de cel blauwe fluorescentie. De gereconstitueerde promotorsequentie wordt onder het diagram weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visualisatie van transposon excisiegebeurtenissen. Het voorbeeld gezichtsveld van TnpB+ met cellen (A) vlak voor en (B) na het detecteren van transposon excisiegebeurtenissen door blauwe fluorescentie. Witte pijlen geven excisiegebeurtenissen aan. Het tijdsverschil tussen de twee frames is 20 min. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: TnpB verbetert de transponeringsexcisiesnelheid. De excisiesnelheid voor TnpB+ cellen (oranje) en TnpB- (blauwe) cellen. De gemiddelde snelheid van drie replicaties wordt weergegeven als punten met gearceerde gebieden met een betrouwbaarheidsinterval van 95%. De gegevens worden zo uitgelijnd dat cellen beginnen te exciëren bij t = 0. De maximale gemeten snelheid voor TnpB + -cellen was 5,1 ± 2,4 x 10-2 gebeurtenissen per cel per uur, terwijl voor TnpB - 1,4 ± 0,48 x 10-2 gebeurtenissen per cel per uur was. De gemiddelde snelheid over het hele getoonde interval was 2,6 ± 1,8 x 10-2 gebeurtenissen per cel per uur voor TnpB+ cellen en 5,3 ± 2,9 x 10-3 gebeurtenissen per cel per uur voor TnpB- cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Eiwitexpressiestatistieken voor excising cellen versus totale celpopulatie. Elk frame werd verdeeld in 64 gelijke blokken en fluorescentie werd gemeten voor cellen die zich binnen het blok bevinden en voor alle cellen in het blok, ongeacht de excisieactiviteit. Waarschijnlijkheid, zoals uitgezet op de y-as, wordt gemeten als het aantal pixels van de aangegeven intensiteit in elk celtype gedeeld door het totale aantal pixels. De blokgrootte voor elk frame is ingesteld op 445 x 445 pixels. (A) De cellen die excisiegebeurtenissen ondergaan (donkerrood) drukken meer TnpB uit dan de algemene bevolking (lichtrood). De gemiddelde rode fluorescentie voor excising cells was 51,3 ± 15,4 AU (donkerrood), terwijl die voor alle cellen 42,5 ± 7,4 AU (lichtrood) was. (B) Venus-TnpA transposase niveaus zijn vergelijkbaar in TnpB- (boven) en TnpB + (onderste) cellen. De datasets zijn genormaliseerd zodat de gemiddelde gele fluorescenties van de totale celpopulatie (lichtgeel) gelijk zijn voor TnpB+/- bij 105,7 AU. De cellen waarvan is vastgesteld dat ze transposon-excisiegebeurtenissen ondergaan (donkergeel) vertonen een hogere gele fluorescentie dan de algemene populatie, met vergelijkbare verdelingen voor TnpB- (boven) en TnpB + (onder). Gemiddelde gele fluorescenties van de excising populaties zijn TnpB-: 158,3 ± 68,2 AU en TnpB+: 193 ± 79,9 AU. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende film 1: Real-time dynamiek van IS608-excisie met TnpB-expressie. Een film met een 5 uur lang segment van real-time IS608 dynamiek; elke 20 minuten wordt een frame vastgelegd. IS608-excisie wordt gevisualiseerd als de ontwikkeling van felblauwe fluorescentie. De cellen in deze film bevatten de expressie van TnpB. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende film 2: Real-time dynamiek van IS608 excisie zonder TnpB expressie. Een film met een 5 uur lang segment van real-time IS608 dynamiek; elke 20 minuten wordt een frame vastgelegd. IS608-excisie wordt gevisualiseerd als de ontwikkeling van felblauwe fluorescentie. De cellen in deze film bevatten niet de expressie van TnpB. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De unieke methode die hier wordt gepresenteerd voor real-time beeldvorming van transponeerbare elementactiviteit in levende cellen is een gevoelige test die transpositie in levende cellen en in realtime direct kan detecteren en deze activiteit kan correleren met de expressie van accessoire eiwitten. Hoewel de doorvoer lager is dan kan worden bereikt met bulkmethoden, bereikt deze methode gedetailleerde metingen van TE-activiteit en eiwitexpressie in individuele levende cellen.
Een verscheidenheid aan hulpmiddelen en technieken kan worden gebruikt om cellen direct op de microscoop te laten groeien voor realtime beeldvorming. De methode die hier wordt gebruikt voor celgroei op agarose-pads heeft het voordeel dat deze snel, goedkoop en gemakkelijk uit te voeren is. Een mogelijk nadeel, afhankelijk van de cellulaire groeitoestand van belang, is dat de beschikbare middelen om de celgroei in het agarose-pad te ondersteunen beperkt zijn, en daarom zullen cellen deze bronnen van nature uitputten en na een relatief korte periode (12-24 uur) stoppen met groeien. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat de cellen in steady state groei worden voorbereid en de pad wordt ingeënt met een voldoende lage dichtheid om voldoende tijd te geven voor meting. Microfluïdica kunnen worden gebruikt om cellen gedurende langere tijd in steady state exponentiële groei te houden24, hoewel deze methoden extra expertise, apparatuur en opstelling vereisen om effectief te zijn.
Als aanvulling op meer gedetailleerd werk van het Kuhlman-lab19, wordt hier geïllustreerd dat het IS200 / IS605 TE-familie-geassocieerde eiwit TnpB de snelheid van IS608-excisie tot vijfvoudig verhoogt, en dat verhoogde excisie direct gecorreleerd is met hogere expressieniveaus van TnpB. Deze methoden zijn een voorbeeld van verbeterde testtechnieken die kunnen helpen licht te werpen op transposonactiviteit en de impact ervan op mutatie- en evolutionaire dynamiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Financiële steun voor dit onderzoek werd verstrekt door start-upfondsen van de Universiteit van Californië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
