IS200/IS605家族相关TnpB对转座子活性影响的实时定量分析

摘要

本文概述了一种用于进行活细胞实时成像的实验方案，以定量分析辅助蛋白TnpB对单个活体大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中转座动态的影响。

摘要

本文概述了一种利用与转座过程偶联的荧光报告系统，在活体细菌细胞中对转座元件活性进行活细胞实时成像的实验方案。具体而言，该方法展示了如何利用实时成像技术评估辅助蛋白TnpB对转座元件IS608（属于IS200/IS605家族）活性的影响。IS200/IS605家族转座元件是一类广泛存在的可移动遗传元件，与自然界中数量最为庞大的基因之一tnpB密切相关。序列同源性分析表明，TnpB蛋白可能是CRISPR/Cas9系统的进化前体。此外，TnpB近期重新受到关注，已被证实可作为一种类似Cas蛋白的RNA引导型DNA内切酶。本文定量分析了TnpB对IS608转座频率的影响，并证明与不表达TnpB的细胞相比，表达IS608来源TnpB的细胞中转座子活性提高了约5倍。

引言

转座元件（TEs）是一类能够在宿主基因组内通过切除或催化复制后重新整合的方式进行移动的遗传元件。TEs 存在于所有生命领域中，其转座过程会重构宿主基因组，导致编码区和调控区发生突变¹。这会产生突变和多样性，在进化^2,3、发育^4,5以及多种人类疾病⁶（包括癌症⁷）中发挥重要作用。

通过使用将转座活性特征与荧光报告系统偶联的新型遗传构建体，我们先前的研究描述了一种基于细菌转座子IS608的实验系统，该转座子属于广泛存在的IS200/IS605转座子家族，可实现对单个活细胞中转座事件的实时可视化⁸（图1）。该转座子系统如图1A所示。该转座子包含转座酶编码序列tnpA，其两侧为左端（LE）和右端（RE）的不完全回文重复序列（IPs），这些序列是TnpA识别和切割的位点。

方案

1. 细菌培养物的制备

1. 在含有适当抗生素（25 µg/mL 卡那霉素，参见材料表）的 LB 培养基中，于 37 °C 过夜培养携带质粒转座子构建体的大肠杆菌（E. coli）菌株 MG1655（此前在 Kim 等人⁸中已有描述）。
   注意：所用构建体及其相关序列已在 GenBank²⁰ 中注册，登录号分别为 OP581959、OP581957、OP581958、OP717084 和 OP717085。
2. 为获得稳态对数生长期的菌体，将菌液以至少 100 倍稀释度接种至 M63 培养基（含 100 mM KH₂PO₄、1 mM MgSO₄、1.8 µM FeSO₄、15 mM (NH₄)₂SO₄、0.5 µg/mL 硫胺素 [维生素 B1]），并添加碳源（本实验使用 0.5% w/v 葡萄糖）及适当的抗生素（参见材料表）。
3. 于 37 °C 培养菌液，直至 600 nm 处的光密度（OD600）达到约 0.2。此时菌液即可用于后续实验。

结果

通过荧光显微镜对活细胞中的转座子活性进行可视化观察，尽管其通量低于群体荧光测量，但能够直接观察单个活细胞中的转座子活性。转座子切除事件导致mCerulean3的启动子恢复（图1），从而可通过明亮的蓝色荧光识别发生转座子活性的细胞（图2，TnpB+：补充视频1，TnpB-：补充视频2）。

研究发现，表达辅助蛋白 TnpB 的细胞（图 3，橙色）中转座子活性水平比不表达 TnpB 的细胞（图 3，蓝色）高出 4-5 倍，这与之前更为详细的群体水平研究结果一致¹⁹。这一现象尤为显著，因为引入 mCherry-tnpB 的编码序列使转座子长度增加了约 2,000 bp，而先前研究表明，IS608 转座子的.......

讨论

本文介绍的用于活细胞中转座元件活性实时成像的独特方法是一种灵敏的检测手段，可直接在活细胞中实时检测转座事件，并将该活性与辅助蛋白的表达相关联。尽管通量低于群体性方法所能达到的水平，但该方法能够对单个活细胞中的转座元件活性和蛋白表达进行详细测量。

可采用多种工具和技术在显微镜下直接培养细胞，以实现实时成像。本文所使用的方法是在琼脂糖垫上培养细胞，其优点是快速、经济且操作简便。一个可能的缺点是，取决于所关注的细胞生长状态，琼脂糖垫中支持细胞生长的资源有限，因此细胞在相对较短的时间内（12–24 小时）会自然耗尽这些资源并停止生长。因此，必须小心地将处于稳态生长的细胞以足够低的密度接种到琼脂糖垫上，以确保有充足的时间进行测量。微流控技术可用于长期维持细胞处于稳态指数生长期²⁴，但这些方法需要额外的专业知识、设备和设置才能有效实施。

除了Kuhlman实验室更详细的研究工作¹⁹之外，本文进一步表明，与IS200/I.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 吨透明环氧树脂	Devcon	31345
琼脂糖	Sigma-Aldrich	5066
硫酸铵	Sigma-Aldrich	AX1385-1
盐酸无水四环素	Sigma-Aldrich	37919
氩离子激光器	Melles Griot	35-IMA-840-015
蓝色滤光片组	Chroma	激发光：Z457/10X，发射光：ET485/30M
D(+)葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E 显微镜	Nikon		已停产
Eppendorf epTIPS 吸头盒及补充盒，体积：0.1 至 10 µL，长度：3.4 cm，1.33 in.，PP（聚丙烯）	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS 吸头盒及补充盒，体积：50 至 1000 µL，长度：7.1 cm，2.79 in.，PP（聚丙烯）	Eppendorf North America Biotools	22491555
硫酸亚铁 ACS 级，500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji（imagej.net）
Fisher BioReagents LB 肉汤，Miller 型（颗粒状）	Fisher Scientific	BP9723-2
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-542B
硫酸卡那霉素	Sigma-Aldrich	1355006
硫酸镁，分析纯	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
显微镜加热装置	World Precision Instruments	96810-1
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	17001H
ProScan III 载物台	Prior
红色滤光片组	Chroma	激发光：ET560/40X，发射光：ET645/75M
Sapphire 561 LP 激光器	Coherent	1170412
显微镜载玻片	Fisher Scientific	125535B
盐酸硫胺素	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 激光发射装置	Nikon
黄色滤光片组	Chroma	激发光：Z514/10X，发射光：ET535/30M