Summary
概述了执行实时成像的方案，以量化辅助蛋白TnpB如何影响单个 活大肠杆菌 细胞中的转位动力学。
Abstract
在这里，概述了一个协议，以使用一套与转位耦合的荧光报告基因对活细菌细胞中的转座元件活性进行实时实时成像。特别是，它展示了如何使用实时成像来评估辅助蛋白TnpB对转座元件IS608活性的影响，IS608是IS200/IS605转座元件家族的成员。IS200/IS605转座元件家族是丰富的移动元件，与自然界中发现的无数基因之一tnpB相连。序列同源性表明TnpB蛋白可能是CRISPR / Cas9系统的进化前体。此外，TnpB重新引起了人们的兴趣，已被证明可作为Cas样RNA引导的DNA核酸内切酶。量化了TnpB对IS608转位速率的影响，结果表明，与缺乏TnpB表达的细胞相比，IS608的TnpB表达导致~5倍的转座子活性增加。
Introduction
转座元件（TEs）是通过切除或催化复制然后基因组重新整合在其宿主基因组内动员的遗传元件。TE存在于生命的所有领域，转位重组宿主基因组，突变编码和控制区域1。这产生的突变和多样性在进化2，3，发育4，5和几种人类疾病6（包括癌症7）中起着重要作用。
使用将转位活性的各个方面与荧光报告基因耦合的新型遗传构建体，我们之前的工作描述了基于细菌TE IS608的实验系统的发展，TE IS608是广泛的IS200 / IS605家族TE的代表，允许实时可视化单个活细胞中的转座8（图1）。TE 系统如图 1A 所示。TE由转座酶编码序列tnpA组成，两侧是左端（LE）和右端（RE）不完全回文重复序列（IP），它们是TnpA的识别和切除位点。tnpA使用启动子PLTetO1表达，其被tet阻遏因子抑制并且可与脱水四环素（aTc）9诱导。TE 将组成型 PlacIQ1 启动子 10 的 -10 和 -35 序列拆分为蓝色报告基因 mCerulean311。如图1C所示，当诱导tnpA的产生时，可以切除TE，导致启动子重建。产生的细胞表达mCerulean3并发出蓝色荧光。TnpA的N端融合到黄色报告基因金星12上，允许通过黄色荧光测量TnpA水平。
IS608和IS200/IS605转座子家族的其他成员通常也编码迄今为止未知功能的第二个基因tnpB13。TnpB蛋白是一个非常丰富但不完美表征的核酸酶家族，由几种细菌和古细菌TE编码14，15，其通常仅由tnpB16组成。此外，最近的研究发现TnpB作为一种CRISPR / Cas样可编程RNA引导的核酸内切酶，可以在不同条件下产生dsDNA或ssDNA断裂，从而重新引起了人们对TnpB的兴趣17，18。然而，目前尚不清楚TnpB在调节转位中可能发挥什么作用。为了实时可视化TnpB对IS608转位的影响，创建了一个转座子版本，包括与红色荧光蛋白mCherry融合的N端融合的TnpB编码区。
作为Kuhlman实验室19进行的更详细的体积水平研究的补充，这里展示了转座子活性的实时成像如何定量揭示TnpB或任何其他辅助蛋白对转位动力学的影响。通过将TnpB融合到mCherry，通过蓝色荧光识别单个换位事件，并与TnpA（黄色荧光）和TnpB（红色荧光）的表达水平相关。
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Protocol
1. 细菌培养物的制备
- 在37°C下用适当的抗生素（25μg/ mL卡那霉素，参见材料表）在LB中用质粒转座子构建体（先前在Kim等人8中描述）生长大肠杆菌菌株MG1655过夜。
注意：所用结构的序列和相关序列以GenBank20 入藏号OP581959、OP581957、OP581958、OP717084和OP717085的形式提供。 - 为了实现稳态指数生长，将培养物≥100倍稀释到M63培养基（100 mM KH 2 PO 4，1 mM MgSO 4，1.8 μM FeSO 4，15 mM [NH 4]2SO 4，0.5 μg/ mL硫胺素[维生素B1]）中，并补充碳源（此处为0.5%w / v葡萄糖）和适当的抗生素（参见材料表）。
- 在37°C下培养培养物，直到600nm处的光密度（OD 600）达到~0.2。培养物已准备就绪，可供使用。
2. 载玻片准备
- 通过在微波炉中将M63与0.5%w / v葡萄糖和1.5%w / v琼脂糖煮沸以融化琼脂糖并确保其完全熔融并充分混合来制备载玻片。
- 在加入抗生素和诱导剂（25 μg/mL 卡那霉素和 10 ng/μL 脱水四环素 [aTc]，参见 材料表）之前，让混合物冷却至 ~55 °C。
- 将显微镜载玻片放在工作台上。垂直于第一张幻灯片再堆叠两张幻灯片，并将另一张幻灯片放在顶部，平行于底部幻灯片。确保底部和顶部幻灯片之间的间隙等于一个载玻片厚度。将~1 mL的M63琼脂糖混合物缓慢移液到载玻片之间的间隙中，以形成一个小的凝胶方块。
- 凝胶凝固（~10-15分钟）后，滑动顶部载玻片将其取出。用剃须刀片或刀修剪琼脂糖垫。然后移液 2.5 μL 培养物（步骤 1.3），并将盖玻片放在顶部。
- 用环氧树脂密封载玻片和盖玻片之间的空间（见 材料表）。让环氧树脂干燥，细胞在37°C下沉淀在琼脂糖垫上至少1小时。
3. 延时荧光显微镜
- 将制备的样品（步骤1.3）放在荧光显微镜（参见 材料表）上，在加热并保持在37°C的环境中。
- 设置适合用于图像采集的相机的曝光时间。调整照明强度以尽量减少光漂白。
注意：本研究使用每个波长的2秒曝光时间。 - 对于每个波长，找到一个包含最小荧光的视场（FOV）。获取要在分析过程中用于背景减法的图像。
- 设置适合用于图像采集的相机的曝光时间。调整照明强度以尽量减少光漂白。
- 设置协议以不同波长和固定时间间隔采集网格中的图像。
- 将延时摄影编码到协议中。将采集频率设置为所需的时间间隔（此处为20分钟），将总延时持续时间设置为所需的长度（24小时）。
- 将适当的波长编码到协议中（取决于所使用的结构）。
注意：mCherry激发峰在587 nm处，发射峰在610 nm21处;mVenus位于515 nm和527 nm12，而mCerulean3位于433 nm和475 nm11。 - 设置网格大小以在所需数量的 FOV 之间捕获。
注意：此处显示的代表性数据使用了 8 x 8 FOV。
4. 图像分析
- 使用在步骤3.1.2中获取的相应背景图像对每个颜色通道进行背景减法。对于所有分析步骤，我们使用开源平台斐济22 中的标准模块（见 材料表）。
- 通过阈值化 mCerulean 通道并将阈值面积除以平均细胞面积来近似每个时间点的总群体。
- 要计算独特的切除事件，请采用mCerulean3通道的时间导数。通过减去 mCerulean3 通道中的连续图像来执行此操作。切除事件将在时间导数中检测为明亮的荧光闪光。
- 阈值切除事件堆栈以消除不需要的荧光。请注意，此过程将阈值部分切除本身。要解决此问题，请放大图像以将切除物恢复到原始大小。
注意：使用类似的阈值和图像分析技术的分析也可以在其他荧光通道上进行（例如，将切除事件与转座酶TnpA [黄色金星荧光]和TnpB [红色mCherry荧光]的水平相关联]。
- 阈值切除事件堆栈以消除不需要的荧光。请注意，此过程将阈值部分切除本身。要解决此问题，请放大图像以将切除物恢复到原始大小。
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Representative Results
这种通过荧光显微镜可视化活细胞中转座子活性的方法虽然通量低于批量荧光测量，但允许直接可视化单个活细胞中的转座子活性。转座子切除事件导致mCerulean3启动子的重建（图1），允许通过亮蓝色荧光鉴定经历转座子活性的细胞（图2，TnpB +：补充电影1和TnpB-：补充电影2）。
研究发现，表达辅助蛋白TnpB（图3，橙色）的细胞的转座子活性水平比不表达的细胞高4-5倍（图3，蓝色），与更详细的体积水平研究一致19。这一点尤其值得注意，因为mCherry-tnpB编码序列的加入使转座子的长度增加了~2，000 bp，而先前的研究发现IS608转座子切除是转座子长度23的指数递减函数。
实时成像的一个优点是，一旦鉴定出来，就可以进一步跟踪和分析经历转位事件的细胞，以确定其他特征参数，例如生长速率，以确定适应度效应的分布或辅助蛋白的表达水平，以确定它们对转位活性的影响。例如，在TnpB +细胞中，经历转座子切除事件的细胞具有比一般群体更高的mCherry-TnpB表达水平（图4A）。此外，对于经历切除事件的细胞（图4B，深黄色），TnpB +细胞（图4B，底部）表达的Venus-TnpA转座酶水平仅略高于TnpB-细胞（图4B，顶部）（TnpB-158.3±68.2 AU，TnpB +：193±79.9 AU），高于一般人群的黄色荧光（图4B，浅黄色）。综上所述，这些数据表明TnpB蛋白是观察到的更高水平的转位活性的原因。
图1：用于实时转座子动力学成像的遗传结构。 （A）mCerulean3启动子被TE破坏，TE的末端两侧是左端和右端错误的回文序列（LE IP和RE IP）。转座酶 tnpA （灰色）由PLtetO1表达，其受 tet 阻遏剂（灰色）调节，可与无水四环素（aTc）诱导。启动子/TE结和启动子-10和-35序列（红色框）以及TnpA切割位点的序列用箭头表示。（B）TnpB+构建体是mCherry-tnpB与Venus-tnpA 转录融合的地方，使得两者都被转录为多顺反子mRNA ，模仿 IS608的自然构型。（C）切除后，mCerulean3启动子被修复，细胞呈现蓝色荧光。重构的启动子序列显示在图下方。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：转座子切除事件的可视化。 TnpB+的示例视野，细胞（A）紧接在通过蓝色荧光检测转座子切除事件之前和（B）之后。白色箭头表示切除事件。两帧之间的时间差为 20 分钟。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：TnpB 提高转座子切除率。TnpB +细胞（橙色）和TnpB-（蓝色）细胞的切除率。三个重复的平均速率显示为具有阴影区域的点，置信区间为95%。对齐数据，以便细胞在t = 0处开始切除。TnpB +细胞的最大测量速率为每小时每个细胞5.1±2.4×10-2个事件，而TnpB-的最大测量速率为每小时每个细胞1.4±0.48×10-2个事件。对于TnpB +细胞，显示的整个间隔内的平均速率为每小时每个细胞2.6±1.8×10-2个事件，对于TnpB-细胞，每个细胞每小时5.3±2.9×10-3个事件。请点击此处查看此图的大图。
图4：切除细胞与总细胞群的蛋白质表达统计。 将每个帧分成64个相等的块，并测量块内切除的细胞和块内包含的所有细胞的荧光，无论切除活性如何。在 y 轴上绘制的概率的测量方法是每种像元类型中指示强度的像素数除以像素总数。每帧的块大小设置为 445 x 445 像素。（A）经历切除事件的细胞（深红色）比一般人群（浅红色）表达更多的TnpB。切除细胞的平均红色荧光为51.3±15.4 AU（深红色），而所有细胞的平均红色荧光为42.5±7.4 AU（浅红色）。（B）金星-TnpA转座酶水平在TnpB-（顶部）和TnpB +（底部）细胞中相似。对数据集进行归一化，以便总细胞群（浅黄色）的平均黄色荧光在 105.7 AU 处与 TnpB+/- 相等。已被鉴定为经历转座子切除事件（深黄色）的细胞表现出比一般人群更高的黄色荧光，TnpB-（顶部）和TnpB +（底部）的分布相似。切除人群的平均黄色荧光为TnpB-：158.3 ± 68.2 AU和TnpB +：193 ± 79.9 AU。 请点击此处查看此图的大图。
补充视频1：具有TnpB表达的 IS608 切除的实时动力学。 播放实时 IS608 动态的 5 小时片段的电影;每20分钟捕获一帧。 IS608切除可视化为亮蓝色荧光的发展。影片中显示的细胞包括TnpB的表达。 请点击这里下载此文件。
补充视频2：无TnpB表达的 IS608 切除的实时动力学。 播放实时 IS608 动态的 5 小时片段的电影;每20分钟捕获一帧。 IS608 切除可视化为亮蓝色荧光的发展。影片中显示的细胞不包括TnpB的表达。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
这里介绍的用于实时成像活细胞中转座元件活性的独特方法是一种灵敏的测定，可以直接实时检测活细胞中的转位，并将该活性与辅助蛋白的表达相关联。虽然通量低于体积方法所能达到的通量，但该方法可以详细测量单个活细胞中的TE活性和蛋白质表达。
可以使用各种工具和技术直接在显微镜上培养细胞以进行实时成像。这里使用的琼脂糖垫上的细胞生长方法具有快速、便宜且易于执行的优点。根据感兴趣的细胞生长状态，一个可能的缺点是可用于支持琼脂糖垫中细胞生长的资源是有限的，因此细胞会自然耗尽这些资源并在相对较短的时间内停止生长（12-24小时）。因此，必须注意准备稳定生长状态的细胞，并以足够低的密度接种垫，以便有足够的时间进行测量。微流体可用于长时间将细胞保持在稳态指数增长状态24，尽管这些方法需要额外的专业知识，设备和设置才能有效。
作为Kuhlman实验室19更详细工作的补充，这里说明IS200 / IS605 TE家族相关蛋白TnpB将IS608切除率提高了五倍，并且切除的增加与TnpB的更高表达水平直接相关。这些方法是改进测定技术的一个例子，可能有助于阐明转座子活性及其对突变和进化动力学的影响。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究的财政支持由加州大学的启动资金提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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