Sanntidskvantifisering av effektene av IS200/IS605 Familieassosiert TnpB på Transposonaktivitet
Summary
En protokoll er skissert for å utføre live sanntidsavbildning for å kvantifisere hvordan tilbehørsproteinet TnpB påvirker transposisjonsdynamikken i individuelle levende Escherichia coli-celler .
Abstract
Her skisseres en protokoll for å utføre live, sanntidsavbildning av transponibel elementaktivitet i levende bakterieceller ved hjelp av en serie fluorescerende reportere koblet til transponering. Spesielt demonstrerer det hvordan sanntidsbilder kan brukes til å vurdere effekten av tilbehørsproteinet TnpB på aktiviteten til det transponerbare elementet IS608, et medlem av IS200 / IS605-familien av transponerbare elementer. IS200/IS605-familien av transponerbare elementer er rikelig med mobile elementer forbundet med et av de mest utallige gener som finnes i naturen, tnpB. Sekvens homologier foreslår at TnpB-proteinet kan være en evolusjonær forløper til CRISPR / Cas9-systemer. I tillegg har TnpB fått fornyet interesse, etter å ha vist seg å fungere som en Cas-lignende RNA-guidet DNA-endonuklease. Effektene av TnpB på transposisjonshastighetene til IS608 er kvantifisert, og det er vist at uttrykket av TnpB av IS608 resulterer i ~ 5x økt transposonaktivitet sammenlignet med celler som mangler TnpB-uttrykk.
Introduction
Transponerbare elementer (TEs) er genetiske elementer som mobiliserer i vertsgenomene ved eksisjon eller katalyseringskopiering etterfulgt av genomisk reintegrasjon. TEer finnes i alle livets domener, og transposisjon omstrukturerer vertsgenomet, muterer kodings- og kontrollområder1. Dette genererer mutasjoner og mangfold som spiller en viktig rolle i evolusjon2,3, utvikling4,5 og flere menneskelige sykdommer6, inkludert kreft7.
Ved å bruke nye genetiske konstruksjoner som par aspekter av transposisjonell aktivitet til fluorescerende reportere, beskrev vårt tidligere arbeid utviklingen av et eksperimentelt system basert på bakteriell TE IS608, en representant for den utbredte IS200 / IS605-familien av TEer, som muliggjør sanntidsvisualisering av transposisjon i individuelle levende celler8 (figur 1). TE-systemet vises i figur 1A. TE består av transposasekodingssekvensen, tnpA, flankert av venstre ende (LE) og høyre ende (RE) ufullkomne palindromiske repetisjoner (IP-er), som er gjenkjennings- og eksisjonsstedene for TnpA. tnpA uttrykkes ved hjelp av promotoren PLTetO1, som undertrykkes av tet-repressoren og kan induseres med anhydrotetracyklin (aTc)9. TE deler -10 og -35 sekvensene av en konstitutiv PlacIQ1 promotor10 for den blå reporteren mCerulean311. Som vist i figur 1C, når produksjonen av tnpA induseres, kan TE skåret ut, noe som fører til rekonstituering. Den produserte cellen uttrykker mCerulean3 og fluoresces blå. N-enden av TnpA er smeltet sammen med den gule reporteren Venus12, slik at måling av TnpA-nivåene ved gul fluorescens.
IS608 og andre medlemmer av IS200/IS605-familien av transposoner koder også vanligvis for et annet gen av den hittil ukjente funksjonen, tnpB13. TnpB-proteinene er en enormt rikelig, men ufullkommen karakterisert familie av nukleaser kodet av flere bakterielle og arkeale TEs14,15, som ofte består av bare tnpB16. Videre har nyere studier fornyet interessen for TnpB ved å finne at TnpB fungerer som en CRISPR / Cas-lignende programmerbar RNA-guidet endonuklease som vil gi enten dsDNA eller ssDNA pauser under forskjellige forhold17,18. Det er imidlertid fortsatt uklart hvilken rolle TnpB kan spille i regulering av transponering. For å utføre sanntidsvisualisering av effekten av TnpB på IS608-transposisjon, ble det opprettet en versjon av transposonet, inkludert kodingsområdet til TnpB med en N-terminal fusjon til det røde fluorescerende proteinet mCherry.
I tillegg til mer detaljerte bulknivåstudier utført av Kuhlman-laboratoriet19, vises det her hvordan sanntidsavbildning av transposonaktivitet kvantitativt kan avsløre virkningen av TnpB eller andre tilbehørsproteiner på transposisjonsdynamikk. Ved å fusjonere TnpB til mCherry identifiseres de enkelte transposisjonelle hendelsene ved blå fluorescens og korreleres med ekspresjonsnivåer av TnpA (gul fluorescens) og TnpB (rød fluorescens).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den unike metoden som presenteres her for sanntidsavbildning av transponibel elementaktivitet i levende celler, er en sensitiv analyse som direkte kan oppdage transposisjon i levende celler og i sanntid og korrelere denne aktiviteten med uttrykket av tilbehørsproteiner. Mens gjennomstrømningen er lavere enn det som kan oppnås ved bulkmetoder, oppnår denne metoden detaljerte målinger av TE-aktivitet og proteinuttrykk i individuelle levende celler.
En rekke verktøy og teknikker kan brukes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Økonomisk støtte til denne forskningen ble gitt av oppstartsmidler fra University of California.
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
