Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياس معدل تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية خارج الجسم الحي والخلايا preadipocytes الأولية متمايزة في المختبر

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

تحلل الدهون الثلاثية في الخلايا الشحمية هو عملية التمثيل الغذائي الهامة التي تؤدي إلى تحرير الأحماض الدهنية الحرة والجلسرين. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لقياس تحلل الدهون القاعدي والمحفز في الخلايا الشحمية والأنسجة الدهنية خارج الجسم الحي من الفئران.

Abstract

تخزن الخلايا الشحمية الطاقة في شكل دهون ثلاثية في قطرات الدهون. يمكن تعبئة هذه الطاقة عن طريق تحلل الدهون ، حيث يتم شق السلاسل الجانبية للأحماض الدهنية بالتتابع من العمود الفقري للجلسرين ، مما يؤدي إلى إطلاق الأحماض الدهنية الحرة والجلسرين. نظرا لانخفاض تعبير كيناز الجلسرين في الخلايا الشحمية البيضاء ، فإن معدلات إعادة امتصاص الجلسرين لا تكاد تذكر ، في حين أن إعادة امتصاص الأحماض الدهنية تمليها قدرة ربط الأحماض الدهنية لمكونات الوسائط مثل الألبومين. يمكن قياس كل من إطلاق الجلسرين والأحماض الدهنية في الوسائط عن طريق المقايسات اللونية لتحديد معدل تحلل الدهون. من خلال قياس هذه العوامل في نقاط زمنية متعددة ، يمكن للمرء تحديد المعدل الخطي لتحلل الدهون بثقة عالية. هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لقياس تحلل الدهون في الخلايا الشحمية المتمايزة في المختبر والأنسجة الدهنية خارج الجسم الحي من الفئران. يمكن أيضا تحسين هذا البروتوكول لخطوط خلايا preadipocyte الأخرى أو الأنسجة الدهنية من الكائنات الحية الأخرى. تتم مناقشة الاعتبارات ومعلمات التحسين. تم تصميم هذا البروتوكول ليكون مفيدا في تحديد ومقارنة معدل تحلل الدهون الشحمية بين نماذج الفئران والعلاجات.

Introduction

يتم تخزين العناصر الغذائية الزائدة في الأنسجة الدهنية البيضاء في شكل الدهون الثلاثية في قلب الدهون المحايدة لقطرات الدهون. يتم تعبئة مخازن الدهون الثلاثية عن طريق تحلل الدهون ، وهي عملية يتم من خلالها شق السلاسل الجانبية للأحماض الدهنية بالتتابع بواسطة ليباز الأنسجة الدهنية الثلاثية (ATGL) ، والليباز الحساس للهرمونات (HSL) ، والليباز أحادي الجليسريد (MGL) ، مما يؤدي إلى إطلاق الأحماض الدهنية الحرة (FFAs) والعمود الفقري للجلسرين 1,2. يتم تنشيط تحلل الدهون عن طريق إشارات الكاتيكولامين في الأنسجة الدهنية. تطلق المحطات العصبية الودية محليا الكاتيكولامينات ، التي ترتبط بمستقبلات β الأدرينالية على غشاء البلازما الشحمية. عند ربط الرباط ، تعمل مستقبلات البروتين G المقترنة (GPCRs) على تنشيط سيكلاز الأدينيل عبر Gαs. يؤدي التنشيط اللاحق لبروتين كيناز A (PKA) بواسطة cAMP إلى زيادة تنظيم كل من ATGL و HSL. تتسبب فسفرة perilipin-1 بواسطة PKA في تفكك ABHD5 (المعروف أيضا باسم CGI-58) ، والذي يربط وينشط ATGL3. PKA يفسفر مباشرة HSL ، وتعزيز انتقاله من السيتوسول إلى قطرة الدهون ، حيث التفاعل مع perilipin-1 المفسفر يعزز نشاط الليباز4،5،6،7. لا يبدو أن الليباز الثالث المتورط في تحلل الدهون ، MGL ، يتم تنظيمه بواسطة إشارات الكاتيكولامين8. الأهم من ذلك ، يتم التوسط في تخليق الدهون الثلاثية في الخلايا الشحمية عن طريق مسار تخليق الدهون الجلسرين ، والذي لا ينطوي على تكوين أحادي الجليسريد كوسيط. بدلا من ذلك ، تحفز ترانسفيراز أسيل الجلسرين -3 فوسفات تكوين حمض الليسوفوسفاتيديك ، والذي يتم دمجه مع أسيل دهني آخر لتشكيل حمض الفوسفاتيديك ، ثم يتم إيزوميره إلى ثنائي الجليسريد قبل التوليف النهائي للدهون الثلاثية (الشكل 1)9،10،11.

Figure 1
الشكل 1: مسارات تخليق تحلل الدهون وشحوم الجليسرول. أعلى: مسار تحلل الدهون. الإنزيمات الموضحة باللون الأحمر: ليباز الأنسجة الدهنية الثلاثية (ATGL) ، الليباز الحساس للهرمونات (HSL) ، والليباز أحادي الجليسريد (MGL). أسفل: مسار تخليق الدهون الجلسرين. الإنزيمات الموضحة باللون الأخضر: ديجليسريد أسيلترانسفيراز (DGAT) ، فوسفاتيز حمض الفوسفاتيديك (PAP) ، حمض الليسوفوسفاتيديك أسيلترانسفيراز (LPAT ، المعروف أيضا باسم LPAATs) ، والجلسرين -3-فوسفات أسيلترانسفيراز (GPAT). الدهون: الدهون الثلاثية (TG) ، ثنائي الجليسريد (DG) ، أحادي الجليسريد (MG) ، الأحماض الدهنية الحرة (FFA) ، الأسيل الدهني CoA (FA-CoA) ، حمض الليسوفوسفاتيديك (LPA) ، وحمض الفوسفاتيديك (PA). المستقلبات الأخرى: الفوسفات غير العضوي (Pi) والجلسرين 3-فوسفات (G3P). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الأدينوزين خارج الخلية هو منظم مهم آخر لتحلل الدهون ، يعمل من خلال GPCRs المقترنة ب Gs و Gi للتأثير على نشاط أدينيل سيكلاز. مستقبلات الأدينوزين السائدة في الخلايا الشحمية ، ADORA1 ، تمنع سيكلاز الأدينيل ، وبالتالي تحلل الدهون من خلال تنشيط Gi12. يتم التعبير عن ADORA2A عند مستويات أقل ، وفي المقام الأول في الخلايا الشحمية البنية ، وينشط تحلل الدهون عبر إشارات Gs 13. يؤثر ADORA1 على كل من تحلل الدهون القاعدي والاستجابة للمنبهات الأدرينالية. يمكن التحكم في تأثير الأدينوزين على تحلل الدهون عن طريق إضافة أدينوزين دياميناز لتحييد الأدينوزين ، بالإضافة إلى ناهض فينيل إيزوبروبيل أدينوزين الخاص ب ADORA114,15. يمكن أن يؤثر التنشيط الهرموني ل GPCRs المقترنة ب Gq أيضا على تحلل الدهون عن طريق تنشيط الفوسفوليباز C وبروتين كيناز C16،17،18،19. تؤثر الإشارات الالتهابية أيضا على معدلات تحلل الدهون. يزيد تنشيط TLR4 بواسطة LPS (والسموم الداخلية الأخرى) من معدل تحلل الدهون عن طريق تنشيط ERK ، الذي يفسفر perilipin-1 و HSL20. ينشط TNF-α أيضا تحلل الدهون عبر تنشيط ERK و NF-κB ، بالإضافة إلى تقليل التنظيم النسخي ل phosphodiesterase PDE-3B و CIDEC21،22،23. ارتبط IL-6 أيضا بزيادة تحلل الدهون في الخلايا الشحمية ، خاصة في الأنسجة الدهنية المساريقية ، التي يؤثر إطلاقها FFA على التنكس الدهني الكبدي وتكوين الجلوكوز24،25،26.

يتم قمع تحلل الدهون أثناء حالة التغذية بواسطة الأنسولين. AKT يفسفر وينشط PDE-3B لقمع إشارات cAMP ومنع تنشيط PKA27. الأنسولين أيضا يقلل من النسخ ينظم ATGL28. تعزز السمنة مقاومة الكاتيكولامين من خلال مجموعة متنوعة من الآليات ، بما في ذلك خفض تنظيم مستقبلات β الأدرينالية في الخلايا الشحمية29،30،31،32،33. تعبر الخلايا الشحمية عن المستقبلات β الأدرينالية الثلاثة (β-1 و β-2 و β-3). بينما يتم التعبير عن المستقبلات الأدرينالية β-1 و β-2 في كل مكان ، يتم التعبير عن مستقبلات الأدرينالية β-3 في الغالب في الخلايا الشحمية في الفئران34,35. يتم تحفيز تعبير Adrb3 بواسطة C / EBPα أثناء تكوين الدهون36. يتم التعبير عن مستقبلات الأدرينالية β-3 بشكل كبير في الخلايا الشحمية الناضجة. تنشيط مستقبلات β-1 و β-2 الأدرينالية محدود ذاتيا بسبب تثبيط التغذية المرتدة بواسطة β-arrestin37. يتم تثبيط التغذية المرتدة للمستقبلات الأدرينالية β-3 بواسطة مسارات إشارات أخرى ، مما يقلل من تعبير Adrb3 33،38،39.

يمكن استخدام العديد من المركبات لتنشيط تحلل الدهون في الخلايا الشحمية. الكاتيكولامينات هي المنشطات الفسيولوجية الرئيسية لتحلل الدهون. يقوم النورإبينفرين (أو النورادرينالين) والإبينفرين (أو الأدرينالين) بتنشيط جميع مستقبلات β الأدرينالية الثلاثة40. يؤثر النورإبينفرين والإبينفرين أيضا على تحلل الدهون عن طريق تنشيط إشارات مستقبلات α الأدرينالية41. تشمل ناهضات مستقبلات β الأدرينالية شائعة الاستخدام الأيزوبروتيرينول ، وهو ناهض غير انتقائي لمستقبلات β الأدرينالية ، ومنبهات مستقبلات الأدرينالية β-3 CL-316,243 و mirabegron42. بالنظر إلى أن الخلايا الشحمية تعبر في الغالب عن مستقبلات الأدرينالية β-3 ، فإننا نستخدم CL-316,243 كمثال هنا. كما أن خصوصيته للمستقبلات الأدرينالية β-3 تجعله منشطا محددا نسبيا لإشارات الكاتيكولامين الشحمية ، والتي يمكن استخدامها أيضا بأمان في الجسم الحي. لاحظ أن التركيز الشائع الاستخدام البالغ 10 ميكرومتر CL-316,243 في زراعة الخلايا هو أوامر من حيث الحجم أعلى من جرعة ~ 0.1 ميكرومتر المطلوبة لتحقيق أقصى استجابة33. يتجاوز Forskolin مستقبلات الأدرينالية ، وينشط مباشرة سيكلاز adenylyl وإشارات تحلل الدهون النهائية. هناك العديد من المنشطات ، وكذلك مثبطات تحلل الدهون. عند اختيار مركب لتحفيز تحلل الدهون ، يجب مراعاة خصوصية المستقبلات ومسارات إشارات المصب بعناية في التصميم التجريبي.

يعد معدل تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية البيضاء عاملا استقلابيا مهما يؤثر على تحمل البرد وتوافر المغذيات أثناء الصيام أو ممارسةالرياضة 43،44،45،46. الغرض من هذا البروتوكول هو قياس معدل تحلل الدهون في الخلايا الشحمية والأنسجة الدهنية ، مما يسهل فهم استقلاب الخلايا الشحمية وكيف يمكن أن يؤثر على النمط الظاهري الأيضي لنماذج الفئران المختلفة. لتحديد معدل تحلل الدهون ، نقيس مظهر المنتجات المحللة للدهون في الوسائط (مثل FFAs والجلسرين). تعتمد الطريقة على إطلاق منتجات تحلل الدهون من الخلايا الشحمية إلى الوسائط. نظرا لأن الخلايا الشحمية البيضاء تعبر عن مستويات منخفضة من كيناز الجلسرين ، فإن معدلات امتصاص الجلسرين منخفضة47. على العكس من ذلك ، ينبغي أيضا النظر في إنتاج FFAs والجلسرين عن طريق مسارات التمثيل الغذائي بخلاف تحلل الدهون. يبدو أن الخلايا الشحمية تعبر عن الفوسفاتيز مع نشاط ضد فوسفات الجلسرين -3 ، مما يتيح إنتاج الجلسرين من الجلسرين -3 فوسفات المشتق من الجلوكوز48،49،50. تحلل السكر هو مصدر للجلسرين -3 فوسفات المستخدم لإعادة أسترة FFA في الخلايا الشحمية البيضاء. عندما تكون مستويات الجلوكوز محدودة ، يتطلب تكوين الجليسرون مصادر 3 كربون أخرى ، مثل اللاكتات والبيروفات51. إن توجيه FFAs الصادر عن تحلل الدهون داخل الخلية ومصيرها الأيضي غير مفهوم بشكل جيد ؛ يجب تحويل FFAs المنبعثة عن تحلل الدهون إلى أسيل CoA دهني ، قبل إعادة أسترة أو الخضوع للأكسدة β. يبدو أن FFAs التي يطلقها تحلل الدهون من المحتمل أن تخرج من الخلية قبل أن يتم أخذها مرة أخرى وتحويلها إلى أسيل دهني CoA 52،53،54،55،56،57،58،59،60،61،62. يمكن عزل FFAs خارج الخلية بواسطة الألبومين. الأهم من ذلك ، من المعروف أن FFAs طويلة السلسلة تمنع تحلل الدهون إذا لم يتم عزلها بواسطة الألبومين63،64،65،66،67. وبالتالي ، فإن تحسين قدرة التخزين المؤقت FFA للوسائط أثناء مقايسة تحلل الدهون أمر بالغ الأهمية. يشبه الإجراء الموصوف هنا الطرق المنشورة سابقا لقياس معدل تحلل الدهون في الخلايا الشحمية والأنسجة الدهنية خارج الجسم الحي من الفئران والبشر15،68،69،70،71. يختلف هذا البروتوكول من خلال استخدام أخذ العينات التسلسلية. من خلال إجراء أخذ العينات التسلسلية ، يمكننا التحقق داخليا من أن تحلل الدهون يتم قياسه في الطور الخطي واستخدام قياسات متعددة لحساب معدل تحلل الدهون ، وبالتالي تقليل خطأ القياس لزيادة الثقة في القيمة النهائية المحسوبة. عيب أخذ العينات التسلسلية هو أن الفحص يتطلب المزيد من الوقت والكواشف. ومع ذلك ، فإن الإطار الزمني الأطول يقلل من تأثير خطأ القياس على الخطأ المعياري لتقديرات المعدل. بالإضافة إلى ذلك ، يقيس هذا البروتوكول كلا من FFA وإطلاق الجلسرين ، ويأخذ في الاعتبار نسبة FFA: إطلاق الجلسرين بهدف تحقيق نسبة 3: 1 ، كما هو متوقع من تحلل الدهون الكامل وإطلاق المنتجات المحللة للدهون في الوسائط72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على استخدام جميع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في كلية طب وايل كورنيل بجامعة كورنيل.

1. إعداد المخازن المؤقتة ولوحات التجميع

  1. اصنع 5٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) عن طريق إذابة 5 جم من BSA في 100 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بدون الفينول الأحمر. حرك BSA برفق ليذوب (الاهتزاز يؤدي إلى نتائج عكسية). بمجرد إذابة BSA بالكامل ، قم بتعقيم الوسائط بمرشح 0.2 ميكرومتر. قم بتخزين وسائط BSA في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  2. جعل تركيزات العمل من وسائط التحكم والتحفيز. وسائط التحكم: وسائط BSA بنسبة 5٪ مع التحكم في السيارة. وسائط التحفيز: وسائط BSA بنسبة 5٪ مع 0.5 ميكرومتر CL-316,243. اصنع وسائط تحفيز جديدة لكل تجربة.
  3. قم بتسخين الوسائط لاستخدامها حتى 37 درجة مئوية. قم بتسمية لوحة 96 بئرا لجمع الوسائط.

2. إعداد عينة

  1. إجراء زراعة الخلايا كما هو موضح أدناه. قم بجميع أعمال الخلية في غطاء دخان معقم لتقليل التلوث الخارجي.
    1. عزل وتمييز الخلايا الأولية preadipocytes ، كما هو الحال في73,74.
      1. صفيحة الخلايا الأولية الأولية بكثافة عالية ، مثل 1 × 105 خلايا / بئر في صفيحة 24 بئرا في 1 مل / وسط استزراع جيد (15٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1x بنسلين-ستربتومايسين-جلوتامين في DMEM / F12).
      2. بعد أن تصل الخلايا إلى التقاء 100٪ ، تمايز مع 5 ميكرومتر ديكساميثازون ، 0.5 مللي متر 3-إيزوبوتيل -1-ميثيل زانثين ، 1 ميكروغرام / مل أنسولين ، و 1 ميكرومتر ثيازوليدينيديون (TZD) في وسط الثقافة لمدة 3 أيام. بعد ذلك ، قم بالتغيير إلى وسائط الاستزراع باستخدام 1 ميكروغرام / مل من الأنسولين لمدة 3 أيام على الأقل لتنمو قطرات الدهون. استخدم 1 مل / بئر من الوسائط في لوحة 24 بئرا.
      3. تغيير وسط الاستزراع (1 مل / بئر) مع الأنسولين كل 2 أو 3 أيام. يمكن الحفاظ على الخلايا في وسائل الإعلام مع الأنسولين لمدة تصل إلى 2 أسابيع. استخدم فقط الثقافات التي تزيد فيها معدلات التمايز عن 90٪ وتكون متشابهة عبر المجموعات لهذا الفحص ، حيث يمكن إساءة تفسير التمايز المنخفض على أنه انخفاض في معدل تحلل الدهون.
      4. استزراع الخلايا في وسائط خالية من الأنسولين لمدة 24 ساعة قبل قياس تحلل الدهون.
        ملاحظة: يحافظ الأنسولين الموجود في الوسائط على قطرات الدهون ، ولكنه يمنع أيضا تحلل الدهون. الحضانة بدون الأنسولين لمدة 24 ساعة تسمح بالتنشيط الكامل للدهون دون فقدان حجم قطرات الدهون. في بعض الأنظمة ، قد يحتاج وقت المزرعة بدون الأنسولين إلى تقصير أو تمديد.
    2. اغسل الخلايا باستخدام DPBS مرة واحدة لإزالة المصل المتبقي من وسائط الاستزراع.
      ملاحظة: لا يشمل هذا البروتوكول تجويع المصل ، والذي يمكن أن ينشط تحلل الدهون. يمكن استخدام تجويع المصل وفقا لتقدير الباحث.
  2. أداء ثقافة خارج الجسم الحي كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإعداد صفيحة من 6 آبار ، مع بئر واحد لكل نسيج يتم جمعه من كل فأر. ضع 4 مل من DMEM بدرجة حرارة الغرفة في كل بئر لاستخدامها.
      ملاحظة: BSA في وسائط المجموعة ليست ضرورية.
    2. قم بإعداد لوحة من 48 بئرا لمقايسة تحلل الدهون ، مع بئر واحد لكل نسخة مكررة. ضع 400 ميكرولتر من DMEM بدرجة حرارة الغرفة في كل بئر لاستخدامها. استخدم اثنين إلى أربعة عناصر تحكم واثنين إلى أربعة آبار محفزة لكل نسيج لكل فأر.
    3. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم تحت التخدير ، مع طريقة ثانوية مثل استرواح الصدر الثنائي. هنا ، استخدمنا فأرة C57BL / 6J تبلغ من العمر 32 جراما ، تبلغ من العمر 7 أشهر ، تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون بنسبة 45٪ لمدة 4 أشهر.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للذكور ، بالإضافة إلى السلالات الأخرى والوجبات الغذائية والأعمار.
    4. رش بالإيثانول بنسبة 70٪ واستخدم المقص لعمل شق جانبي صغير (~ 1 سم) في وسط جلد البطن ، واسحب الجلد بعيدا عن طريق الضغط على أي من الجانبين بالإبهام والسبابة وقم بطي جلد أسفل البطن للكشف عن المستودعات الخلفية تحت الجلد. حدد موقع العقدة الليمفاوية الأربية وأزلها وقم بتشريح الأنسجة الدهنية الأربية مباشرة خلف العقدة الليمفاوية الأربية باستخدام الملقط.
    5. لجمع الأنسجة الدهنية للغدد التناسلية ، قم بعمل شق جانبي وعمودي في الصفاق للوصول إلى التجويف البريتوني. امسك وسادة الدهون في الغدد التناسلية بملاقط واقطعها على طول الرحم (أو البربخ للذكور) لإزالة الأنسجة الدهنية للغدد التناسلية. ضع المستودعات المجمعة في طبق من 6 آبار.
    6. أخرج المنديل من البئر ، وضعه على حصيرة سيليكون ، وقطع إلى قطع من 5 إلى 7 ملغ بالمقص.
    7. قم بوزن 25 إلى 30 مجم (خمس أو ست قطع) لكل فحص جيد وضعه في لوحة فحص 48 بئرا. امسح المنديل على منشفة نظيفة قبل وزنها لإزالة أي وسائط. قم بوزن قارب الوزن بعد إزالة الأنسجة وسجل وزن أي بقايا متبقية. امسح قارب الوزن نظيفا بين العينات وأعد تنظيفه إذا لزم الأمر. استخدم قارب وزن جديد لكل منديل.
    8. بمجرد وزن جميع عينات الأنسجة ، ضع لوحة فحص 48 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 10٪ CO2 لمدة 15 دقيقة.

3. مقايسة تحلل الدهون

  1. أداء جمع الوسائط. القيام بنقل الوسائط وجمع العينات لاحقا في غطاء دخان معقم لتقليل التلوث المحتمل من المصادر الخارجية.
    1. عند t = 0 ، قم بإزالة الوسائط وإضافة 400 ميكرولتر لكل بئر من وسائط التحكم أو التحفيز ، ووضع فحص اللوحة في حاضنة CO2 37 درجة مئوية ، 10٪. لزراعة الأنسجة خارج الجسم الحي ، قم بإزالة الوسائط بعناية باستخدام ماصة ؛ لا ينبغي أبدا استخدام الشفط.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بإعداد لوحة ثانية مع وسائط التحكم والتحفيز ، ونقل الأنسجة.
    2. عند t = 1 و 2 و 3 و 4 ساعات ، اجمع 200 ميكرولتر من الوسائط ، واستبدلها ب 200 ميكرولتر من وسائط التحكم أو التحفيز المناسبة ، وأعد لوحة الفحص إلى الحاضنة. قم بتخزين لوحة التجميع في درجة حرارة 4 درجات مئوية. لتحديد سعة التخزين المؤقت FFA لوسائط BSA ، استخدم مجموعة إضافية عند 24 ساعة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجارب هنا ، ويمكن تخزين الوسائط المجمعة عند -20 درجة مئوية.

4. مقايسة القياس اللوني FFA

  1. قم بتسخين الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة وقم بإذابة زجاجة واحدة من الكاشف الملون A بزجاجة واحدة من المذيب A ، وزجاجة واحدة من الكاشف الملون B مع زجاجة واحدة من المذيب B. من تاريخ إعادة التكوين ، من الأفضل استخدام هذه الكواشف في غضون 1 أسبوع. تجاهل 1 شهر بعد إعادة التكوين.
  2. ذوبان وخلط العينات.
  3. إنشاء منحنى قياسي FFA. الحل القياسي هو 1 مللي مول. استخدم الحجم التالي مع الكواشف للمنحنى القياسي: 25 ميكرولتر ، 20 ميكرولتر ، 15 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر (تخفيف 1: 2) ، 10 ميكرولتر (تخفيف 1: 4) ، 10 ميكرولتر (تخفيف 1: 8) ، و 10 ميكرولتر ماء لأقصى نطاق. بالنسبة لمستويات FFA المنخفضة ، قد يكون معيار 10 ميكرولتر من 1 mM و 0.8 mM و 0.6 mM و 0.4 mM و 0.2 mM و 0.1 mM و 0.05 mM أكثر قابلية للتطبيق.
  4. معايير وعينات ماصة في لوحة فحص 96 بئرا. حجم العينة الموصى به هو 10 ميكرولتر. قم بتضمين ثلاثة آبار بنفس حجم وسائط BSA مثل عينات تصحيح الخلفية.
    ملاحظة: إذا كانت تركيزات العينة تقع خارج نطاق المنحنى القياسي ، كرر الفحص ، واضبط حجم العينة إلى 2-25 ميكرولتر.
  5. أضف 150 ميكرولتر من الكاشف A إلى كل بئر واخلطها. تجنب توليد الفقاعات. فرقع أي فقاعات بإبرة قياس دقيقة. احتضان لوحة الفحص على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. اقرأ امتصاص اللوحة عند 550 نانومتر ومرجع 660 نانومتر (القراءة أ).
  7. أضف 75 ميكرولتر من الكاشف B إلى كل بئر واخلطها. تجنب توليد الفقاعات. فرقع أي فقاعات بإبرة قياس دقيقة. احتضان لوحة الفحص على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. اقرأ امتصاص اللوحة مرة أخرى عند 550 نانومتر ومرجع 660 نانومتر (القراءة ب).

5. مقايسة الجلسرين اللوني

  1. أعد تكوين كاشف الجلسرين الحر ب 36 مل من الماء عالي النقاء وتأقلم مع درجة حرارة الغرفة. من الأفضل استخدام هذه الكواشف في غضون أسابيع قليلة. تجاهل 2 أشهر بعد إعادة التكوين.
  2. ذوبان وخلط العينات.
  3. قم بإنشاء منحنى قياسي للجلسرين عن طريق عمل تخفيف تسلسلي من سبع نقاط ، 2 أضعاف من محلول الجلسرين القياسي وفراغ مائي.
    ملاحظة: المنحنى القياسي خطي نسبيا يصل إلى 25 ميكرولتر من 2.8 مللي متر من الجلسرين ، ولكنه ليس خطيا بتركيزات أعلى.
  4. ماصة 25 ميكرولتر لكل من المعايير والعينات في لوحة فحص 96 بئرا. قم بتضمين ثلاثة آبار مع وسائط BSA لتصحيح الخلفية.
  5. أضف 175 ميكرولتر من كاشف الجلسرين الحر إلى كل بئر واخلطها. تجنب توليد الفقاعات. فرقع أي فقاعات بإبرة قياس دقيقة. احتضان لوحة الفحص على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. اقرأ امتصاص اللوحة عند 540 نانومتر.

6. حساب معدل تحلل الدهون

  1. ابدأ بقيم الكثافة الضوئية (OD). بالنسبة للجلسرين ، استخدم قيم A540 OD مباشرة. احسب OD لمقايسة FFA وفقا للصيغة التالية:
    OD = (القراءة ب: أ 550 - أ 660) - (القراءة أ: أ550 - أ 660)
  2. استخدم المنحنى القياسي لحساب مستويات FFA والجلسرين في العينات التي تم جمعها. ارسم قيم OD القياسية على المحور ص ، وعلى المحور السيني ، استخدم التركيزات القياسية بالنسبة لحجم العينة (أي أن تركيز الآبار مع 20 ميكرولتر من معيار 1 mM FFA على لوحة بها عينات 10 ميكرولتر يساوي 2 mM). ملاءمة خط اتجاه خطي:
    ص = م س + ب
  3. افحص بصريا المنحنى القياسي وقم بإزالة أي نقاط خارج النطاق الخطي للفحص. احسب تركيزات العينة باستخدام المعادلة:
    تركيز العينة: س = (OD - ب) ÷ م
  4. ضبط وإعادة فحص العينات التي تقع خارج نطاق الفحص الخطي. للحصول على تركيز العينة النهائي ، اطرح تركيز آبار الخلفية التي تحتوي على وسائط BSA فقط من تركيز العينات.
  5. احسب مولات FFA والجلسرين التي تنتجها كل عينة في كل نقطة زمنية ، وفقا للصيغة:
    Equation 1
    حيث C n = التركيز في الوقت t = n ؛ Vt = الحجم الكلي في البئر ؛ Vs = حجم جمع العينات ؛ و M n = مولات منتجة في الوقت t = n (عندما تكون التركيزات في mM والأحجام في mL ، يكون الناتج μMol).
    على سبيل المثال ، في نقاط زمنية مختلفة:
    م 1 = ج1 × فولتر
    م 4 = ج4 × فولتر + (ج1 + ج2+ ج3) فولتثانية
    أو
    م 4 =ج 4 × فولتر + ج3 × فولت ثانية + ج2 × فولتثانية + ج1 × فولتثانية
  6. تطبيع وزن الأنسجة بالقسمة على وزن الأنسجة لكل عينة بالجرام للحصول على وحدات ميكرومول / جم. بالنسبة للخلايا المستزرعة ، يتم تقديم القيم على شكل ميكرومول / بئر. تأكد من أن رقم الخلية وكفاءة التمايز قابلة للمقارنة من بئر إلى بئر.
    ملاحظة: الاختلافات في كفاءة الانتشار أو التمايز ستعقد تفسير النتائج وتتطلب طريقة أخرى للتطبيع (على سبيل المثال، التطبيع مع البروتين؛ انظر المناقشة).
  7. احسب ميل الميكرومول / جم المنتج (المحور الصادي) مقابل الوقت (المحور السيني) لكل عينة على حدة.
    1. في جدول البيانات ، يمكن القيام بذلك باستخدام الدالة = SLOPE (known_ys,known_xs). في خلية جديدة ، اكتب "= SLOPE" (ثم استخدم المؤشر لتمييز قيم عينة الجلسرين أو FFA بالميكرومول / جم ، ثم لتمييز قيم الوقت المقابلة).
    2. تحقق من خطية البيانات. قيم R2 هي طريقة سريعة لتحديد خطية العينات. في جدول البيانات ، يمكن القيام بذلك باستخدام الدالة = RSQ (known_ys,known_xs) ، بنفس الطريقة الموضحة في الخطوة 6.7.1 ، ولكن الإدخال الأولي هو = RSQ. تأكد من أن قيم R2 > 0.98 ؛ تشير القيم المنخفضة إلى الانحراف عن الخطية. يمكن أن ينتج هذا عن خطأ في القياس / أخذ العينات أو فقدان الخطية.
      1. هناك طريقة أخرى لاختبار الخطية وهي إجراء انحدار خطي لكل عينة ورسم البقايا. في برنامج التحليل الإحصائي ، قم بإنشاء جدول XY بقيمة Y واحدة لكل نقطة زمنية. حدد تحليل > الانحدار الخطي البسيط وحدد المربع الخاص بالمؤامرة المتبقية قبل الضغط على موافق. ستظهر المؤامرة المتبقية كرسم بياني جديد.
  8. استخدم FFA ومعدل إنتاج الجلسرين (أي المنحدر [(μmol / g / h]) لكل عينة كنقطة بيانات فردية لإجراء التحليل الإحصائي ، ورسم القيم إذا تمت مقارنة ظروف تحلل الدهون المختلفة. إذا تمت مقارنة معدلات تحلل الدهون عبر الأنماط الجينية ، فاستخدم عينتين أو ثلاث عينات لكل كتكرارات تقنية ، واستخدم المتوسط لنقطة بيانات واحدة لكل ، بحيث يكون حجم العينة مساويا لعدد الحيوانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

قمنا بقياس معدل تحلل الدهون القاعدي والمحفز للخلايا الشحمية المتمايزة في المختبر. تم تمييز الخلايا preadipocytes الأولية من الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية إلى الخلايا الشحمية عن طريق علاج الخلايا المتقاربة مع 5 ميكرومتر ديكساميثازون ، 0.5 mM IBMX ، 1 ميكروغرام / مل الأنسولين ، و 1 ميكرومتر تروغليتازون لمدة 4 أيام ، تليها علاج إضافي لمدة 3 أيام مع 1 ميكروغرام / مل الأنسولين. تم تحضين الخلايا في وسط بدون أنسولين لمدة 24 ساعة قبل فحص تحلل الدهون. في الوقت = 0 ساعة ، تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، ثم تمت إضافة DMEM الخالي من الفينول الأحمر مع 2٪ BSA ، والذي يحتوي إما على 10 ميكرومتر CL-316,243 أو التحكم في السيارة ، إلى كل بئر من لوحة 12 بئرا. في الوقت = 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات و 4 ساعات ، تم جمع 50٪ من الوسائط واستبدالها ب 2٪ BSA في DMEM الخالي من الفينول الأحمر. تم قياس مستويات FFA والجلسرين في الوسائط المجمعة ومولات FFA ، وتم حساب الجلسرين المفرز في الوسائط في كل نقطة زمنية (الشكل 2A ، B). كان إنتاج FFA والجلسرين خطيا لمقايسة 4 ساعات ، مع قيم R2 من 0.98 وما فوق. كانت مستويات 4 ساعات FFA منخفضة قليلا ، مما يشير إلى أن معدلات تحلل الدهون ربما كانت تتباطأ. ومع ذلك ، فإن التحليل مع وبدون النقطة الزمنية 4 ساعات لم يكن له تأثير كبير على معدل تحلل الدهون المحسوب. كانت معدلات تحلل الدهون المحفزة أعلى بكثير من المعدلات القاعدية (الشكل 2C). أدى التحفيز الدهني إلى إنتاج FFA والجلسرين بنسبة مولية قريبة من 3: 1 في جميع العينات التي تم جمعها ، كما هو متوقع من تحلل الدهون الثلاثي الكامل دون إعادة امتصاص أو الاحتفاظ بشكل كبير (الشكل 2 د). ومع ذلك ، في الخلايا غير المحفزة ، كانت النسبة أقرب إلى 1 ، مما يشير إلى مصدر غير محلل للدهون من الجلسرين48،49،50.

Figure 2
الشكل 2: معدل تحلل الدهون في الخلايا الشحمية الأولية المتمايزة في المختبر . تم تمييز الخلايا الأولية في صفيحة من 12 بئرا. تمت إزالة الأنسولين من الوسائط قبل 24 ساعة من الفحص الدهني. في الوقت = 0 ساعة ، تم تحفيز الخلايا ب 10 ميكرومتر CL-316,243 (CL) أو معالجتها بوسائط تحكم السيارة (V). تم رسم نانومول (A) FFA و (B) الجلسرين المنتج في كل بئر في كل نقطة زمنية بمرور الوقت ، وتم تركيب خط انحدار خطي لكل بئر على حدة. (ج) معدل إنتاج FFA. د: معدل إنتاج الجليسرول. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. (E) النسبة المولية ل FFA: الجلسرين في الوسائط المجمعة في كل نقطة زمنية. تم إجراء التحليل الإحصائي في (C) و (D) باستخدام اختبار t للطالب. كان تأثير CL معنويا عند α = 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في زراعة الخلايا ، تكون الطبقة الأحادية للخلايا على اتصال مباشر بالوسائط ، بينما في الأنسجة المزروعة خارج الجسم الحي ، لا تكون الخلايا الموجودة في المركز على اتصال بالوسائط. وبالتالي ، في الثقافات خارج الجسم الحي ، من المرجح أن يتم الاحتفاظ ب FFAs داخل الأنسجة. تظهر القطع الأكبر من الأنسجة ، التي لها مساحة سطح أقل إلى نسبة الحجم ، معدلات أعلى من الاحتفاظ ب FFA ، مما يؤدي إلى انخفاض FFA: نسب مولار الجلسرين (الشكل 3 أ). مع انخفاض حجم قطعة الأنسجة ، تقترب النسبة المولية ل FFA: الجلسرين المنطلق من 3: 1 (الشكل 3 أ). ومع ذلك ، يمكن أن تكون قطع الأنسجة صغيرة جدا أيضا. بالإضافة إلى التحدي المتمثل في العمل مع قطع صغيرة من الأنسجة الدهنية ، تظهر قطع 1-2 ملغ من الأنسجة الدهنية معدلات منخفضة من تحلل الدهون ، مما يشير إلى انخفاض صلاحية الأنسجة ووظائفها (الشكل 3B ، C). في حين أن قطع الأنسجة الدهنية إلى قطع ذات حجم وشكل متسقين أمر شاق ويستغرق وقتا طويلا ، إلا أنه مطلوب للحصول على نتائج قابلة للمقارنة وموثوقة. نوصي بقطع من 5 إلى 10 ملغ من الأنسجة الدهنية ، ولكن الاتساق هو الأكثر أهمية. لا يزال من الممكن قياس معدلات تحلل الدهون بشكل متكرر في قطع الأنسجة الأكبر حجما ، ومع ذلك ، من المهم مراعاة تثبيط التغذية المرتدة لتحلل الدهون بواسطة FFAs63،64،65،66،67.

Figure 3
الشكل 3: تأثير حجم قطعة الأنسجة على إطلاق FFA ومعدل تحلل الدهون. تم جمع الأنسجة الدهنية البيضاء للغدد التناسلية من نظام غذائي عالي الدهون تغذت على أنثى الفأر C57Bl / 6J وتقطيعها إلى قطع متفاوتة الحجم. تحتوي جميع الآبار على 25-30 ملغ من الأنسجة الدهنية في المجموع ؛ بالنسبة للآبار التي يبلغ وزنها 25 ملغ ، كانت هذه قطعة واحدة من الأنسجة. تحتوي الآبار 10 ملغ على ثلاث قطع من الأنسجة لكل منها ~ 10 ملغ ، وتحتوي الآبار 5 ملغ على خمس أو ست قطع من الأنسجة ، وتحتوي الآبار 2 ملغ على 13-16 قطعة. في الوقت = 0 ساعة ، تم تحفيز تحلل الدهون ب 0.5 ميكرومتر CL-316,243 (CL) ، أو تمت معالجة آبار التحكم بالمركبة (V). يرسم المعدل المحسوب لتحلل الدهون من العينات التي تم جمعها بعد 1 h و 2 h و 3 h ل (A) FFAs و (B) الجلسرين. (ج) النسبة المولية ل FFA: إنتاج الجلسرين في كل بئر. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي في (A) و (B) باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع تحليل Holm-Sidak اللاحق ، α = 0.05. كان تأثير CL كبيرا في جميع العينات. ضمن العينات المعالجة ب CL ، كانت معدلات إنتاج FFA والجلسرين مختلفة بشكل كبير في جميع المقارنات الزوجية ، باستثناء عينات 10 mg مقابل 5 mg. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يمكن ملاحظة التأثير السلبي لاحتباس FFA في قطع الأنسجة 25 ملغ ، والتي تظهر معدلات أقل من إنتاج كل من FFA والجلسرين عند التحفيز (الشكل 3B ، C). ويكون تثبيط التغذية المرتدة هذا واضحا أيضا عندما تكون قدرة ربط FFA للوسائط منخفضة جدا (أي أنه لا يوجد ما يكفي من BSA في الوسائط). عندما تم تخفيض BSA في الوسائط إلى 0.5٪ ، تم تقليل إطلاق FFA بأكثر من أربعة أضعاف ، وانخفض إطلاق الجلسرين مرتين تقريبا (الشكل 4A ، B). كقاعدة عامة سهلة ، يجب ألا تقترب مستويات المولر الدقيقة من FFA في الوسائط من النسبة المئوية ل BSA في الوسائط (على سبيل المثال ، يجب أن تظل مستويات FFA أقل من 5 mM FFA في وسائط BSA 5٪ و 0.5 mM في وسائط BSA 0.5٪ [عند هذا المستوى توجد نسبة مولية 20: 3 من FFA: BSA]). لاختبار الحد الأقصى لقدرة التخزين المؤقت ل BSA لإعداد وسائط BSA ، قم بجمع الوسائط من عينة محفزة لمدة 24 ساعة ، وقياس تركيز FFA (سيكون التركيز مرتفعا ، لذلك يوصى بتقليل حجم العينة أو تخفيف العينة). كان تراكم FFA في وسائط BSA بنسبة 5٪ بعد تحفيز 24 ساعة حوالي 5 مللي مول ، بينما كان محتوى FFA لوسائط BSA بنسبة 0.5٪ 0.6 مللي متر فقط (الشكل 4C). بالنظر إلى تركيز FFA في الوسائط المجمعة ، يمكن ملاحظة أن قدرة ربط وسائط BSA FFA بنسبة 0.5٪ مثقلة بالأعباء (الشكل 4D). في حين أن مستويات FFA في وسائط BSA بنسبة 5٪ أعلى بكثير ، إلا أنها لا تتجاوز سعة التخزين المؤقت للوسائط (الشكل 4D). من الناحية المثالية ، يجب أن يظل تركيز FFA في الوسائط أقل من 3: 1 FFA: نسبة BSA المولية (أي 2.3 mM FFA في 5٪ [0.75 mM] BSA).

Figure 4
الشكل 4: تؤدي مستويات BSA غير الكافية إلى انخفاض معدلات تحلل الدهون الظاهرة. تم جمع الأنسجة الدهنية البيضاء للغدد التناسلية من نظام غذائي عالي الدهون تتغذى على أنثى الفأر C57Bl / 6J وتقطيعها إلى قطع ~ 5 ملغ. تم وضع ما مجموعه 20-30 ملغ من الأنسجة الدهنية في كل بئر. في الوقت = 0 ساعة ، تم تحفيز تحلل الدهون ب 0.5 ميكرومتر CL-316,243 (CL) ، أو تمت معالجة آبار التحكم بالمركبة (V) إما في وسائط 5٪ BSA أو وسائط تحتوي على 0.5٪ فقط من BSA. تم رسم معدل تحلل الدهون المحسوب من العينات التي تم جمعها بعد 4 ساعات ل (أ) FFAs و (ب) الجلسرين. كان تأثير CL كبيرا في جميع العينات. ضمن العينات المعالجة ب CL ، كانت معدلات إنتاج كل من FFA والجلسرين مختلفة بشكل كبير بين ظروف وسائط BSA بنسبة 5٪ و 0.5٪. (ج) مستويات FFA في الوسائط من الآبار المحفزة بعد 24 ساعة. (د) مستويات FFA في العينات التي تم جمعها عند 4 ساعات. (ه) منحنيات قياسية FFA مع وبدون تحضيرات مختلفة بنسبة 5٪ BSA في DMEM. الكثافة البصرية المحسوبة على النحو التالي (القراءة ب: أ 550 - أ 660) - (القراءة أ: أ550 - أ660). (F) منحنى الجلسرين القياسي مع وبدون BSA. الكثافة البصرية ماصة عند 540 نانومتر (A540). لم تكن قيم التطوير التنظيمي عند 5.6 مللي متر خطية وبالتالي لم تدرج في المنحنى القياسي. (ز) معدل إطلاق FFA من الأنسجة الدهنية الأنثوية للغدد التناسلية باستخدام أنواع مختلفة من BSA في وسائط الفحص. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي في (A) و (B) باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع تحليل هولم سيداك اللاحق ، * قيمة p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من المهم الإشارة إلى أن بعض مستحضرات BSA تحتوي على FFAs. يجب اختبار كل مجموعة من BSA للتأكد من أن محتوى FFA لا يكاد يذكر (لاحظ أن بعض مستحضرات BSA يتم تسويقها على أنها خالية من FFA). على الرغم من عدم تسويقها على وجه التحديد على أنها خالية من FFA ، إلا أن BSA المستخدمة هنا لا تحتوي على FFAs يمكن اكتشافها. اختبرنا وسائط الفحص التي تحتوي على BSA خالية من FFA (Equitech Bio Inc ، BAH66) ، و BSA المستخدمة في التجارب هنا (Sigma ، A9418) ، وجزء خام (أقل تكلفة) V BSA (Sigma ، 810531). لم ينتج كل من BSA و A9418 BSA الخالي من FFA أي إشارة خلفية أو يغير ميل المنحنى القياسي أو الاعتراض. كانت المنحنيات القياسية قابلة للتراكب (الشكل 4E). لم يلاحظ أي تأثير ل BSA DMEM على منحنى الجلسرين القياسي أيضا (الشكل 4F). من ناحية أخرى ، أنتج الكسر V BSA إشارة خلفية في مقايسة FFA ، والتي تعادل تركيز FFA يبلغ 0.3 mM (الشكل 4E). أدت هذه الخلفية إلى إزاحة المنحنى القياسي لأعلى ، لكنها لم تؤثر بشكل كبير على المنحدر ، مما يشير إلى أن طرح الخلفية كاف. أجرينا أيضا تجربة تحلل الدهون المحفز باستخدام هذه الأنواع الثلاثة المختلفة من BSA ، ووجدنا أنه بعد طرح الخلفية ، لم يختلف المعدل المحسوب لتحلل الدهون بين تركيبات BSA (الشكل 4F). ومع ذلك ، فإن هذا ليس هو الحال في كثير من الأحيان ، خاصة مع مستحضرات BSA الأقل نقاء والتي يمكن أن تحتوي بسهولة على الأنسولين أو المكونات الأخرى التي تؤثر على معدل تحلل الدهون. يجب اختبار كل مجموعة من BSA والتحقق من صحتها ، واستخدامها باستمرار (على سبيل المثال ، العينات التي تم فحصها مع مجموعات مختلفة من BSA غير قابلة للمقارنة). يجب إجراء منحنى قياسي كامل مع إضافة BSA و DMEM عند التحقق من صحة كل دفعة من BSA للتأكد من أنها لا تحتوي على أي شيء يتداخل مع الإنزيمات في المقايسات اللونية.

يساعد أخذ العينات التسلسلية واستبدال مستوى الصوت بوسائط جديدة على تقليل حمل FFA في الوسائط طوال التجربة. قمنا بقياس معدلات تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية للغدد التناسلية من أنثى فأر تتغذى على نظام غذائي عالي الدهون لمدة 4 أشهر. في هذه التجربة ، تم تحضين قطع الأنسجة 5-8 ملغ (الوزن الكلي 25-30 ملغ) في 200 ميكرولتر من وسائط BSA 5٪ ، وتم جمع 100 ميكرولتر واستبدالها عند 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات و 4 ساعات. في 3 ساعات ، وصلت مستويات FFA في وسائل الإعلام إلى منطقة الخطر البالغة 2.3 مللي متر (الشكل 5 أ). تم اقتراح تثبيط التغذية المرتدة لتحلل الدهون من خلال عدم وجود زيادة في مستويات FFA والجلسرين في 4 ساعات (الشكل 5 أ ، ب). بعد حساب μmol من FFA والجلسرين المنطلق في كل نقطة زمنية وتركيب منحنى خطي ، من الواضح أن معدل تحلل الدهون يبدأ في الانخفاض عند 4 ساعات في العينات المحفزة ، مع قيم R2 منخفضة تصل إلى 0.976 ل FFA و 0.983 للجلسرين (الشكل 5C ، D). بالنظر إلى المخطط المتبقي ، من الواضح أن قيم 4 h أقل من الاتجاه الخطي (أي أن البقايا سالبة) (الشكل 5E ، F). أدى استبعاد النقطة الزمنية 4 ساعات إلى زيادة قيم R2 إلى 0.997 و 0.998 وما فوق ل FFA والجلسرين ، على التوالي. يؤدي إدراج النقطة الزمنية 4 ساعات إلى انخفاض صغير ولكنه مهم في معدلات إطلاق FFA والجلسرين المحسوبة (الشكل 5G ، H).

Figure 5
الشكل 5: حساب المعدل الخطي المحلل للدهون في الأنسجة الدهنية خارج الجسم الحي . تم جمع الأنسجة الدهنية البيضاء للغدد التناسلية من نظام غذائي عالي الدهون تتغذى على أنثى الفأر C57Bl / 6J وتقطيعها إلى قطع ~ 5 ملغ. تم وضع ما مجموعه 20-30 ملغ من الأنسجة الدهنية في كل بئر. في الوقت = 0 ساعة ، تم تحفيز تحلل الدهون ب 0.5 ميكرومتر CL-316,243 (CL) ، أو تمت معالجة آبار التحكم بالمركبة (V). تم إجراء مجموعات الوسائط عند 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات و 4 ساعات. (أ) FFA و (ب) مستويات الجلسرين في الوسائط. ج: FFA و(د) إنتاج الجليسرول مخطط بمرور الوقت. الألواح المتبقية لإنتاج (E) FFA و (F) الجلسرين بمرور الوقت. معدل إطلاق (G) FFA و (H) الجلسرين ، محسوبا مع وبدون النقطة الزمنية 4 ساعات. (I) إطلاق FFA في الأنسجة الدهنية للغدد التناسلية الأنثوية. تغير ما يقرب من 50٪ من الوسائط عند 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات. بين الساعات ، جمعت النقاط الزمنية البالغة 15 دقيقة 2.75٪ من الوسائط دون استبدال. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SEM. تم إجراء التحليل الإحصائي في (G) و (H) باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع تحليل هولم سيداك اللاحق ، * قيمة p < 0.05. كان تأثير CL معنويا في جميع العينات (قيمة p < 0.05). ضمن العينات المعالجة ب CL ، كانت معدلات إنتاج كل من FFA والجلسرين مختلفة بشكل كبير بين الحسابات مع وبدون النقطة الزمنية 4 ساعات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على عكس البروتوكولات السابقة ، يستخدم هذا البروتوكول نقاطا زمنية متعددة لتحديد معدل تحلل الدهون ، وبالتالي تقليل خطأ القياس وتوفير التحقق الداخلي من أن المعدل الخطي لتحلل الدهون يتم قياسه. للحفاظ على تحلل الدهون في المرحلة الخطية في كل نقطة تجميع ، يتم جمع 50٪ من الوسائط واستبدالها. نظرا لأن الخطية أمر بالغ الأهمية ، فقد أردنا التأكد من أن إضافة وسائط جديدة لا تسبب موجة من تحلل الدهون في كل إضافة. للتحقق من صحة الخطية بين النقاط الزمنية ، أخذنا عينة صغيرة جدا (2.75٪) كل 15 دقيقة بين النقاط الزمنية لكل ساعة من 1 ساعة إلى 3 ساعات ، دون استبدال. في 1 ساعة و 2 ساعة و 3 ساعات ، تم جمع العينات العادية بنسبة 50٪ واستبدالها. كان معدل إطلاق FFA خطيا بين النقاط الزمنية المعتادة ، مما يشير إلى عدم وجود انفجار في تحلل الدهون مع كل إضافة لوسائط جديدة (الشكل 5I).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، نقدم بروتوكولا أساسيا لقياس معدل تحلل الدهون في الخلايا الشحمية والأنسجة الدهنية خارج الجسم الحي . لتحديد تحلل الدهون ، من المهم قياس معدل تحلل الدهون في المرحلة الخطية. نحن نستخدم تقنية أخذ العينات التسلسلية ، حيث يتم جمع جزء كبير من الوسائط واستبدالها بوسائط جديدة على فترات منتظمة. تسمح هذه الطريقة شبه المحافظة بإضافة BSA جديد مع قدرة التخزين المؤقت FFA وتؤخر تثبيط التغذية المرتدة ، مما يطيل مدة تحلل الدهون الخطي. يحاول هذا التصميم التجريبي تلخيص الأوعية الدموية للأنسجة الدهنية في الجسم الحي ، والتي توفر الألبومين الطازج لربط FFAs75 الذي تم إصداره. تم تحسين هذا البروتوكول لقياس تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية البيضاء خارج الجسم الحي والأنسجة الدهنية الأربية الأولية preadipocytes متمايزة في المختبر. من المحتمل أن يكون البروتوكول محسنا للعمل بشكل جيد في المستودعات الدهنية ذات اللون البني والبيج ، وكذلك الأنسجة الدهنية من الكائنات الحية الأخرى وخطوط الخلايا الخالدة ذات الإمكانات الدهنية العالية. يسمح البروتوكول بالمرونة في العمر والجنس والنظام الغذائي للفئران قبل جمع الأنسجة الدهنية للمقايسات خارج الجسم الحي . قد تؤثر بعض التلاعبات ، مثل الصيام ، على معدل تحلل الدهون الأساسي ، في حين أن التدخلات الأخرى مثل السمنة التي يسببها النظام الغذائي تؤثر أيضا على معدل تحلل الدهون المحفز.

يجب تحسين البروتوكول لكل نظام تجريبي ، اعتمادا على ما إذا كانت معدلات تحلل الدهون أعلى أو أقل. للتحقق من الخطية ، نوصي بحساب قيم R2 والنظر في مخطط البقايا. يجب أن تكون قيم R2 قريبة جدا من 1. عند تقييم المخطط المتبقي ، يجب على المرء أن يبحث عن القيم المتبقية السلبية في نقاط زمنية لاحقة ، حيث تشير هذه إلى أن معدلات تحلل الدهون آخذة في الانخفاض ، وأن الخطية تضيع. وترد أمثلة على هذه المؤامرات المتبقية في الشكل 5E، F. يوفر التخلص من النقاط الزمنية 4 ساعات في هذه الحالة حسابا أكثر دقة لمعدل تحلل الدهون الخطي ويحسن قيم R2 . ومع ذلك ، نظرا لأن المعدل يتم حسابه من نقاط زمنية متعددة ، فهو قوي نسبيا ، وإدراج مثل هذه النقطة الزمنية له تأثير ضئيل فقط على قيم R2 والمعدل المحسوب لتحلل الدهون. إذا تم استخدام نقطة زمنية واحدة لحساب معدل تحلل الدهون ، يمكن تحريف البيانات بسهولة أكبر.

يمكن أن تؤثر الطريقة التي يتم بها تطبيع البيانات أيضا على النتائج النسبية بين العينات. هنا ، نوصي بتطبيع الأنسجة خارج الجسم الحي لوزن الأنسجة والخلايا الأولية الأولية المتمايزة في المختبر لكل بئر. ومع ذلك ، قد لا تكون تقنيات التطبيع هذه مناسبة لجميع الأنظمة التجريبية. والأهم من ذلك، إذا كان معدل الانتشار أو كفاءة التمايز يختلف بين المجموعات، فإن التطبيع لكل بئر ليس مناسبا. تشمل تقنيات التطبيع البديلة البروتين والدهون والحمض النووي. كل طريقة تطبيع لها مزاياها وعيوبها. وزن الأنسجة وتطبيع جيد بسيط ومباشر. يمكن أن تعني الاختلافات في حجم الخلايا الشحمية أن الأنسجة الدهنية الخالية من الدهون تحتوي على العديد من الخلايا الشحمية لكل جرام أكثر من الأنسجة الدهنية البدينة ، في حين أن الاختلافات في كفاءة التمايز يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في عدد الخلايا الشحمية لكل بئر. يمكن استخلاص الدهون بالمذيبات العضوية (على سبيل المثال ، 2: 1 الكلوروفورم: الميثانول [v / v]) ومحتوى الدهون الثلاثية المقاس باستخدام كاشف قياس اللون. في حين أن تطبيع محتوى الدهون ليس طريقة مستخدمة تقليديا ، فإن قطرات الدهون هي ، بعد كل شيء ، العضية التي تخضع لتحلل الدهون ، وطريقة التطبيع هذه خاصة بالخلايا الشحمية ، والتي يمكن أن تكون مفيدة عندما تختلف معدلات التمايز بين الخلايا. بعد استخراج الدهون ، يمكن استخدام 0.1-0.3 N NaOH لاستخراج البروتين ، والذي يمكن بعد ذلك فحصه بواسطة برادفورد أو مقايسة بروتين BCA68. بدلا من ذلك ، يمكن تجانس العينات في محلول التحلل ، وإزالة جزء الدهون عن طريق الطرد المركزي70. لاحظ أن تلوث الدهون سوف يتداخل مع فحوصات البروتين. إذا كان سيتم استخدام البروتين للتطبيع ، فيجب غسل الخلايا على نطاق واسع (ثلاث مرات على الأقل) لإزالة BSA من وسائط الفحص. في بعض الأحيان ، لا تلتصق الخلايا الشحمية المتمايزة جيدا باللوحة ولا تتسامح مع الغسلات الثلاثة المطلوبة لإزالة BSA الزائد. يسمح التطبيع مع الحمض النووي بالتطبيع إلى رقم الخلية ، ويمكن إجراؤه باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية ، متبوعا بالقياس الكمي للحمض النووي الكلي عن طريق الامتصاص أو تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي لرقم نسخة الجينات. بدلا من ذلك ، في الخلايا المطلية ، يمكن استخدام تلطيخ DAPI متبوعا بالتصوير لحساب النوى وتطبيع رقم الخلية. عند التطبيع باستخدام رقم الخلية أو البروتين ، من المهم مراعاة الخلايا غير الشحمية في العينة. تحتوي الأنسجة الدهنية أيضا على خلايا مناعية وبطانية. في الأنسجة الدهنية البدينة ، يمكن أن يؤدي الالتهاب والتضخم إلى ما لا يقل عن 1 من كل 10 نوى قادمة من الخلايا الشحمية الناضجة. ومع ذلك ، لا تزال الخلايا الشحمية تساهم في غالبية محتوى الكتلة والدهون في الأنسجة. بالنسبة للخلايا preadipocytes المتمايزة في المختبر ، تؤثر كفاءة التمايز على النسبة المئوية النسبية للخلايا الشحمية الناضجة. عندما يكون هذا هو الحال ، يكون التطبيع معقدا. من الناحية المثالية ، يجب تحسين كفاءة التمايز قبل استخدام الخلايا لفحص تحلل الدهون. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، يوصى بتطبيع محتوى الدهون إذا كان حجم قطرات الدهون مشابها بين الخلايا الشحمية المتباينة. يمكن أن تؤدي مقارنة معدلات تحلل الدهون عبر ثقافات الخلايا الشحمية مع التمايز غير المتكافئ إلى استنتاجات خاطئة حول تحلل الدهون عندما يكون العامل الدافع هو في الواقع تكوين الدهون. هذا هو أحد قيود البروتوكول.

سلسلة طويلة FFAs ردود الفعل تمنع تحلل الدهون63،64،65،66،67. تتراكم FFAs عندما لا يتم عزلها بشكل كاف في وسائل الإعلام. يرتبط الكثير من استكشاف الأخطاء وإصلاحها المرتبط بتحسين قياس تحلل الدهون بتقليل الاحتفاظ ب FFA. يساعد حساب النسبة المولية ل FFA: إطلاق الجلسرين في الوسائط على تحديد المشكلات المتعلقة بالاحتفاظ ب FFA. إذا كانت النسبة المولية 3: 1 ل FFA: الجلسرين ، إطلاق جميع منتجات تحلل الدهون والتقاطها في الوسائط ، في حين أن النسبة الأقل من 2: 1 هي سبب للقلق. أحد الاعتبارات المهمة للمقايسات خارج الجسم الحي هو حجم قطعة الأنسجة الدهنية. القطع الأكبر من الأنسجة لها مساحة سطح أقل إلى نسبة الحجم ، وبالتالي من المرجح أن تحتفظ ب FFAs وتظهر معدلات تحلل الدهون منخفضة نتيجة لذلك (الشكل 4 أ ، ب). مع وضع ذلك في الاعتبار ، من الأهمية بمكان قطع الأنسجة الدهنية لكل عينة إلى قطع ذات حجم وشكل ثابتين. لتسهيل عزل FFA في وسائل الإعلام ، من المهم أيضا التأكد من أن الوسائط تحتوي على BSA كافية لربط FFA المفرج عنه. يمكن زيادة قدرة التخزين المؤقت FFA للوسائط عن طريق زيادة تركيز BSA أو زيادة حجم الوسائط. من الفعال بنفس القدر زيادة حجم أو تكرار الجمع. إذا لاحظ المرء معدلات عالية من تحلل الدهون ، ولكن FFA: نسب الجلسرين أقل من 2: 1 ، نوصي بزيادة تكرار التجميع إلى كل 30 دقيقة وإيقاف الفحص عند 2.5 ساعة.

تم تحسين البروتوكول المقدم هنا للأنسجة الدهنية البيضاء خارج الجسم الحي للفأر والخلايا الأولية الأولية المتمايزة في المختبر ، وكلاهما شديد التحلل للدهون. يجب تحسين الفحص لقياس تحلل الدهون في الأنظمة الأخرى ، أو إذا كانت الاختلافات في المعدل القاعدي المنخفض نسبيا لتحلل الدهون ذات أهمية خاصة. على سبيل المثال ، الخلايا الشحمية 3T3-L1 لها نشاط أقل في إذابة الدهون32. عندما يكون معدل تحلل الدهون منخفضا ، يجب تقليل حجم الحضانة (أي بدلا من 400 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة 24 بئرا ، يجب استخدام 200 ميكرولتر في صفيحة 24 بئرا ، أو 300 ميكرولتر في صفيحة 12 بئرا ، و 100-150 ميكرولتر يتم جمعها لكل نقطة زمنية. يجب ألا ينخفض حجم التجميع عن 100 ميكرولتر ، حيث يلزم وجود أحجام عينات أكبر لقياس مستويات FFA والجلسرين المنخفضة بدقة. لفحص الجلسرين باستخدام 50 ميكرولتر من الوسائط لكل عينة ، يجب إذابة كاشف الجلسرين الحر في 31 مل من الماء ، و 150 ميكرولتر من الكاشف المستخدم مع 50 ميكرولتر من العينة في كل بئر. يمكن قياس مستويات FFA ب 25 ميكرولتر من العينة لكل بئر ، وربما أكثر ، طالما يتم الحفاظ على الخطية. يمكن أيضا تمديد النقاط الزمنية لزيادة الإشارة. عند فحص معدلات تحلل الدهون من خلايا أخرى غير الخلايا الشحمية البيضاء ، ينبغي النظر في الاختلافات في التمثيل الغذائي الخلوي. على سبيل المثال ، تعبر الخلايا الشحمية البنية والبيج عن مستويات أعلى بكثير من كيناز الجلسرين ، وبالتالي فهي قادرة على الاحتفاظ بإطلاق الجلسرين عن طريق تحلل الدهون76,77. قد تكون هذه الخلايا النشطة الأيضية قادرة أيضا على توجيه الأحماض الدهنية المنبعثة إلى مسارات هدمية أو اصطناعية دون إطلاقها في الوسائط. يجب مراعاة المصير الأيضي ل FFA والجلسرين في نوع الخلية المحدد الذي يتم فحصه عند تفسير نتائج مقايسة تحلل الدهون ، خاصة في نوع الخلية بخلاف الخلايا الشحمية البيضاء. يجب تحسين فحوصات تحلل الدهون في أنواع الخلايا الأخرى والتحقق من صحتها.

تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم الاختلافات في معدل تحلل الدهون في نماذج الماوس. تعد الخلايا الأولية الأولية المتمايزة في المختبر أداة مفيدة للتحقيق في التأثيرات المستقلة للخلايا للتلاعب الجيني أو العلاجات الدوائية في الخلايا الشحمية. من ناحية أخرى ، تحتوي الأنسجة الدهنية على أنواع أخرى من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا المناعية. من المهم مراعاة تأثير الخلايا المناعية للأنسجة الدهنية في تنظيم تحلل الدهون عند تقييم تحلل الدهون الكامل للأنسجة. قد تتحايل نماذج تحلل الدهون للخلايا الشحمية المستزرعة على التأثير المعقد المحتمل للخلايا المناعية وتمكن من إجراء فحص شامل لأنواع معينة من الخلايا ، بينما تتيح زراعة الأنسجة الدهنية مقارنة أكثر قوة بالبيئة في الجسم الحي . بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفحص خارج الجسم الحي للتحقيق في معدلات تحلل الدهون في مختلف المستودعات الدهنية. في هذه الأنظمة ، يتم تحفيز تحلل الدهون بواسطة مركبات مثل ناهضات مستقبلات β الأدرينالية ، وبالتالي ، لن يتم ملاحظة أي تغييرات في النغمة المتعاطفة التي قد تؤثر على نموذج الفأر في الجسم الحي . قياس تحلل الدهون في الجسم الحي معقد بسبب ديناميات FFA وإطلاق الجلسرين وامتصاصه في الأنسجة المختلفة في جميع أنحاء الجسم. مستويات FFA في المصل والجلسرين في أي نقطة زمنية معينة هي توازن الإفراز والامتصاص ، ولا ينبغي افتراض أن التغيرات في مستويات FFA والجلسرين في المصل تعزى فقط إلى تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية. يتأثر تحلل الدهون الناجم عن الصيام بالنغمة الودية ، ولكنه لا ينتج عنه تغييرات سريعة وقوية في مستويات FFA أو الجلسرين في المصل ، مما يجعل من الصعب تفسير التغيرات في مستويات مصل الصيام من FFA والجلسرين. يمكن تحفيز تحلل الدهون في الجسم الحي باستخدام ناهض مستقبلات الأدرينالية β-3 ، مثل CL-316,243 ، ويمكن اكتشاف زيادة مصل FFA والجلسرين في غضون 20 دقيقة من التحفيز. يجب أن تشمل المقايسات المحللة للدهون في الجسم الحي كلا من قياسات خط الأساس لمصل FFA والجلسرين ، بالإضافة إلى التحكم في السيارة ؛ بهذه الطريقة ، يمكن تحديد التغيير الخاص بالتحفيز في مستويات FFA والجلسرين في المصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة منحة R01DK126944 إلى SMR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 193 ،
قياس معدل تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية <em>خارج الجسم</em> الحي والخلايا preadipocytes الأولية متمايزة <em>في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter