Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling av graden av lipolyse i ex vivo murint fettvev og primære preadipocytter differensiert in vitro

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65106
Automatic Translation
1, 1
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

Summary

Triglyseridlipolyse i adipocytter er en viktig metabolsk prosess som resulterer i frigjøring av frie fettsyrer og glyserol. Her gir vi en detaljert protokoll for å måle basal og stimulert lipolyse i adipocytter og ex vivo fettvev fra mus.

Abstract

Adipocytter lagrer energi i form av triglyserider i lipiddråper. Denne energien kan mobiliseres via lipolyse, hvor fettsyresidekjedene spaltes sekvensielt fra glyserolryggraden, noe som resulterer i frigjøring av frie fettsyrer og glyserol. På grunn av det lave uttrykket av glyserolkinase i hvite adipocytter er glyserolopptakshastigheten ubetydelig, mens fettsyreopptak dikteres av fettsyrebindingskapasiteten til mediekomponenter som albumin. Både glyserol- og fettsyrefrigjøring i media kan kvantifiseres ved kolorimetriske analyser for å bestemme lipolytisk hastighet. Ved å måle disse faktorene på flere tidspunkter, kan man bestemme den lineære hastigheten av lipolyse med høy tillit. Her gir vi en detaljert protokoll for måling av lipolyse i in vitro differensierte adipocytter og ex vivo fettvev fra mus. Denne protokollen kan også optimaliseres for andre preadipocyttcellelinjer eller fettvev fra andre organismer; Viktige faktorer og optimaliseringsparametere diskuteres. Denne protokollen er designet for å være nyttig for å bestemme og sammenligne graden av adipocytlipolyse mellom musemodeller og behandlinger.

Introduction

Overflødig næringsstoffer lagres i hvitt fettvev i form av triglyserider i den nøytrale lipidkjernen av lipiddråper. Triglyseridbutikker mobiliseres via lipolyse, en prosess der fettsyresidekjedene spaltes sekvensielt av fettvevstriglyseridlipase (ATGL), hormonsensitiv lipase (HSL) og monoglyseridlipase (MGL), noe som resulterer i frigjøring av frie fettsyrer (FFA) og glyserolryggraden 1,2. Lipolyse aktiveres ved katekolaminsignalering i fettvevet. Sympatiske nerveterminaler frigjør lokalt katekolaminer, som binder seg til β-adrenerge reseptorer på adipocyttplasmamembranen. Ved ligandbinding aktiverer disse G-proteinkoblede reseptorene (GPCR) adenylylsyklase via Gαs. Påfølgende aktivering av proteinkinase A (PKA) ved cAMP resulterer i oppregulering av både ATGL og HSL. Fosforyleringen av perilipin-1 av PKA forårsaker dissosiasjon av ABHD5 (også kjent som CGI-58), som binder og koaktiverer ATGL3. PKA fosforylerer HSL direkte, fremmer translokasjonen fra cytosol til lipiddråpen, hvor interaksjon med fosforylert perilipin-1 ytterligere fremmer lipaseaktiviteten 4,5,6,7. Den tredje lipasen involvert i lipolyse, MGL, ser ikke ut til å være regulert av katekolaminsignalering8. Det er viktig at triglyseridsyntese i adipocytter medieres av glyserollipidsynteseveien, som ikke involverer dannelsen av monoglyserider som et mellomprodukt; I stedet katalyserer glyserol-3-fosfatacyltransferaser dannelsen av lysofosfatidsyre, som kombineres med en annen fettacyl-CoA for å danne fosfatidsyre, og deretter isomeriseres til diglyserider før den endelige syntesen av triglyserider (figur 1) 9,10,11.

Figure 1
Figur 1: Lipolyse og glyserollipidsynteseveier. Øverst: Lipolytisk vei; enzymer vist i rødt: fettvevstriglyseridlipase (ATGL), hormonsensitiv lipase (HSL) og monoglyseridlipase (MGL). Bunn: glyserollipidsyntesevei; enzymer vist i grønt: diglyseridacyltransferase (DGAT), fosfatidsyrefosfatase (PAP), lysofosfatidsyreacyltransferase (LPAT, også kjent som LPAATs) og glyserol-3-fosfatacyltransferase (GPAT). Lipider: triglyserid (TG), diglyserid (DG), monoglyserid (MG), fri fettsyre (FFA), fettacyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidsyre (LPA) og fosfatidsyre (PA). Andre metabolitter: uorganisk fosfat (Pi) og glyserol 3-fosfat (G3P). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ekstracellulær adenosin er en annen viktig regulator av lipolyse, som arbeider gjennom Gs- og G i-koblede GPCRs for å påvirke adenylsyklaseaktivitet. Den dominerende adenosinreseptoren i adipocytter, ADORA1, hemmer adenylylsyklase, og dermed lipolyse gjennom aktivering av Gi12. Uttrykt i lavere nivåer, og primært i brune adipocytter, aktiverer ADORA2A lipolyse via Gs signalering13. ADORA1 påvirker både basal lipolyse og responsen på adrenerge agonister. Effekten av adenosin på lipolyse kan kontrolleres ved å tilsette adenosindeaminase for å nøytralisere adenosin, samt ADORA1-spesifikk agonist fenylisopropyladenosin14,15. Hormonell aktivering av G q-koblede GPCR kan også påvirke lipolyse via aktivering av fosfolipase C og proteinkinase C16,17,18,19. Inflammatoriske signaler påvirker også lipolytiske hastigheter. TLR4-aktivering av LPS (og andre endotoksiner) øker lipolytisk hastighet ved å aktivere ERK, som fosforylerer perilipin-1 og HSL20. TNF-α aktiverer også lipolyse via ERK- og NF-κB-aktivering, samt transkripsjonell nedregulering av fosfodiesterase PDE-3B og CIDEC21,22,23. IL-6 har også vært assosiert med økt adipocytlipolyse, spesielt i mesenterisk fettvev, hvis FFA-frigjøring påvirker leverstatose og glukoneogenese24,25,26.

Lipolyse undertrykkes i matet tilstand av insulin. AKT fosforylerer og aktiverer PDE-3B for å undertrykke cAMP-signalering og forhindre PKA-aktivering27. Insulin nedregulerer også ATGL28 transkripsjonelt. Fedme fremmer katekolaminresistens gjennom en rekke mekanismer, inkludert nedregulering av β-adrenerge reseptorer i adipocytter 29,30,31,32,33. Adipocytter uttrykker alle tre β-adrenerge reseptorer (β-1, β-2 og β-3). Mens β-1 og β-2 adrenerge reseptorer er allestedsnærværende uttrykt, er β-3 adrenerg reseptor hovedsakelig uttrykt i adipocytter hos mus34,35. Adrb3-ekspresjon induseres av C/EBPα under adipogenese36. Den β-3 adrenerge reseptoren uttrykkes sterkt i modne adipocytter. Aktiveringen av β-1 og β-2 adrenerge reseptorer er selvbegrensende på grunn av tilbakemeldingshemming ved β-arrestin37. Tilbakemeldingshemming av β-3 adrenerg reseptor medieres av andre signalveier, noe som reduserer Adrb3-ekspresjon33,38,39.

Tallrike forbindelser kan brukes til å aktivere adipocytlipolyse. Katekolaminer er store fysiologiske aktivatorer av lipolyse. Noradrenalin (eller noradrenalin) og adrenalin (eller adrenalin) aktiverer alle tre β-adrenerge reseptorer40. Noradrenalin og adrenalin påvirker også lipolyse via aktivering av α-adrenerg reseptorsignalering41. Vanlige β-adrenerge reseptoragonister inkluderer isoproterenol, som er en ikke-selektiv β-adrenerg reseptoragonist, og β-3-adrenerge reseptoragonister CL-316,243 og mirabegron42. Gitt at adipocytter hovedsakelig uttrykker β-3 adrenerg reseptor, bruker vi CL-316,243 som et eksempel her. Dens spesifisitet for β-3 adrenerg reseptor gjør den også til en relativt spesifikk aktivator av adipocytkatekolaminsignalering, som også trygt kan brukes in vivo. Merk at den vanlige konsentrasjonen på 10 μM CL-316,243 i cellekultur er størrelsesordener høyere enn ~0,1 μM-dosen som kreves for å oppnå maksimal respons33. Forskolin omgår adrenerge reseptoren, direkte aktivere adenylylsyklase og nedstrøms lipolytisk signalering. Det er mange flere aktivatorer, så vel som undertrykkere av lipolyse. Ved valg av en forbindelse for å stimulere lipolyse, bør reseptorspesifisiteten og nedstrøms signalveier vurderes nøye innenfor eksperimentell design.

Graden av lipolyse i hvitt fettvev er en viktig metabolsk faktor som påvirker kuldetoleranse og næringstilgjengelighet under faste eller trening43,44,45,46. Formålet med denne protokollen er å måle graden av lipolyse i adipocytter og fettvev, noe som vil lette forståelsen av adipocyttmetabolisme og hvordan det kan påvirke den metabolske fenotypen til forskjellige murinmodeller. For å kvantifisere lipolytisk hastighet måler vi utseendet til lipolytiske produkter i media (dvs. FFA og glyserol). Metoden er avhengig av frigjøring av lipolytiske produkter fra adipocytter inn i mediet. Siden hvite adipocytter uttrykker lave nivåer av glyserolkinase, er glyserolopptakshastighetene lave47. Omvendt bør produksjon av FFA og glyserol ved andre metabolske veier enn lipolyse også vurderes. Adipocytter ser ut til å uttrykke en fosfatase med aktivitet mot glyserol-3-fosfat, noe som muliggjør produksjon av glyserol fra glyserol-3-fosfat avledet fra glukose48,49,50. Glykolyse er en kilde til glyserol-3-fosfat som brukes til FFA-reesterifisering i hvite adipocytter. Når glukosenivået er begrenset, krever glyseronogenese andre 3-karbonkilder, som laktat og pyruvat51. Kanaliseringen av FFAer frigjort av lipolyse i cellen og deres metabolske skjebne er dårlig forstått; FFA frigjort av lipolyse må omdannes til fettacyl-CoA, før de blir re-esterified eller gjennomgår β-oksidasjon. Det ser ut til at FFAer utgitt av lipolyse sannsynligvis forlater cellen før de tas opp igjen og omdannes til fettacyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA kan sekvestreres utenfor cellen av albumin. Det er viktig at langkjedede FFAer er kjent for å feedback-hemme lipolyse hvis de ikke er sekvestrert av albumin 63,64,65,66,67. Dermed er optimalisering av FFA-bufferkapasiteten til media under lipolyseanalysen kritisk. Prosedyren beskrevet her ligner tidligere publiserte metoder for å måle lipolytisk hastighet i adipocytter og ex vivo fettvev fra mus og mennesker 15,68,69,70,71. Denne protokollen skiller seg ut ved bruk av seriell prøvetaking; Ved å utføre seriell prøvetaking kan vi internt validere at lipolyse måles i den lineære fasen og bruke flere målinger for å beregne lipolysehastigheten, og dermed redusere målefeil for å øke tilliten til den endelige beregnede verdien. Ulempen med seriell prøvetaking er at analysen krever mer tid og reagenser; Den lengre tidsrammen reduserer imidlertid virkningen av målefeil på standardfeilen i estimatene for satsen. I tillegg måler denne protokollen både FFA- og glyserolfrigivelse, og vurderer forholdet mellom FFA: glyserolfrigivelse med målet om å oppnå et 3: 1-forhold, som forventes fra fullstendig lipolyse og frigjøring av lipolytiske produkter i media72.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruken av alle dyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Weill Cornell Medical College of Cornell University.

1. Klargjøring av buffere og oppsamlingsplater

  1. Lag 5% bovint serumalbumin (BSA) ved å oppløse 5 g BSA i 100 ml av Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) uten fenolrødt. Rør BSA forsiktig for å løse opp (risting virker mot sin hensikt). Når BSA er fullstendig oppløst, filtrersteriliser mediet med et 0,2 μm filter. Oppbevar BSA-mediet ved 4 °C i opptil 1 måned.
  2. Lag arbeidskonsentrasjoner av kontroll- og stimuleringsmedier. Kontrollmedier: 5 % BSA-medier med kjøretøykontroll. Stimuleringsmedier: 5 % BSA-medier med 0,5 μM CL-316 243. Lag nye stimuleringsmedier for hvert eksperiment.
  3. Varm mediet som skal brukes til 37 °C. Merk en 96-brønns plate for medieinnsamling.

2. Forberedelse av prøve

  1. Utfør cellekultur som beskrevet nedenfor. Utfør alt cellearbeid i en steril avtrekkshette for å minimere forurensning utenfra.
    1. Isolere og differensiere primære preadipocytter, som i73,74.
      1. Plate primære preadipocytter ved høy tetthet, slik som 1 x 105 celler / brønn i en 24-brønns plate i 1 ml / brønnkulturmedier (15% føtalt bovint serum (FBS) og 1x penicillin-streptomycin-glutamin i DMEM / F12).
      2. Etter at cellene når 100% konfluens, skiller du med 5 μM deksametason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-metylxantin, 1 μg / ml insulin og 1 μM tiazolidindion (TZD) i kulturmedier i 3 dager. Bytt deretter til dyrkningsmedier med 1 μg / ml insulin i minst 3 dager for å vokse lipiddråper. Bruk 1 ml / brønn av media i 24-brønnplaten.
      3. Bytt dyrkningsmedium (1 ml/brønn) med insulin hver 2. eller 3. dag. Cellene kan opprettholdes i medier med insulin i opptil 2 uker. Bruk bare kulturer der differensieringsratene er over 90 % og er like på tvers av grupper for denne analysen, da redusert differensiering kan feiltolkes som en reduksjon i lipolytisk rate.
      4. Dyrk cellene i insulinfrie medier i 24 timer før måling av lipolyse.
        MERK: Insulin i media opprettholder lipiddråper, men hemmer også lipolyse. Inkubasjon uten insulin i 24 timer muliggjør full lipolytisk aktivering uten tap av lipiddråpevolum. I noen systemer kan det være nødvendig å forkorte eller forlenge dyrkningstiden uten insulin.
    2. Vask cellene med DPBS en gang for å fjerne gjenværende serum fra kulturmediet.
      MERK: Denne protokollen inkluderer ikke serumsult, som kan aktivere lipolyse. Serumsult kan benyttes etter forskerens skjønn.
  2. Utfør ex vivo-kultur som beskrevet nedenfor.
    1. Forbered en 6-brønns plate, med en brønn for hvert vev som skal samles fra hver mus. Plasser 4 ml romtemperatur DMEM i hver brønn som skal brukes.
      MERK: BSA i innsamlingsmediet er ikke nødvendig.
    2. Forbered en 48-brønnsplate for lipolyseanalysen, med en brønn for hver replikasjon. Plasser 400 μL romtemperatur DMEM i hver brønn som skal brukes. Bruk to til fire kontrollbrønner og to til fire stimulerte brønner per vev per mus.
    3. Avlive musen ved cervikal dislokasjon under anestesi, med en sekundær metode som bilateral pneumothorax. Her brukte vi en 32 g, 7 måneder gammel kvinnelig C57BL/6J mus, matet med et 45% fettrikt kosthold i 4 måneder.
      MERK: Denne protokollen kan også brukes for menn, så vel som andre stammer, dietter og aldre.
    4. Spray med 70% etanol og bruk saks til å lage et lite (~ 1 cm) lateralt snitt i midten av bukhuden, trekk huden fra hverandre ved å klemme hver side med tommel og pekefinger og brett den nedre bukhuden over for å avsløre de bakre subkutane depotene. Finn og fjern inguinal lymfeknute og stump dissekere det inguinal fettvevet umiddelbart bakre til inguinal lymfeknuten ved hjelp av tang.
    5. For å samle gonadal fettvev, gjør et lateralt og et vertikalt snitt i bukhinnen for å få tilgang til bukhulen. Hold gonadal fett pad med pinsett og kutt langs livmoren (eller epididymis for menn) for å fjerne gonadal fettvev. Plasser de oppsamlede depotene i en 6-brønnsplate.
    6. Fjern vevet fra brønnen, legg på en silikonmatte og kutt i 5 til 7 mg biter med saks.
    7. Vei ut 25 til 30 mg (fem eller seks biter) for hver analysebrønn og legg inn i en 48-brønns analyseplate. Blett papirlommetørkleet på et rent håndkle før veiing for å fjerne eventuelle medier. Vei vektbåten etter fjerning av vevet og registrer vekten av eventuelle rester som er igjen. Tørk vektbåten ren mellom prøvene og re-tare om nødvendig. Bruk en ny vektbåt for hvert vev.
    8. Når alle vevsprøvene er veid, plasser 48-brønns analyseplaten i en 37 ° C, 10% CO2 -inkubator i 15 minutter.

3. Lipolyse analyse

  1. Utfør medieinnsamling. Foreta overføring av mediet og påfølgende prøvetaking i en steril avtrekkshette for å minimere potensiell forurensning fra eksterne kilder.
    1. Ved t = 0, fjern mediet og tilsett 400 μL per brønn med kontroll- eller stimuleringsmedier, og sett analyseplaten i en 37 ° C, 10% CO2 -inkubator. For ex vivo vevskultur, fjern forsiktig media ved hjelp av en pipette; Suging skal aldri brukes.
      MERK: Alternativt kan du forberede en annen plate med kontroll- og stimuleringsmedier, og overføre vevet.
    2. Ved t = 1, 2, 3 og 4 timer, samle 200 μL media, erstatt med 200 μL av passende kontroll- eller stimuleringsmedium, og returner analyseplaten til inkubatoren. Oppbevar oppsamlingsplaten ved 4 °C. For å bestemme FFA-bufferkapasiteten til BSA-mediet, bruk en ekstra samling ved 24 timer.
      MERK: Forsøkene kan stoppes her, og de innsamlede mediene kan lagres ved -20 °C.

4. FFA kolorimetrisk analyse

  1. Varm reagensene til romtemperatur og løs opp en flaske fargereagens A med en flaske oppløsningsmiddel A og en flaske fargereagens B med en flaske oppløsningsmiddel B. Fra rekonstitueringsdatoen brukes disse reagensene best innen 1 uke. Kastes 1 måned etter rekonstituering.
  2. Tine og bland prøvene.
  3. Lag en FFA-standardkurve. Standardløsningen er 1 mM. Bruk følgende volum med reagensene for standardkurven: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 fortynning), 10 μL (1:4 fortynning), 10 μL (1:8 fortynning) og 10 μL vann for maksimalt område. For lave FFA-nivåer kan 10 μL på 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM og 0,05 mM standard være mer anvendelige.
  4. Pipettestandarder og prøver i en 96-brønns analyseplate. Anbefalt prøvevolum er 10 μL. Inkluder tre brønner med samme volum BSA-medier som prøvene for bakgrunnskorreksjon.
    MERK: Hvis prøvekonsentrasjonene faller utenfor området til standardkurven, gjenta analysen og juster prøvevolumet til 2-25 μL.
  5. Tilsett 150 μL reagens A til hver brønn og bland. Unngå å generere bobler. Pop eventuelle bobler med en tynn gauge nål. Inkuber analyseplaten ved 37 °C i 5 minutter.
  6. Les av absorbansen av platen ved 550 nm og 660 nm referanse (Lesing A).
  7. Tilsett 75 μL reagens B til hver brønn og bland. Unngå å generere bobler. Pop eventuelle bobler med en tynn gauge nål. Inkuber analyseplaten ved 37 °C i 5 minutter.
  8. Les av platens absorbans igjen ved 550 nm og 660 nm referanse (lesing B).

5. Glyserolkolorimetrisk analyse

  1. Rekonstituer fritt glyserolreagens med 36 ml ultrarent vann og akklimatiser til romtemperatur. Disse reagensene brukes best innen få uker. Kastes 2 måneder etter rekonstituering.
  2. Tine og bland prøvene.
  3. Lag en glyserolstandardkurve ved å lage en syv punkt, 2 ganger seriell fortynning av glyserolstandardløsningen og et vannemne.
    MERK: Standardkurven er relativt lineær opp til 25 μL på 2,8 mM glyserol, men ikke lineær ved høyere konsentrasjoner.
  4. Pipette 25 μL hver av standard og prøver inn i 96-brønns analyseplaten. Inkluder tre brønner med BSA-mediet for bakgrunnskorreksjon.
  5. Tilsett 175 μL fritt glyserolreagens til hver brønn og bland. Unngå å generere bobler. Pop eventuelle bobler med en tynn gauge nål. Inkuber analyseplaten ved 37 °C i 5 minutter.
  6. Les av absorbansen av platen ved 540 nm.

6. Beregning av lipolytisk hastighet

  1. Start med verdier for optisk tetthet (OD). For glyserol, bruk A540 OD-verdier direkte. Beregn OD for FFA-analysen i henhold til følgende formel:
    OD = (Lesing B: A 550 - A 660) - (Lesing A: A550 - A660)
  2. Bruk standardkurven til å beregne FFA- og glyserolnivåene i de innsamlede prøvene. Plott standard OD-verdier på y-aksen, og på x-aksen, bruk standardkonsentrasjoner i forhold til prøvevolumet (dvs. konsentrasjonen av brønnene med 20 μL av 1 mM FFA-standard på en plate med 10 μL prøver er lik 2 mM). Monter en lineær trendlinje:
    y = mx + b
  3. Inspiser standardkurven visuelt og fjern eventuelle punkter utenfor det lineære analyseområdet. Beregn prøvekonsentrasjoner ved hjelp av ligningen:
    Prøvekonsentrasjon: x = (OD - b) ÷ m
  4. Juster og analyser prøver på nytt som faller utenfor det lineære analyseområdet. For å få den endelige prøvekonsentrasjonen, trekk konsentrasjonen av bakgrunnsbrønnene som bare inneholder BSA-medier fra konsentrasjonen av prøvene.
  5. Beregn molene FFA og glyserol produsert av hver prøve på hvert tidspunkt, i henhold til formelen:
    Equation 1
    hvor Cn = konsentrasjon på tidspunkt t = n; Vt = totalt volum i brønnen; Vs = prøveinnsamlingsvolum; og M n = mol produsert på tidspunktet t = n (når konsentrasjoner er i mM og volumene er i ml, er utgangen μMol).
    For eksempler, på ulike tidspunkter:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2 + C3)V s
    eller
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normaliser til vevsvekt ved å dele med vevsvekten for hver prøve i gram for å oppnå enheter μmol / g. For dyrkede celler presenteres verdier som μmol/brønn. Sikre at celleantall og differensieringseffektivitet er sammenlignbare fra brønn til brønn.
    MERK: Forskjeller i spredning eller differensieringseffektivitet vil komplisere tolkningen av resultatene og kreve en annen metode for normalisering (f.eks. normalisering til protein; se diskusjon).
  7. Beregn helningen til μmol / g produsert (y-aksen) versus tid (x-aksen) for hver prøve individuelt.
    1. I et regneark kan dette gjøres ved hjelp av =SLOPE(known_ys;known_xs)-funksjonen. I en ny celle skriver du inn "= SLOPE" (bruk deretter markøren til å markere prøveglyserol- eller FFA-verdiene i μmol / g, og deretter markere de tilsvarende tidsverdiene).
    2. Kontroller lineariteten til dataene. R2-verdier er en rask måte å bestemme lineariteten til prøvene på. I et regneark kan dette gjøres ved hjelp av =RSQ(known_ys,known_xs)-funksjonen, på samme måte som beskrevet i trinn 6.7.1, men den første inngangen er =RSQ. Forsikre deg om at R2-verdiene er > 0,98; Lavere verdier indikerer avvik fra linearitet. Dette kan skyldes en måle-/utvalgsfeil eller tap av linearitet.
      1. En annen måte å teste linearitet på er å utføre en lineær regresjon for hver prøve og plotte restene. I en statistisk analyseprogramvare genererer du en XY-tabell med en enkelt Y-verdi for hvert tidspunkt. Velg Analyser > enkel lineær regresjon , og merk av for Residual Plot før du trykker OK. Restplottet vises som en ny graf.
  8. Bruk FFA- og glyserolproduksjonshastigheten (dvs. helling [(μmol / g / h]) for hver prøve som et individuelt datapunkt for å utføre statistisk analyse, og plotte verdier hvis forskjellige lipolytiske forhold sammenlignes. Hvis lipolytiske hastigheter sammenlignes på tvers av genotyper, bruk to eller tre prøver per dyr som tekniske replikater, og bruk gjennomsnittet for ett datapunkt per dyr, slik at prøvestørrelsen er lik antall dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi målte den basale og stimulerte lipolytiske hastigheten av in vitro differensierte adipocytter. Primære preadipocytter fra inguinalt hvitt fettvev ble differensiert til adipocytter ved behandling av konfluente celler med 5 μM deksametason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insulin og 1 μM troglitason i 4 dager, etterfulgt av ytterligere 3 dagers behandling med 1 μg/ml insulin. Cellene ble inkubert i medier uten insulin i 24 timer før lipolyseanalysen. På tid = 0h ble cellene vasket en gang med PBS, deretter ble fenolfri DMEM med 2% BSA, inneholdende enten 10 μM CL-316,243 eller kjøretøykontroll, tilsatt til hver brønn på 12-brønnsplaten. Ved tid = 1 time, 2 timer, 3 timer og 4 timer ble 50 % av mediene samlet inn og erstattet med 2 % BSA i fenolfri DMEM. FFA- og glyserolnivåer ble målt i innsamlede medier og føflekker av FFA, og glyserol utskilt i media ble beregnet ved hvert tidspunkt (figur 2A, B). FFA- og glyserolproduksjonen var lineær for 4-timersanalysen, medR2-verdier på 0,98 og over. 4 h FFA-nivåene var litt lave, noe som indikerer at lipolytiske priser kan ha bremset; Imidlertid hadde analyse med og uten 4-timers tidspunkt ingen signifikant innvirkning på den beregnede lipolytiske hastigheten. Stimulerte lipolytiske rater var signifikant høyere enn basalrater (figur 2C). Lipolytisk stimulering resulterte i produksjon av FFA og glyserol i et nær 3: 1 molforhold i alle innsamlede prøver, som forventes fra fullstendig triglyseridlipolyse uten signifikant gjenopptak eller retensjon (figur 2D). Men i de ustimulerte cellene var forholdet nærmere 1, noe som tyder på en ikke-lipolytisk kilde til glyserol48,49,50.

Figure 2
Figur 2: Lipolytisk hastighet in vitro differensierte primære adipocytter. Preadipocytter ble differensiert i en 12-brønnsplate. Insulin ble fjernet fra mediet 24 timer før lipolytisk analyse. Ved tid = 0 t ble cellene stimulert med 10 μM CL-316 243 (CL) eller behandlet med kjøretøyets (V) kontrollmedier. Nmol av (A) FFA og (B) glyserol produsert i hver brønn ved hvert tidspunkt ble plottet over tid, og en lineær regresjonslinje ble montert for hver enkelt brønn. (C) Rate av FFA produksjon. (D) Hastighet på glyserolproduksjon. Data er representert som gjennomsnittlig ± SEM. (E) Molforholdet mellom FFA:glyserol i de innsamlede mediene ved hvert tidspunkt. Statistisk analyse i (C) og (D) ble utført med studentens t-test; effekten av CL var signifikant ved α = 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I cellekultur er monolaget av celler i direkte kontakt med mediet, mens i vev dyrket ex vivo, er celler i sentrum ikke i kontakt med media. Således, i ex vivo kulturer, er FFAs mer sannsynlig å bli beholdt i vevet. Større biter av vev, som har et lavere overflateareal til volumforhold, viser høyere FFA-retensjon, noe som resulterer i lavere FFA: glyserolmolforhold (figur 3A). Med avtagende vevsbitstørrelse nærmer molforholdet mellom FFA: glyserol frigjort 3: 1 (figur 3A). Imidlertid kan vevsbiter også være for små. I tillegg til utfordringen med å jobbe med små biter av fettvev, viser 1-2 mg biter av fettvev reduserte lipolytiske hastigheter, noe som tyder på redusert levedyktighet og funksjonalitet av vevet (figur 3B, C). Selv om det er kjedelig og tidkrevende å kutte fettvev i biter av konsistent størrelse og form, er det nødvendig å oppnå sammenlignbare og pålitelige resultater. Vi anbefaler 5 til 10 mg fettvev, men konsistens er viktigst. Lipolytiske hastigheter kan fortsatt måles reproduserbart i større vevsbiter, men det er viktig å vurdere tilbakemeldingshemmingen av lipolyse ved FFAs 63,64,65,66,67.

Figure 3
Figur 3: Effekt av vevsbitstørrelse på FFA-frigjøring og lipolytisk hastighet. Gonadalt hvitt fettvev fra en fettrik diett matet kvinnelig C57Bl / 6J mus ble samlet og kuttet i biter av varierende størrelse. Alle brønner inneholdt totalt 25-30 mg fettvev; For 25 mg brønnene var dette en del av vevet; 10 mg brønner hadde tre biter av vev hver av ~ 10 mg, 5 mg brønner inneholdt fem eller seks biter av vev, og 2 mg brønner inneholdt 13-16 biter. Ved tid = 0 t ble lipolyse stimulert med 0,5 μM CL-316 243 (CL), eller kontrollbrønnene ble behandlet med kjøretøy (V). Den beregnede lipolytiske hastigheten fra prøver samlet inn etter 1 time, 2 timer og 3 timer er plottet for (A) FFAs og (B) glycerol. (C) Molforholdet mellom FFA: glyserolproduksjon i hver brønn. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse i (A) og (B) ble utført ved hjelp av en toveis ANOVA med en Holm-Sidak post-hoc analyse, α = 0,05. Effekten av CL var signifikant i alle prøvene. Innenfor CL-behandlede prøver var frekvensen av FFA- og glyserolproduksjon signifikant forskjellig i alle parvise sammenligninger, bortsett fra 10 mg versus 5 mg-prøvene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Den negative effekten av FFA-retensjon kan observeres i 25 mg vevsbiter, som viser lavere frekvenser av både FFA- og glyserolproduksjon ved stimulering (figur 3B, C). Denne tilbakemeldingshemmingen er også tydelig når FFA-bindingskapasiteten til mediet er for lav (dvs. det er ikke nok BSA i media). Når BSA i media ble redusert til 0,5%, ble FFA-utgivelsen redusert mer enn fire ganger, og glyserolfrigivelsen redusert nesten dobbelt (figur 4A,B). Som en enkel tommelfingerregel bør mikromolære nivåer av FFA i media ikke nærme seg prosentandelen av BSA i media (dvs. FFA-nivåer bør forbli under 5 mM FFA i 5% BSA-medier og 0,5 mM i 0,5% BSA-medier [på dette nivået er det 20: 3 molforholdet mellom FFA: BSA]). For å teste den maksimale BSA-bufferkapasiteten for fremstilling av BSA-medier, samle media fra en 24-timers stimulert prøve og måle konsentrasjonen av FFA (konsentrasjonen vil være høy, så et lavere prøvevolum eller prøvefortynning anbefales). FFA-akkumuleringen i 5% BSA-mediet etter 24 timers stimulering var ca. 5 mM, mens FFA-innholdet i 0,5% BSA-mediet bare var 0,6 mM (figur 4C). Når man ser på FFA-konsentrasjonen i de innsamlede mediene, kan man se at BSA-mediets FFA-bindingskapasitet på 0,5% er overbelastet (figur 4D). Mens FFA-nivåene i 5% BSA-mediene er mye høyere, overskrider de ikke bufferkapasiteten til mediet (figur 4D). Ideelt sett bør FFA-konsentrasjonen i media forbli under et 3: 1 FFA: BSA-molforhold (dvs. 2,3 mM FFA i 5% [0,75 mM] BSA).

Figure 4
Figur 4: Utilstrekkelige BSA-nivåer resulterer i reduserte tilsynelatende lipolytiske hastigheter. Gonadalt hvitt fettvev fra et fettfattig kosthold matet kvinnelig C57Bl / 6J mus ble samlet og kuttet i ~ 5 mg biter. Totalt ble det satt inn 20-30 mg fettvev i hver brønn. Ved tid = 0 t ble lipolysen stimulert med 0,5 μM CL-316 243 (CL), eller kontrollbrønnene ble behandlet med kjøretøy (V) i enten 5 % BSA-medier eller medier inneholdende bare 0,5 % BSA. Den beregnede lipolytiske hastigheten fra prøvene samlet inn etter 4 timer er plottet for (A) FFAs og (B) glycerol. Effekten av CL var signifikant i alle prøvene. Innenfor de CL-behandlede prøvene var frekvensen av både FFA- og glyserolproduksjon signifikant forskjellig mellom 5% og 0,5% BSA-mediebetingelsene. (C) FFA-nivåer i media fra de stimulerte brønnene etter 24 timer. (D) FFA-nivåer i prøvene samlet inn ved 4 timer. (E) FFA-standardkurver med og uten forskjellige preparater av 5% BSA i DMEM. Optisk tetthet beregnet som (Lesing B: A 550 - A 660) - (Lesing A: A550 - A660). (F) Glyserol standardkurve med og uten BSA. Optisk tetthet absorberes ved 540 nm (A540). OD-verdier ved 5,6 mM var ikke lineære og dermed ikke inkludert i standardkurven. (G) Grad av FFA-frigjøring fra kvinnelig gonadisk fettvev ved bruk av forskjellige typer BSA i analysemediet. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse i (A) og (B) ble utført ved hjelp av en toveis ANOVA med en Holm-Sidak post hoc-analyse, * p-verdi < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Det er viktig å påpeke at noen preparater av BSA inneholder FFAer. Hvert parti BSA bør testes for å sikre at FFA-innholdet er ubetydelig (merk at noen BSA-preparater markedsføres som FFA-frie). Selv om den ikke er spesifikt markedsført som FFA-fri, inneholder BSA som brukes her ikke påviselige FFA-er. Vi testet analysemediet som inneholder FFA-fri BSA (Equitech Bio Inc, BAH66), BSA brukt i eksperimenter her (Sigma, A9418), og en råere (billigere) fraksjon V BSA (Sigma, 810531). Den FFA-frie BSA og A9418 BSA produserte begge ikke noe bakgrunnssignal eller endret standard kurvehelling eller skjæringspunkt; standardkurvene var overliggende (figur 4E). Ingen påvirkning av BSA DMEM ble observert på glyserolstandardkurven heller (figur 4F). Fraksjonen V BSA produserte derimot et bakgrunnssignal i FFA-analysen, som tilsvarte en FFA-konsentrasjon på 0,3 mM (figur 4E). Denne bakgrunnen forskjøv standardkurven opp, men påvirket ikke skråningen betydelig, noe som indikerer at bakgrunnssubtraksjon er tilstrekkelig. Vi utførte også et stimulert lipolyseeksperiment ved bruk av disse tre forskjellige typer BSA, og fant at etter bakgrunnssubtraksjon var den beregnede lipolysehastigheten ikke forskjellig mellom BSA-formuleringer (figur 4F). Dette er imidlertid ofte ikke tilfelle, spesielt med mindre rene BSA-preparater som lett kan inneholde insulin eller andre komponenter som påvirker lipolysehastigheten. Hvert parti av BSA bør testes og valideres, og brukes konsekvent (dvs. prøver analysert med forskjellige partier av BSA er ikke sammenlignbare). En full standardkurve med tillegg av BSA og DMEM bør utføres ved validering av hvert parti BSA for å sikre at det ikke inneholder noe som forstyrrer enzymene i de kolorimetriske analysene.

Å ta serieprøver og erstatte volumet med ferske medier bidrar til å redusere FFA-belastningen i media gjennom hele eksperimentet. Vi målte lipolytiske priser i gonadal fettvev fra en kvinnelig mus matet et høyt fett diett i 4 måneder. I dette eksperimentet ble 5-8 mg vevsbiter (totalvekt på 25-30 mg) inkubert i 200 μL 5% BSA-medier, og 100 μL ble samlet og erstattet ved 1 time, 2 timer, 3 timer og 4 timer. FFA- og glyserolnivåer i de innsamlede mediene ble målt. Ved 3 timer hadde FFA-nivåene i media nådd faresonen på 2,3 mM (figur 5A). Tilbakemeldingshemming av lipolyse ble foreslått av mangel på økning i media FFA og glyserolnivåer ved 4 timer (figur 5A, B). Etter å ha beregnet μmol av FFA og glyserol frigjort på hvert tidspunkt og tilpasset en lineær kurve, er det tydelig at lipolytisk hastighet begynner å synke ved 4 timer i de stimulerte prøvene, med R2-verdier så lave som 0,976 for FFA og 0,983 for glyserol (figur 5C, D). Når man ser på restplottet, er det klart at 4 h-verdiene er under den lineære trenden (dvs. restene er negative) (figur 5E,F). Utelukkelse av 4-timerstidspunktet økte R2-verdiene til 0,997 og 0,998 og høyere for henholdsvis FFA og glyserol. Inkludering av 4-timers tidspunkt forårsaker en liten, men signifikant reduksjon i de beregnede FFA- og glyserolfrigivelseshastighetene (figur 5G,H).

Figure 5
Figur 5: Beregning av lineær lipolytisk hastighet i ex vivo fettvev. Gonadalt hvitt fettvev fra et fettfattig kosthold matet kvinnelig C57Bl / 6J mus ble samlet og kuttet i ~ 5 mg biter. Totalt ble det satt inn 20-30 mg fettvev i hver brønn. Ved tid = 0 t ble lipolysen stimulert med 0,5 μM CL-316 243 (CL), eller kontrollbrønnene ble behandlet med kjøretøy (V). Mediesamlinger ble utført ved 1 time, 2 timer, 3 timer og 4 timer. (A) FFA og (B) glyserolnivåer i media. (C) FFA og (D) glyserolproduksjon plottet over tid. Restplater for (E) FFA og (F) glyserolproduksjon over tid. Utgivelseshastighet av (G) FFA og (H) glyserol, beregnet med og uten 4 timers tidspunkt. (I) FFA-frigjøring i kvinnelig gonadisk fettvev. Nesten 50% av mediene endret seg ved 1 time, 2 timer og 3 timer. Mellom timer samlet de 15 minuttene 2,75% av mediene uten erstatning. Data er representert som gjennomsnitt ± SEM. Statistisk analyse i (G) og (H) ble utført ved hjelp av en toveis ANOVA med en Holm-Sidak post-hoc-analyse, * p-verdi < 0,05. Effekten av CL var signifikant i alle prøver (p-verdi < 0,05). Innenfor CL-behandlede prøver var frekvensene for både FFA- og glyserolproduksjon signifikant forskjellig mellom beregninger med og uten 4-timers tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I motsetning til tidligere protokoller, bruker denne protokollen flere tidspunkter for å bestemme lipolytisk hastighet, og dermed redusere målefeil og gi intern validering at den lineære hastigheten av lipolyse blir målt. For å opprettholde lipolyse i den lineære fasen ved hvert innsamlingspunkt, samles og erstattes 50% av mediene. Siden linearitet er kritisk, ønsket vi å sikre at tilsetning av ferske medier ikke forårsaket et utbrudd av lipolyse ved hver tilsetning. For å validere lineariteten mellom tidspunktene tok vi et svært lite utvalg (2,75 %) hvert 15. minutt mellom timetidspunktene fra 1 time til 3 timer, uten erstatning. Ved 1 time, 2 t og 3 timer ble den normale 50% prøvesamlingen laget og erstattet. Frekvensen av FFA-frigjøring var lineær mellom de vanlige tidspunktene, noe som indikerer at det ikke var et utbrudd av lipolyse med hver tilsetning av ferske medier (figur 5I).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en grunnleggende protokoll for måling av graden av lipolyse i adipocytter og ex vivo fettvev. For å kvantifisere lipolyse er det viktig å måle lipolytisk hastighet i den lineære fasen. Vi bruker en seriell prøvetakingsteknikk, der en stor del av mediene samles inn og erstattes med ferske medier med jevne mellomrom. Denne semikonservative metoden tillater tillegg av fersk BSA med FFA-bufferkapasitet og forsinker tilbakemeldingshemming, noe som forlenger varigheten av lineær lipolyse. Denne eksperimentelle designen forsøker å rekapitulere vaskulariseringen av fettvev in vivo, som leverer ferskt albumin for å binde frigjorte FFAs75. Denne protokollen ble optimalisert for å måle lipolyse i murine ex vivo hvitt fettvev og inguinalt fettvev primære preadipocytter differensiert in vitro. Protokollen kan sannsynligvis optimaliseres for å fungere godt i brune og beige fettdepoter, samt fettvev fra andre organismer og immortaliserte cellelinjer med høyt adipogent potensial. Protokollen tillater fleksibilitet i alder, kjønn og diett hos musene før innsamling av fettvev for ex vivo-analyser . Noen manipulasjoner, som fasting, kan påvirke den basale lipolytiske hastigheten, mens andre inngrep som diettindusert fedme også påvirker frekvensen av stimulert lipolyse.

Protokollen må optimaliseres for hvert eksperimentelt system, avhengig av om lipolytiske hastigheter er høyere eller lavere. For å validere lineariteten anbefaler vi at du beregner R2-verdiene og ser på restplottet. R2-verdiene skal være svært nær 1. Ved vurdering av restplottet bør man være på utkikk etter negative restverdier på senere tidspunkter, da disse indikerer at lipolytiske rater synker, og lineariteten går tapt. Eksempler på slike restplott er vist i figur 5E,F. Eliminering av 4 timers tidspunkter i dette tilfellet gir en mer nøyaktig beregning av den lineære lipolytiske hastigheten og forbedrer R 2-verdiene. Men siden frekvensen beregnes fra flere tidspunkter, er den relativt robust, og inkluderingen av et slikt tidspunkt har bare liten innvirkning på R2-verdiene og den beregnede lipolysehastigheten. Hvis et enkelt tidspunkt brukes til å beregne lipolytisk hastighet, kan dataene lettere skjeve.

Måten dataene normaliseres på, kan også påvirke de relative resultatene mellom utvalgene. Her anbefaler vi å normalisere ex vivo-vevet til vevsvekten og de primære preadipocytter differensiert in vitro per brønn. Imidlertid kan disse normaliseringsteknikkene ikke være passende for alle eksperimentelle systemer. Det er viktig at hvis spredningshastigheten eller differensieringseffektiviteten er forskjellig mellom grupper, er normalisering per brønn ikke hensiktsmessig. Alternative normaliseringsteknikker inkluderer protein, lipid og DNA. Hver metode for normalisering har sine fordeler og ulemper. Vevvekt og godt normalisering er enkel og grei. Forskjeller i adipocyttstørrelse kan bety at magert fettvev inneholder mange flere adipocytter per gram enn overvektig fettvev, mens forskjeller i differensieringseffektivitet kan resultere i forskjeller i antall adipocytter per brønn. Lipider kan ekstraheres med organiske løsningsmidler (f.eks. 2: 1 kloroform: metanol [v / v]) og triglyseridinnhold målt ved hjelp av et kolorimetrisk reagens. Mens normalisering til lipidinnhold ikke er en tradisjonelt brukt metode, er lipiddråpene tross alt organellen som gjennomgår lipolyse, og denne normaliseringsmetoden er spesifikk for adipocytter, noe som kan være nyttig når differensieringshastighetene varierer mellom celler. Etter lipidekstraksjon kan 0,1-0,3 N NaOH brukes til å trekke ut protein, som deretter kan analyseres av Bradford eller BCA-proteinanalyse68. Alternativt kan prøvene homogeniseres i lysisbuffer, og lipidfraksjonen fjernes ved sentrifugering70. Merk at lipidforurensning vil forstyrre proteinanalysene. Hvis protein skal brukes til normalisering, må cellene vaskes omfattende (minst tre ganger) for å fjerne BSA fra analysemediet. Noen ganger holder differensierte adipocytter seg ikke godt til platen og tolererer ikke de tre vaskene som kreves for å fjerne overflødig BSA. Normalisering til DNA muliggjør normalisering til cellenummer, og kan utføres med et kommersielt DNA-ekstraksjonssett, etterfulgt av kvantifisering av totalt DNA ved absorbans eller sanntids PCR-analyse av genkopinummer. Alternativt, i belagte celler, kan DAPI-farging etterfulgt av avbildning brukes til å telle kjerner og normalisere til cellenummer. Ved normalisering ved bruk av cellenummer eller protein er det viktig å vurdere ikke-adipocytter i prøven. Fettvev inneholder også immun- og endotelceller; I overvektig fettvev kan betennelse og hypertrofi resultere i så få som 1 av 10 kjerner som kommer fra modne adipocytter. Imidlertid bidrar adipocytter fortsatt til størstedelen av massen og lipidinnholdet i vevet. For in vitro differensierte preadipocytter påvirker differensieringseffektiviteten den relative prosentandelen av modne adipocytter; Når dette er tilfelle, er normalisering komplisert. Ideelt sett bør differensieringseffektiviteten optimaliseres før man bruker cellene til en lipolyseanalyse. Hvis det ikke er mulig, anbefales normalisering til lipidinnhold hvis lipiddråpevolumet er likt mellom differensierte adipocytter. Sammenligning av lipolytiske hastigheter på tvers av adipocytkulturer med ulik differensiering kan føre til feilaktige konklusjoner om lipolyse når den drivende faktoren faktisk er adipogenese; Dette er en begrensning av protokollen.

Langkjedede FFAer feedback-hemmer lipolyse 63,64,65,66,67. FFA-er akkumuleres når de ikke er tilstrekkelig sekvestrert i media. Mye av feilsøkingen knyttet til optimalisering av måling av lipolyse er relatert til å minimere FFA-oppbevaring. Beregning av molforholdet mellom FFA: glyserolutslipp i media bidrar til å identifisere problemer knyttet til FFA-retensjon. Hvis molforholdet er 3: 1 for FFA: glyserol, blir alle produktene av lipolyse frigjort og fanget i media, mens et forhold under 2: 1 er grunn til bekymring. En viktig faktor for ex vivo-analyser er størrelsen på fettvevsbiten. Større biter av vev har et lavere overflateareal til volumforhold, og er dermed mer sannsynlig å beholde FFA og utvise reduserte lipolytiske hastigheter som en konsekvens (figur 4A, B). Med dette i bakhodet er det viktig å kutte fettvevet for hver prøve i biter av konsistent størrelse og form. For å legge til rette for FFA-sekvestrering i media, er det også viktig å sikre at mediene inneholder tilstrekkelig BSA til å binde den frigitte FFA. FFA-bufferkapasiteten til mediet kan økes ved å øke konsentrasjonen av BSA eller øke volumet av medier. Det er like effektivt å øke innsamlingsvolumet eller frekvensen. Hvis man observerer høye lipolytiske hastigheter, men FFA: glyserolforhold under 2: 1, anbefaler vi å øke innsamlingsfrekvensen til hver 30 min og stoppe analysen ved 2,5 timer.

Protokollen gitt her er optimalisert for mus ex vivo hvitt fettvev og primære preadipocytter differensiert in vitro, som begge er svært lipolytiske. Analysen må optimaliseres for å måle lipolyse i andre systemer, eller hvis forskjeller i den relativt lave basalhastigheten av lipolyse er av spesiell interesse. For eksempel har 3T3-L1 adipocytter lavere lipolytisk aktivitet32. Når lipolytisk hastighet er lav, bør inkubasjonsvolumet reduseres (dvs. i stedet for 400 μL per brønn i en 24-brønnplate, bør 200 μL i en 24-brønnplate brukes, eller 300 μL i en 12-brønnplate og 100-150 μL samlet per tidspunkt. Oppsamlingsvolumet bør ikke falle under 100 μL, da større prøvevolumer kreves for nøyaktig måling av lave FFA- og glyserolnivåer. For å analysere glyserol ved bruk av 50 μL media per prøve, bør det frie glyserolreagenset oppløses i 31 ml vann og 150 μL reagens brukes med 50 μL prøve i hver brønn. FFA-nivåer kan måles med 25 μL prøve per brønn, kanskje mer, så lenge lineariteten opprettholdes. Tidspunkter kan også utvides for å øke signalet. Ved beregning av lipolytiske hastigheter fra andre celler enn hvite adipocytter, bør forskjeller i cellulær metabolisme vurderes. For eksempel uttrykker brune og beige adipocytter mye høyere nivåer av glyserolkinase, og er dermed i stand til å beholde glyserolfrigivelse ved lipolyse76,77. Disse metabolsk aktive cellene kan også være i stand til å kanalisere frigjorte fettsyrer til katabolske eller syntetiske veier uten frigjøring i mediet. Den metabolske skjebnen til FFA og glyserol i den spesifikke celletypen som analyseres, må vurderes ved tolkning av resultatene av en lipolyseanalyse, spesielt i en annen celletype enn hvite adipocytter. Lipolyseanalyser i andre celletyper må optimaliseres og valideres.

Denne protokollen er utformet for å evaluere forskjeller i lipolytisk hastighet i musemodeller. Primære preadipocytter differensiert in vitro er et nyttig verktøy for å undersøke celleautonome effekter av genetiske manipulasjoner eller farmakologiske behandlinger i adipocytter. Fettvev inneholder derimot andre celletyper, inkludert immunceller. Virkningen av fettvev immunceller i regulering av lipolyse er viktig å vurdere når man vurderer hele vev lipolyse. Kultiverte adipocytlipolysemodeller kan omgå den potensielle kompliserende påvirkningen av immunceller og muliggjøre grundig undersøkelse av de spesifikke celletypene, mens fettvevseksplanter muliggjør en mer robust sammenligning med in vivo-miljøet . I tillegg kan ex vivo-analysen brukes til å undersøke lipolytiske hastigheter i forskjellige fettdepoter. I disse systemene stimuleres lipolyse av forbindelser som β-adrenerge reseptoragonister, og eventuelle endringer i sympatisk tone som kan påvirke in vivo musemodellen vil derfor ikke bli observert. In vivo måling av lipolyse er komplisert av dynamikken i FFA og glyserol frigjøring og opptak i ulike vev i hele kroppen. Serum-FFA- og glyserolnivåer på et gitt tidspunkt er balansen mellom sekresjon og opptak, og det bør ikke antas at endringer i serum FFA- og glyserolnivåer utelukkende skyldes fettvevslipolyse. Fasteindusert lipolyse påvirkes av sympatisk tone, men gir ikke raske og robuste endringer i serum FFA- eller glyserolnivåer, noe som gjør det vanskelig å tolke endringer i fastende serumnivåer av FFA og glyserol. In vivo kan lipolyse stimuleres ved hjelp av en β-3 adrenerg reseptoragonist, slik som CL-316,243, og økt serum FFA og glyserol kan påvises innen 20 minutter etter stimulering. In vivo lipolytiske analyser bør omfatte både baselinemålinger av serum FFA og glyserol, samt en kjøretøykontroll; På denne måten kan den stimuleringsspesifikke endringen i serum FFA og glyserolnivåer bestemmes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av US National Institutes of Health grant R01DK126944 til SMR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-Well tissue culture treated plate Corning Inc 3527 Must be tissue culture treated for adipocyte differntiation
48-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353078 Can be tissue culture treated
6-Well flat bottom plate with lid Corning Inc 353046 Can be tissue culture treated
96-Well PCR Plate USA sceintific 1402-9100 Any conical 0.2 mL PCR plate will be convenient 
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418 FFA free BSA such as A8806, is also commonly used. The BSA should not have detectable FFA, also lot to lot variations in BSA can impact the observed rate of lipolysis
CL-316,243 Sigma Aldrich C5976 CAS #: 138908-40-4 availaible from other suppliers
CO2 incubator PHCBI MCO-170AICUVH CO2 should ideally be set to 10% for adipose tissue, however 5% CO2 will also work
DMEM, low glucose, no phenol red Thermofischer 11054020 Any phenol red free media should work, DMEM/F12, RPMI, but should contain volatile buffering capacity, i.e. biocarbonate
FFA-free Bovine serum albumin Equitech-Bio, Inc,  BAH66
Free Glycerol Reagent Sigma Aldrich F6428
Glycerol Standard Solution Sigma Aldrich G7793  This can also be made by diluting glycerol to the desired concentration
HR Series NEFA Standard Solution Fujifilm 276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent A Fujifilm 999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent B Fujifilm 991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A  Fujifilm 995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B  Fujifilm 993-35191
Microbiological Incubator Fischer Scientific S28668 Any incubator at 37C can be used
Nunc MicroWell 96-Well Plates Thermo Scientific 269620 Any optically clear, flat bottom 96-well plate works
Silicone Laboratory Benchtop Mat VWR 76045-300 Glass plate can also be used. Absorbant surfaces are not recommended
Spectrophotometer/Microplate Reader Molecular devices SpectraMax i3x  Any plate reader that can read at 540, 550 and 660 mm will work
V Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 810531
WypAll X70 Wipers Kimberly-Clark 41200 Any high quality paper towel will work

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119 (2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357 (2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607 (2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502 (2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103 (2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711 (2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518 (2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625 (2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 193
Måling av graden av lipolyse i <em>ex vivo</em> murint fettvev og primære preadipocytter differensiert <em>in vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M.… More

Bridge-Comer, P. E., Reilly, S. M. Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro. J. Vis. Exp. (193), e65106, doi:10.3791/65106 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter