Summary
تصف هذه الدراسة نموذج فأر لدراسة التأثير التآزري للنيكوتين على تطور التليف الرئوي في الفئران السحارية التجريبية. يحاكي نموذج الماوس ثنائي التعرض التطور المرضي في الرئة بعد التعرض المتزامن للنيكوتين والسيليكا. الطرق الموصوفة بسيطة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة.
Abstract
التدخين والتعرض للسيليكا شائعان بين العاملين المهنيين ، ومن المرجح أن تصيب السيليكا رئتي المدخنين أكثر من غير المدخنين. دور النيكوتين ، المكون الرئيسي للإدمان في السجائر ، في تطور السحار السيليسي غير واضح. كان نموذج الفأر المستخدم في هذه الدراسة بسيطا ويمكن التحكم فيه بسهولة ، وقد حاكي بشكل فعال آثار ابتلاع النيكوتين المزمن والتعرض المتكرر للسيليكا على تليف الرئة من خلال الانتقال الظهاري الوسيطة في البشر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد هذا النموذج في الدراسة المباشرة لتأثيرات النيكوتين على السحار السيليسي مع تجنب آثار المكونات الأخرى في دخان السجائر.
بعد التكيف البيئي ، تم حقن الفئران تحت الجلد بمحلول النيكوتين 0.25 ملغم / كغم في الجلد المترهل فوق الرقبة كل صباح ومساء على فترات 12 ساعة على مدى 40 يوما. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعليق مسحوق السيليكا البلوري (1-5 ميكرومتر) في محلول ملحي عادي ، مخفف إلى معلق 20 مجم / مل ، وتم توزيعه بالتساوي باستخدام حمام مائي بالموجات فوق الصوتية. استنشقت الفئران المخدرة بالإيزوفلوران 50 ميكرولتر من تعليق غبار السيليكا هذا من خلال الأنف وتم إيقاظها عن طريق تدليك الصدر. تم إعطاء التعرض للسيليكا يوميا في الأيام 5-19.
تعرض نموذج الفأر مزدوج التعرض للنيكوتين ثم السيليكا ، والذي يتطابق مع تاريخ التعرض للعمال الذين تعرضوا لكلا العاملين الضارين. بالإضافة إلى ذلك ، عزز النيكوتين التليف الرئوي من خلال التحول الظهاري الوسيطة (EMT) في الفئران. يمكن استخدام هذا النموذج الحيواني لدراسة آثار عوامل متعددة على تطور السحار السيليسي.
Introduction
التعرض للسيليكا في العمال أمر لا مفر منه في بعض البيئات المهنية ، وبمجرد التعرض للسيليكا ، يتطور التدهور حتى بعد إزالته من البيئة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم هؤلاء العمال يدخنون ، وتحتوي السجائر التقليدية على آلاف المواد الكيميائية ، مع كون المكون الرئيسي للإدمان هو النيكوتين1. أصبحت السجائر الإلكترونية شائعة بشكل متزايد في الفئات العمرية الأصغرسنا 2 ؛ تعمل هذه السجائر الإلكترونية كنظام لتوصيل النيكوتين وتزيد من الوصول إلى النيكوتين ، وبالتالي تزيد من حساسية الرئة والالتهاب الرئوي3. يسرع دخان السجائر أيضا التليف الرئوي في الفئران المعرضة للبليوميسين4 ويزيد من السمية الرئوية والتليف في الفئران المعرضة للسيليكا 5,6. ومع ذلك ، لا يزال يتعين التحقيق فيما إذا كان النيكوتين يمكن أن يؤثر على عملية التليف الالتهابي والرئوي الناجم عن السيليكا.
نموذج الفأر السيليسي الذي أنشأه استنشاق جرعة عالية من السيليكا لمرة واحدة في القصبة الهوائية هو صدمة للفئران. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر بسرعة نموذج السحار السيليسي ، إلا أنها لا تتطابق مع واقع البيئة التي يتعرض فيها العمال بشكل متكرر للسيليكا. لذلك ، أنشأنا نموذجا للفأر المكشوف للسيليكا عن طريق إعطاء جرعة منخفضة من معلقات السيليكا بشكل متكرر عن طريق التنقيط الأنفي. هذه الجرعة يمكن أن تسبب التهاب وتليف في الفئران.
للتحايل على آثار مكونات السجائر الأخرى ، تم حقن نموذج الفأر هذا تحت الجلد بالنيكوتين في الجلد الرخو للرقبة لتحديد تأثير المكون الذي يسبب الإدمان ، النيكوتين ، على السحار السيليسي. من خلال إعطاء الحقن تحت الجلد ، يمكن تحقيق جرعات دقيقة ، مما يجعل من الممكن إنشاء نماذج التعرض للنيكوتين ومراقبة استجابات سمية الجرعة ، وكذلك الإدمان. تم تطوير نموذج إدمان النيكوتين في ذكور الفئران ، مع جرعة حقن النيكوتين من 0.2-0.4 ملغم / كغم 7,8. في هذا النموذج ، لتلبية احتياجات البحث عن المخدرات للفئران المدمنة ، تم إعطاء حقنتين تحت الجلد على فترات 12 ساعة. هذا النموذج لإدمان النيكوتين على الفئران مفيد لمحاكاة عادات التدخين البشرية والتعرض للسيليكا.
النماذج الحيوانية أحادية العامل لها قيود في دراسات الأمراض ، في حين أن الطريقة الموصوفة هنا تتضمن نموذجا للفأر ثنائي العامل للتعرض المشترك للنيكوتين والسيليكا. قبل التعرض للسيليكا ، تعرضت الفئران مسبقا للنيكوتين لتكرار التعرض للنيكوتين لدى الأشخاص الذين يدخنون. بعد ذلك ، حدث التعرض للسيليكا من اليوم 5 إلى اليوم 19 لتقليد التعرض للسيليكا في بيئة عمل للأفراد الذين لديهم تاريخ من التدخين.
من المعروف أن البلاعم السنخية تلعب دورا مهما في تنظيم التهاب الرئة والتليف. لا يمكن للبلاعم تكسير السيليكا عند استنشاقها للسيليكا ، مما يؤدي إلى استقطاب البلاعم أو موت الخلايا المبرمج9 وإطلاق السيتوكينات مثل عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β). الضامة M1 ، والتي يتم تحديدها من خلال وجود علامة السطح CD86 ، هي المحرضين الرئيسيين للاستجابة الالتهابية في السحار السيليكي ، في حين أن الضامة M2 ، التي تتميز CD206 ، هي المسؤولة عن المرحلة الليفية للحالة10. في الفئران ذات التعرض المزدوج ، تسبب النيكوتين في استقطاب الضامة نحو النمط الظاهري M2 في الرئتين المصابة بالسيليكا ، وبالتالي تعزيز التليف الرئوي. علاوة على ذلك ، TGF-β1 هو مفتاح تحريض التليف و EMT11. أدى التعبير المتزايد عن TGF-β1 إلى تسريع تطور تليف الرئة من خلال EMT. نجح هذا النموذج في تحليل آثار النيكوتين على السحار السيليسي وسلط الضوء على أهمية التوقف عن النيكوتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (الطبعة 8 من NRC) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا.
1. إعداد
- يضم 32 ذكرا من الفئران C57 / BL6 تتراوح أعمارهم بين 8 أسابيع في مختبر مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة. تأكد من أن الفئران لديها حرية الوصول إلى الطعام والماء.
- بعد أسبوعين من التأقلم مع البيئة ، عندما تزن الفئران البالغة من العمر 10 أسابيع 23-26 جم ، استخدم أرقاما عشوائية تم إنشاؤها بواسطة الكمبيوتر لتجميع بشكل عشوائي دون تقسيم ، مما أدى إلى أربع مجموعات من الفئران: المجموعة الضابطة (Con) ، ومجموعة النيكوتين (Nic) ، ومجموعة السيليكا (SiO 2) ، والنيكوتين جنبا إلى جنب مع مجموعة السيليكا (Nic + SiO2).
2. إعداد النيكوتين
ملاحظة: كثافة النيكوتين هي 1.01 جم / مل.
- قم بإذابة النيكوتين في الإيثانول اللامائي ، وقم بتخفيف 20x لتحضير محلول مخزون النيكوتين 50 مجم / مل.
- قم بتخفيف محلول مخزون النيكوتين 1000 مرة باستخدام محلول ملحي عادي معقم لصنع محلول عملي بتركيز 0.05 مجم / مل.
ملاحظة: قم بتخزين النيكوتين بعيدا عن الضوء. يمكن تخزين محلول المخزون عند 4 °C لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
3. إعداد السيليكا
- السيليكا البلورية المعقمة في محلول ملحي لتحضير معلق سيليكا 20 مجم / مل ، وقم بتذبذبه في حمام مائي بالاهتزاز بالموجات فوق الصوتية لمدة 25 دقيقة.
- هز تعليق السيليكا مع مذبذب دوامة لمدة 3 دقائق قبل أن تتلقى الفئران بالتنقيط الأنفي. امزج تعليق السيليكا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 2x-3x باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، ثم تناول 50 ميكرولتر للتنقيط الأنفي.
ملاحظة: يجب خلط معلق ثاني أكسيد السيليكون وإدارته عن طريق التنقيط الأنفي في أسرع وقت ممكن.
4. التقاط الماوس والتعرض للنيكوتين
- وزن الفئران ، وتسجيل الأوزان يوميا قبل التعرض.
- في الأيام 1-40 ، حقن النيكوتين تحت الجلد مرتين يوميا (12 ساعة على حدة) في الفئران في مجموعات Nic و Nic + SiO2 . يجب استخدام جرعة من النيكوتين مقدارها 0.25 ملغ/كغ; على سبيل المثال ، تأكد من أن الماوس الذي يزن 25 جم يتلقى 6.25 ميكروغرام من النيكوتين. بالنسبة لهذا الماوس ، سيكون حجم الحقن كما يلي: 6.25 / 0.05 = 125 ميكرولتر. في وقت واحد ، حقن الفئران في مجموعة Con بحجم متساو من المياه المالحة.
- قم بإعداد المحاقن المطلوبة سعة 1 مل لكل مجموعة ، واستخدمها لشفط حجم حقن النيكوتين أو المحلول الملحي. قبل تناول النيكوتين ، اسحب أولا 0.1-0.2 مل من الهواء إلى المحقنة ، ثم اسحب 125 ميكرولتر من النيكوتين. اضغط بعناية على المحقنة لملء الإبرة والطرف الأمامي للمحقنة بالنيكوتين. ضع المحقنة التي تحتوي على النيكوتين في صينية محمية من الضوء.
ملاحظة: في وقت الحقن ، يوجد 0.1-0.2 مل من الهواء خلف النيكوتين ، مما يضمن إعطاء كل السائل بنجاح للماوس. - أمسك ذيل الماوس باليد اليمنى ، وعندما يرتاح ، استخدم الإبهام الأيسر والسبابة للضغط على الجلد على الجزء الخلفي من الرقبة من الذيل إلى الرأس حتى حافة الأذن ، مع ممارسة ضغط معتدل. بعد ذلك ، حرر اليد اليمنى ، واستخدم الإبهام الصغير الأيسر وإصبع البنصر لقرص الذيل والأطراف الخلفية ، وعند هذه النقطة سيتم تجميد الماوس تماما بواسطة اليد اليسرى.
ملاحظة: أمسك الماوس بالقوة المناسبة. القوة غير الكافية تجعل من السهل على الفئران أن تعض ، في حين أن القوة المفرطة قد تؤدي إلى اختناق الفئران. - باستخدام اليد اليمنى للحقن ، قم بثقب الجلد على الجزء الخلفي من الرقبة بالقرب من حافة أذن الفئران في اتجاه من الرأس إلى الذيل باستخدام المحقنة ، وحقنه بالنيكوتين بمعدل موحد. ابحث عن انتفاخ الجلد نصف الدائري الذي يشير إلى نجاح الحقن.
ملاحظة: عندما ثقب الإبرة في الجلد ، سيكون هناك شعور بالمقاومة. تختفي المقاومة بعد إدخال الإبرة. في هذه المرحلة ، يجب سحب الإبرة قليلا للحقن ببطء وبشكل متساو.
5. التعرض للسيليكا في الجسم الحي
- في الأيام 5-19 ، غرس تعليق ثاني أكسيد السيليكون في تجويف الأنف للفئران في مجموعات SiO 2 و Nic + SiO2. تخدير كل فأر بسرعة باستخدام 2٪ إيزوفلوران في آلة التخدير بجرعة 3.6 مل / ساعة. بعد التخدير ، ضع الماوس على راحة يد واحدة ، وفضح تجويف الأنف للماوس. غرس 50 ميكرولتر من تعليق السيليكا في تجويف الأنف في غضون 4-8 ثوان.
- للسماح لتعليق السيليكا بدخول الرئتين في أسرع وقت ممكن ، بعد التقطير ، اضغط على قلب الفأر برفق بإصبع السبابة لمدة 3-5 ثوان ، 3x-5x في الثانية ، لتعزيز معدل التنفس.
- بعد أن يصبح تنفس الماوس موحدا تدريجيا ، ضع الماوس في قفص للمراقبة لمدة 3 دقائق.
- بالنسبة لجميع الفئران التي تتلقى تعليق السيليكا ، كرر الخطوات 1-3. في المجموعة الضابطة ، غرس 50 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم في تجويف الأنف في الأيام 5-19.
6. اقتناء أنسجة الرئة الطازجة والثابتة
- في اليوم 41 ، استخدم 50 مجم / كجم من بنتوباربيتال الصوديوم لتخدير الفئران داخل الصفاق بجرعة 0.1 مل / 20 جم وفقا لوزن الجسم. ثبت الأطراف على لوحة اختبار الرغوة ، ورش الفراء بنسبة 75٪ كحول.
- إجراء نضح القلب للحصول على أنسجة رئوية جديدة ، وقطع خط الوسط من البطن لكشف تجويف الصدر ، وعمل فتحة صغيرة في قمة القلب الأيمن. بعد ذلك ، قم بحقن 20 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات المبرد مسبقا (PBS) ببطء وبشكل متساو من قمة القلب الأيسر ، مما يتسبب في تدفق الدم من الفتحة التي تم إنشاؤها في قمة القلب الأيمن. أخرج فص الرئة بالكامل ، وضعه في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل مبرد مسبقا ، وانقله إلى -80 درجة مئوية للتخزين في انتظار استخراج البروتين.
- قم بتغذية الفئران الأخرى ب 20 مل من برنامج تلفزيوني مبرد مسبقا متبوعا ب 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد في نفس الموقع لإصلاح الرئتين بالكامل. الحفاظ على كل رئة في 30 مل من 4 ٪ PFA.
- بعد 72 ساعة ، قم بتضمين أنسجة الرئة الثابتة في البارافين.
- اغمر أنسجة الرئة في المثبت المحضر في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها عملية تجفيف في 75٪ إيثانول و 95٪ إيثانول وإيثانول لا مائي لمدة 50 دقيقة لكل منهما.
- اغسل 2x بالزيلين لمدة 50 دقيقة لكل منهما.
- ضع المنديل في شمع البارافين المذاب عند 55-60 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات بحيث يتم استبدال الزيلين في أنسجة الرئة تدريجيا بشمع البارافين.
- ثبت أنسجة الرئة في إطار التضمين بالبارافين ، وانتظر حتى تصلب كتلة الشمع. بعد أن تصلب كتلة الشمع ، استخدم آلة تقسيم البارافين لتقطيع الرئة عند 4-5 ميكرومتر.
- ضع أقسام الرئة في ماء عالي النقاء عند 45 درجة مئوية. بمجرد ذوبان البارافين ، قم بتحميل قسم الرئة على شريحة مجهر ملتصقة.
7. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE)
- اخبز الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وضع الشرائح في الزيلين لإزالة الشمع لمدة 2 × 30 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الشرائح في الإيثانول اللامائي ، والإيثانول 95٪ ، والإيثانول بنسبة 85٪ ، والإيثانول بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق لكل منها. أخيرا ، اغسلها لمدة 3 × 5 دقائق بماء فائق النقاء.
- إسقاط 50 ميكرولتر من محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين على أنسجة الرئة بمسدس ماصة ، وصمة عار لمدة 5 دقائق ؛ ثم اغسل الشرائح بالماء الجاري لمدة 5 دقائق.
- أضف 50 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 2٪ في الإيثانول على القسم ، واشطفه بالماء المقطر لمدة 30 ثانية. ثم أضف 50 ميكرولتر من محلول تلطيخ اليوزين على أنسجة الرئة لتلطيخها لمدة 1 دقيقة.
- قم بتجفيف أقسام البارافين وشفافيتها وإغلاقها.
- أضف 100-150 مل من 75٪ إيثانول و 85٪ إيثانول و 95٪ إيثانول وإيثانول لا مائي وزيلين في خزان صباغة بلاستيكي مشترك. ضع الشرائح في 75٪ و 85٪ و 95٪ والإيثانول اللامائي لمدة 5 دقائق لكل منها حتى تجف.
- ثم ضع الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق حتى تصبح شفافة.
- أخيرا ، قم بإسقاط 20 ميكرولتر من العلكة المحايدة على قسم الرئة ، وضع غطاء على الشريحة لإغلاقها.
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه في درجة حرارة الغرفة.
8. تلطيخ ماسون
- قم بإزالة الشمع والترطيب وغسل أقسام البارافين كما هو موضح في الخطوة 7.1.
- قم بتلطيخ الأقسام ب 50 ميكرولتر من محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين المكون من Weigert لمدة 7 دقائق ، متبوعا ب 50 ميكرولتر من محلول تجزئة الإيثانول الحمضي لمدة 10 ثوان ، واغسله بالماء الجاري لتحويل النوى إلى اللون الأزرق.
- تلطيخ الأقسام ب 50 ميكرولتر من محلول ماسون ثلاثي الألوان لمدة 4 دقائق ، واغسلها بالماء.
- شطف المقاطع بالماء المقطر لمدة 1 دقيقة ، ثم وصمة عار مع أرجواني حمض أحمر Lichun لمدة 7 دقائق.
- اغسل الأقسام بمحلول عمل حمضي ضعيف (30٪ حمض الهيدروكلوريك) لمدة 1-2 دقيقة ، ومحلول حمض الفوسفومولبديك لمدة 1-2 دقيقة ، ومحلول عمل حمضي ضعيف لمدة 1-2 دقيقة.
- تلطيخ الأقسام في محلول تلطيخ أزرق الأنيلين لمدة 2 دقيقة ، ثم اغسلها بمحلول عمل حمضي ضعيف لمدة 1 دقيقة.
- قم بتجفيف الأقسام بنسبة 95٪ من الإيثانول متبوعا بالإيثانول اللامائي لمدة 1 ثانية ، وقم بشفافيته باستخدام الزيلين لمدة 1 ثانية ، وأخيرا قم بإغلاقه براتنج محايد كما هو موضح في الخطوة 7.4.
9. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
- تخبز الشرائح على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. قم بإزالة الشمع والترطيب وغسل أقسام البارافين كما هو موضح في الخطوة 7.1.
- استرجاع المستضد: ضع الشرائح في صندوق تقطيع بلاستيكي مقاوم للحرارة يحتوي على محلول استرجاع مستضد سترات كاف لغمر الشرائح ، واغليها لمدة 20-30 دقيقة.
- تبرد إلى درجة حرارة الغرفة ، وتزيل الأقسام ، وتشطف بالماء منزوع الأيونات. بعد ذلك ، نقع لمدة 2 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ توين -20 (PBST).
- ارسم حلقة بالقرب من قسم الرئة على الشريحة باستخدام قلم كاره للماء لتشكيل دائرة كارهة للماء.
- أضف 50 ميكرولتر من محلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪ (3٪ H 2 O2) بالتنقيط إلى الشرائح ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء لتعطيل البيروكسيديز الداخلي.
- انقع الشرائح في PBST لمدة 3 × 5 دقائق.
- أضف 50 ميكرولتر من بروتين مصل البقر 5٪ (BSA) - PBST بالتنقيط إلى الشرائح ، واحجبه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من محلول الحجب ، وأضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة CD206 (التخفيف: 1: 1,500) ، TGF-β1 (التخفيف: 1: 200) ، وفيمنتين (التخفيف: 1: 2,000) بالتنقيط إلى الشرائح ، واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: في هذا العمل ، تم تخفيف جميع الأجسام المضادة في 5 ٪ BSA. - في اليوم التالي ، أعد الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة (40 دقيقة). اغسل الشرائح كما هو موضح في الخطوة 9.6.
- تمييع الجسم المضاد الثانوي في 5 ٪ BSA. أضف 50 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى بيروكسيديز الفجل (التخفيف: 1: 500) بالتنقيط ، واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح كما هو موضح في الخطوة 9.6.
- قم بإسقاط 50 ميكرولتر من محلول 3،3'-diaminobenzidine (DAB) المقابل للجسم المضاد الثانوي المسمى بالإنزيم على أنسجة الرئة ، واحتضانه لمدة 5-10 دقائق في صندوق مبلل كيميائي مناعي أسود. راقب تحت المجهر حتى يتطور اللون إلى اللون البني القوي. شطف شرائح بالماء المقطر لإنهاء رد الفعل.
ملاحظة: يعتبر تلطيخ البني تلطيخا إيجابيا. - وصمة عار مع 50 ميكرولتر من وصمة عار الهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية ، ويغسل بالماء الجاري. بعد ذلك ، انقع الشرائح في 75٪ ، 85٪ ، 95٪ ، والإيثانول اللامائي لمدة 3 دقائق لكل منها ثم في الزيلين لمدة 2 × 10 دقائق. أغلق الشرائح كما هو موضح في الخطوة 7.4.
10. تحليل اللطخة الغربية
- أخرج أنسجة الرئة من الفريزر وقم بوزنها. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA الذي يحتوي على PMSF لكل 20 مجم من أنسجة الرئة. تحلل رئتي الفأر على الثلج لمدة 3-5 دقائق باستخدام خالط محمول باليد ، ورجه برفق لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية للسماح بالتحلل الكافي لأنسجة الرئة ، وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و 14800 × جم لمدة 15 دقيقة ، وجمع المادة الطافية.
ملاحظة: أضف 100 مللي متر فينيل ميثان سلفونيل فلوريد (PMSF) قبل بضع دقائق من استخدام المخزن المؤقت لتحلل RIPA. التركيز النهائي ل PMSF هو 1 mM (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر من PMSF + 990 ميكرولتر من RIPA). - استخدم مجموعة تركيز بروتين BCA لتحديد تركيز البروتين في العينة باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد التحديد ، باستخدام أصغر تركيز من محللات البروتين كقاعدة ، قم بتخفيف نفس الدفعة من محللات البروتين مع RIPA إلى أصغر تركيز لتحقيق نفس الكتلة والحجم.
ملاحظة: الكمية الإجمالية لتحميل أنسجة الرئة هي 30 ميكروغرام. - أضف 40 ميكرولتر من مخزن التحميل المؤقت 5x إلى 160 ميكرولتر من محلول البروتين ، وقم بتسخينه عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتجميع جل الرحلان الكهربائي لكبريتات دوديسيل بولي أكريلاميد (SDS-PAGE) المحضر بنسبة 10٪ في نظام الرحلان الكهربائي الغربي ، وأضف المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، واسحب مشط الرحلان الكهربائي برفق ، وأضف 20 ميكرولتر من عينة البروتين لكل بئر ببطء وبشكل موحد. قم بتشغيل الطاقة ، وابدأ الرحلان الكهربائي عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة. بعد وصول البروتينات إلى طبقة الهلام السفلية ، قم بالتبديل إلى 100 فولت ، واستمر في الرحلان الكهربائي لمدة 60-70 دقيقة.
ملاحظة: يحتاج الرحلان الكهربائي إلى عازل كهربائي جديد. - نقل البروتينات إلى غشاء PVDF عن طريق النقل الرطب. قم بتنشيط غشاء PVDF بالميثانول مقدما (5-30 ثانية). أخرج لوحة هلام الرحلان الكهربائي ، وفتحها بعناية ، وضع جل الفاصل في المخزن المؤقت للنقل الرطب ، واصنع شطيرة النقل الكهربائي ، وقم بتجميع نظام النقل الرطب. املأ خزان الرحلان الكهربائي بمخزن مؤقت للنقل ، وانقله عند 400 مللي أمبير لمدة 90 دقيقة.
ملاحظة: يتم تبريد المخزن المؤقت للنقل مسبقا لتجنب تأثيرات درجات الحرارة المرتفعة أثناء النقل الرطب. - اغسل غشاء PVDF بمحلول ملحي مخزن من Tris بنسبة 0.5٪ Tween-20 (TBST) لمدة 3 × 5 دقائق. سد غشاء PVDF مع 5 ٪ الحليب الخالي من الدسم المخفف في TBST ، واحتضان على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة ؛ ثم يغسل مع TBST لمدة 2 دقيقة. بعد الغسيل ، احتضان الغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الجسم المضاد الأساسي vimentin (1: 5,000) و GAPDH (1: 10,000) المخفف في 5٪ BSA.
- ضع الغشاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، واغسله باستخدام TBST لمدة 5 × 5 دقائق. بعد الغسيل ، احتضان الغشاء بالجسم المضاد الثانوي (1: 10000) المخفف في 5٪ حليب خالي الدسم لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ضع الغشاء ، جانب البروتين لأعلى ، وقم بإسقاط محلول عمل ECL المحضر ، واحتضانه لمدة 1-2 دقيقة ، ولاحظ النتائج باستخدام جهاز تصوير هلام. استخدم قيم التدرج الرمادي التي تم قياسها بواسطة البرنامج في جهاز تصوير الهلام لتقييم مستويات تعبير البروتين.
ملاحظة: هنا ، كان GAPDH بمثابة مرجع داخلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إنشاء نموذج فأر لدراسة النيكوتين جنبا إلى جنب مع التعرض للسيليكا للتحقيق في الدور المحتمل للنيكوتين في تطور السحار السيليسي في الفئران. يوضح الشكل 1 الإجراء التجريبي لاستخدام نموذج فأر مزدوج التعرض ، والذي يقرن حقنة النيكوتين بتقطير الأنف لتعليق السيليكا. لوحظت التغيرات المرضية للفئران في كل مجموعة باستخدام تلطيخ HE. كان لدى الفئران المعرضة للنيكوتين مع السيليكا تلف رئوي أكثر حدة من تلك التي تعرضت للنيكوتين أو السيليكا وحدها. زادت الخلايا الليمفاوية بالقرب من الأوعية اللمفاوية في رئتي الفئران المعرضة للنيكوتين ، وشكلت مجموعات الخلايا الالتهابية. كشف تلطيخ ماسون عن زيادة كبيرة في ترسب ألياف الكولاجين في الرئتين المعرضتين للنيكوتين جنبا إلى جنب مع السيليكا مقارنة بالرئتين في المجموعات الأخرى ، وكان هذا مدعوما بالقياس الكمي لتلطيخ ماسون (الشكل 2). تم تدمير الهيكل السنخي في الفئران المعرضة للسيليكا ، وزاد عدد البلاعم. ومع ذلك ، بعد التعرض للنيكوتين جنبا إلى جنب مع السيليكا ، كان هناك تسلل كبير للخلايا الالتهابية ، وظهرت عقيدات الخلايا الليفية. بالإضافة إلى ذلك ، الضامة المتراكمة ، وخاصة الضامة M2 ، موجودة في المجموعة ذات التعرض المزدوج. الضامة M2 ضرورية للمرحلة الليفية المتقدمة من السحار السيليسي.
بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت زيادة كبيرة في العامل المؤيد للتليف TGF-β1 عن طريق تلطيخ الكيمياء المناعية (IHC) في رئتي الفئران ذات التعرض المزدوج ، خاصة في الخلايا الالتهابية بالقرب من الأوعية اللمفاوية (الشكل 3). TGF-β1 الذي تفرزه الضامة يعزز EMT للخلايا الظهارية والتليف الرئوي12. بالمقارنة مع الفئران المعرضة للسيليكا وحدها ، كانت مستويات الفيمنتين مرتفعة بشكل ملحوظ في رئتي الفئران ذات التعرض المزدوج. أشار كل من تلطيخ IHC وكمية البروتين إلى EMT شديد في الفئران ذات التعرض المزدوج (الشكل 4). تشير الأدلة المجمعة إلى أن التعرض المزمن للسيليكا يعزز EMT بعد تنظيم TGF-β1 ، مما يؤدي إلى زيادة في الخلايا الليفية والتليف التدريجي. في الوقت نفسه ، تؤدي إضافة النيكوتين إلى تسريع عملية التليف الرئوي عن طريق تفاقم EMT ، مما يسمح لتليف الرئة بالظهور في وقت مبكر. تم تصميم هذا النموذج لاستكشاف تأثير النيكوتين على التليف الرئوي ، والذي هو نتيجة التعرض المزمن للسيليكا في البشر.
الشكل 1: تصميم نموذج تجريبي للتعرض المشترك للنيكوتين والسيليكا في الفئران. الحقن المستمر للنيكوتين لمدة 1-40 يوما وتقطير الأنف المستمر للسيليكا لمدة 5-19 يوما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يحفز النيكوتين تكوين كتل ليفية الأرومية في رئتي الفئران المعرضة للسيليكا. (أ) استخدم تلطيخ اعتلال الدماغ الكبدي لتصوير التغيرات المرضية في الرئتين. كان لدى الفئران ذات التعرض المزدوج تسلل شديد للخلايا الالتهابية والتليف. تشير الأسهم الخضراء إلى كتل الخلايا الالتهابية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) تم استخدام تلطيخ ماسون لإظهار ألياف الكولاجين في الرئتين. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. ج: القياس الكمي لألياف الكولاجين في الرئتين. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: زيادة الخلايا الموجبة CD206 وTGF-β1 في رئتي الفئران المعرضة للنيكوتين والسيليكا المزدوجة. (أ) تم استخدام تلطيخ IHC ل CD206 لمراقبة توزيع وتعبير البلاعم في الفئران ذات التعرض المزدوج. زادت البلاعم الإيجابية CD206 في رئتي الفئران بعد التعرض المشترك للنيكوتين والسيليكا. تمثل الأسهم القصيرة الخلايا الموجبة CD206. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) كان TGF-β1 ، وهو محفز للتليف ، مرتفعا في الفئران ذات التعرض المزدوج. تمثل الأسهم الطويلة الخلايا الموجبة TGF-β1. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C ، D) AOD من CD206 و TGF-β1. AOD = IOD (الكثافة البصرية المتكاملة) / المنطقة. يعكس AOD تركيز CD206 و TGF-β1 لكل وحدة مساحة. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001. الاختصارات: TGF-β1 = تحويل عامل النمو بيتا ؛ IHC = الكيمياء الهيستولوجية المناعية ؛ AOD = متوسط الكثافة البصرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تعزيز تليف الرئة بواسطة النيكوتين في الفئران المعرضة للسيليكا من خلال تفاقم EMT. (أ) لوحظ التعبير عن الفيمنتين في كل مجموعة من خلال تلطيخ IHC. تم التعبير عن Vimentin بقوة في رئتي الفئران المعرضة للنيكوتين والسيليكا. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (B) لطخة غربية من تعبير vimentin في كل مجموعة تعرض ، مع زيادة في vimentin في أنسجة الرئة للفئران مزدوجة التعرض. (ج) كانت قيمة AOD للفيمنتين أعلى بشكل ملحوظ في المجموعة مزدوجة التعرض مقارنة بالمجموعات الأخرى. (د) مستوى التعبير البروتيني النسبي للفيمنتين مقارنة ب GAPDH. كان تعبير vimentin في مجموعة التعرض المزدوج أعلى بكثير منه في مجموعات التعرض للنيكوتين أو السيليكا. * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001. الاختصارات: EMT = الانتقال الظهاري الوسيط. AOD = متوسط الكثافة البصرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد النموذج الحيواني ثنائي التعرض ضروريا للتحقيق في الدور والآليات المحتملة للتعرض المتزامن للنيكوتين وثاني أكسيد السيليكون البلوري. تم تحقيق هذا النموذج في هذا العمل من خلال الحقن تحت الجلد للنيكوتين والتنقيط الأنفي للسيليكا. لضمان حقن النيكوتين بنجاح ، يجب أن يصبح المشغل على دراية بإمساك الفئران ، لأن الإمساك بالجلد في الجزء الخلفي من الرقبة قد يكون مؤلما بالنسبة لهم. لذلك ، من المهم السماح للفئران بالتكيف تدريجيا مع الإمساك. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الخطوة الحاسمة في التعرض للسيليكا في الفئران هي التنقيط الأنفي. لزيادة نجاح الإجراء ومعدل بقاء الفئران ، من الضروري ممارسة التنقيط الأنفي مسبقا.
عند إجراء الحقن ، يجب إزالة المحقنة فوق رأس الماوس لتجنب صراع قوي عندما يرى الماوس المحقنة. يجب إمساك ذيل الفأر بإحكام باليد اليمنى ، بينما يجب استخدام اليد اليسرى لدفع الجلد لأعلى إلى هامش الأذن في الجزء الخلفي من الرقبة بعناية ورفق ولقرص الجلد هناك. بعد تحرير ذيل الفأر باليد اليمنى ، يجب تثبيت الذيل والأطراف الخلفية باستخدام الإبهام الأيسر وإصبع البنصر لمنع العض. باستخدام حقنة 1 مل في اليد اليمنى ، يجب إدخال الإبرة في الجلد الرخو فوق الرقبة بزاوية 30 درجة في اتجاه الرأس إلى الذيل. يجب سحب الإبرة قليلا بعد فقدان المقاومة ، ويجب إعطاء الحقن ببطء وبشكل متساو. في الأيام 5-19 ، تعرضت الفئران في المجموعة ذات التعرض المزدوج للنيكوتين والسيليكا. يوصى بحقن النيكوتين في الساعة 08:00 صباحا ، يليه التنقيط الأنفي لثاني أكسيد السيليكون في الساعة 14:00 مساء ، وحقنة أخرى من النيكوتين في الساعة 20:00 مساء. يجب إعطاء حقنتي النيكوتين بفاصل 12 ساعة لتجنب آثار الإمساك المتكرر على الفئران.
يمثل إجراء الحقن تحت الجلد والتنقيط الأنفي العديد من التحديات التقنية. بالنسبة للحقن تحت الجلد ، يجب إمساك الفئران بالقوة المناسبة. إذا تم ضغط الجلد الموجود في الجزء الخلفي من الرقبة بإحكام شديد ، حظر مجرى الهواء للفأر ، مما يؤدي بسرعة إلى الاختناق. للحصول على القوة المثلى ، يجب قرص الجلد في الجزء الخلفي من الرقبة حتى تبرز مقل العيون قليلا. في هذا الوقت ، يشعر الماوس بأقل ألم ويتنفس بسلاسة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب استخدام حقنة 1 مل يتم إفراغها من الهواء لسحب حقن النيكوتين من الأنبوب ، تليها 0.1-0.2 مل أخرى من الهواء. قبل الحقن ، يجب تحريك الفقاعات برفق. نظرا لصغر حجم الحقن ، قد يؤدي النيكوتين المتبقي عند طرف نهاية الإبرة إلى جرعة غير كافية. الأجزاء الرئيسية للحقن هي إدخال الإبرة بسرعة ، وحقن النيكوتين ببطء ، وإزالة الإبرة برفق. بالنسبة للتنقيط الأنفي ، في هذه الدراسة ، تعرض تجويف الأنف للفئران بالكامل تحت التخدير العميق ، يليه التقطير البطيء والموحد لتعليق ثاني أكسيد السيليكون. من المهم أيضا الضغط برفق على التجويف الصدري بعد التعرض للسيليكا لتجنب السعال أو الاختناق.
هذا النموذج له قيود معينة. لم يتم جمع جزيئات السيليكا 1-5 ميكرومتر المستخدمة في التجارب من البيئة وكانت جزيئات السيليكا النقية. في المقابل ، في البيئات المهنية الفعلية ، قد يتعرض العمال لمجموعة متنوعة من المواد الخطرة ، وليس فقط جزيئات السيليكا ، مثل خليط من الفحم وغبار السيليكا في مصنع للسيراميك أو منجم فحم. استخدمنا سيليكا تقطير الأنف لتحقيق جرعات منخفضة والتعرض المتعدد المتكرر لمحاكاة التعرض المزمن للعمال. في نموذج الفأر ثنائي التعرض ، على الرغم من أن النيكوتين لا يأتي من التعرض لدخان السجائر ، فإن النيكوتين المحقون يدخل مباشرة إلى مجرى الدم ، مما يسمح باستكشاف أكثر تركيزا لدور النيكوتين في عملية السحار السيليسي وتجنب آثار المكونات الأخرى لدخان السجائر.
عادة ما تستخدم الأبحاث العلمية حول السحار السيليكي نماذج الفئران أحادية العامل ، إما من خلال الاستنشاق أو التروية القصبية للسيليكا ، لتقييم دور السيليكا في تطور المرض. النهج البديل هو تقطير الأنف لثاني أكسيد السيليكون ، وهو بسيط وسهل ويسمح بإنشاء نماذج التعرض للسيليكا المتكررة والمزمنة13. يتسبب نموذج التنقيط الأنفي لثاني أكسيد السيليكون الراسخ في الحد الأدنى من الضرر للفئران ويمكن دمجه مع عوامل أخرى لإنشاء نموذج حيواني متعدد العوامل. بالإضافة إلى ذلك ، تشمل الطرق الرئيسية للتعرض للنيكوتين في الفئران النيكوتين في مياه الشرب ، وحقن النيكوتين تحت الجلد ، وتسريب النيكوتين عبر المضخات الصغيرة التناضحية ، والتعرض لدخانالتبغ 14. يسمح الحقن تحت الجلد المستخدم في نموذج التعرض المزدوج بتحديد جرعة وتوقيت النيكوتين بدقة ، مما يضمن إعطاء كل فأر نفس الجرعة.
باختصار ، يكرر النموذج الحيواني للنيكوتين مع التعرض للسيليكا نمط التعرض المزمن الواقعي ، ويمكن استخدام هذا النموذج لمزيد من التحقيقات حول تأثيرات النيكوتين على الالتهاب والتليف في تطور السحار السيليسي. بالإضافة إلى ذلك ، يعمل هذا النموذج كأساس لتشكيل نموذج حيواني مزدوج التعرض بجرعات وأطر زمنية متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج الابتكار التآزري الجامعي لمقاطعة آنهوي (GXXT-2021-077) وصندوق ابتكار الخريجين بجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
