استخدام النيكوتين في نموذج فأر معرض للسيليكا لتعزيز الانتقال الظهاري الرئوي اللحمة المتوسطة
Summary
تصف هذه الدراسة نموذج فأر لدراسة التأثير التآزري للنيكوتين على تطور التليف الرئوي في الفئران السحارية التجريبية. يحاكي نموذج الماوس ثنائي التعرض التطور المرضي في الرئة بعد التعرض المتزامن للنيكوتين والسيليكا. الطرق الموصوفة بسيطة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة.
Abstract
التدخين والتعرض للسيليكا شائعان بين العاملين المهنيين ، ومن المرجح أن تصيب السيليكا رئتي المدخنين أكثر من غير المدخنين. دور النيكوتين ، المكون الرئيسي للإدمان في السجائر ، في تطور السحار السيليسي غير واضح. كان نموذج الفأر المستخدم في هذه الدراسة بسيطا ويمكن التحكم فيه بسهولة ، وقد حاكي بشكل فعال آثار ابتلاع النيكوتين المزمن والتعرض المتكرر للسيليكا على تليف الرئة من خلال الانتقال الظهاري الوسيطة في البشر. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يساعد هذا النموذج في الدراسة المباشرة لتأثيرات النيكوتين على السحار السيليسي مع تجنب آثار المكونات الأخرى في دخان السجائر.
بعد التكيف البيئي ، تم حقن الفئران تحت الجلد بمحلول النيكوتين 0.25 ملغم / كغم في الجلد المترهل فوق الرقبة كل صباح ومساء على فترات 12 ساعة على مدى 40 يوما. بالإضافة إلى ذلك ، تم تعليق مسحوق السيليكا البلوري (1-5 ميكرومتر) في محلول ملحي عادي ، مخفف إلى معلق 20 مجم / مل ، وتم توزيعه بالتساوي باستخدام حمام مائي بالموجات فوق الصوتية. استنشقت الفئران المخدرة بالإيزوفلوران 50 ميكرولتر من تعليق غبار السيليكا هذا من خلال الأنف وتم إيقاظها عن طريق تدليك الصدر. تم إعطاء التعرض للسيليكا يوميا في الأيام 5-19.
تعرض نموذج الفأر مزدوج التعرض للنيكوتين ثم السيليكا ، والذي يتطابق مع تاريخ التعرض للعمال الذين تعرضوا لكلا العاملين الضارين. بالإضافة إلى ذلك ، عزز النيكوتين التليف الرئوي من خلال التحول الظهاري الوسيطة (EMT) في الفئران. يمكن استخدام هذا النموذج الحيواني لدراسة آثار عوامل متعددة على تطور السحار السيليسي.
Introduction
التعرض للسيليكا في العمال أمر لا مفر منه في بعض البيئات المهنية ، وبمجرد التعرض للسيليكا ، يتطور التدهور حتى بعد إزالته من البيئة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معظم هؤلاء العمال يدخنون ، وتحتوي السجائر التقليدية على آلاف المواد الكيميائية ، مع كون المكون الرئيسي للإدمان هو النيكوتين1. أصبحت السجائر الإلكترونية شائعة بشكل متزايد في الفئات العمرية الأصغرسنا 2 ؛ تعمل هذه السجائر الإلكترونية كنظام لتوصيل النيكوتين وتزيد من الوصول إلى النيكوتين ، وبالتالي تزيد من حساسية الرئة والالتهاب الرئوي3. يسرع دخان السجائر أيضا التليف الرئوي في الفئران المعرضة للبليوميسين4 ويزيد من السمية الرئوية والتليف في الفئران المعرضة للسيليكا 5,6. ومع ذلك ، لا يزال يتعين التحقيق فيما إذا كان النيكوتين يمكن أن يؤثر على عملية التليف الالتهابي والرئوي الناجم عن السيليكا.
نموذج الفأر السيليسي الذي أنشأه استنشاق جرعة عالية من السيليكا لمرة واحدة في القصبة الهوائية هو صدمة للفئران. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر بسرعة نموذج السحار السيليسي ، إلا أنها لا تتطابق مع واقع البيئة التي يتعرض فيها العمال بشكل متكرر للسيليكا. لذلك ، أنشأنا نموذجا للفأر المكشوف للسيليكا عن طريق إعطاء جرعة منخفضة من معلقات السيليكا بشكل متكرر عن طريق التنقيط الأنفي. هذه الجرعة يمكن أن تسبب التهاب وتليف في الفئران.
للتحايل على آثار مكونات السجائر الأخرى ، تم حقن نموذج الفأر هذا تحت الجلد بالنيكوتين في الجلد الرخو للرقبة لتحديد تأثير المكون الذي يسبب الإدمان ، النيكوتين ، على السحار السيليسي. من خلال إعطاء الحقن تحت الجلد ، يمكن تحقيق جرعات دقيقة ، مما يجعل من الممكن إنشاء نماذج التعرض للنيكوتين ومراقبة استجابات سمية الجرعة ، وكذلك الإدمان. تم تطوير نموذج إدمان النيكوتين في ذكور الفئران ، مع جرعة حقن النيكوتين من 0.2-0.4 ملغم / كغم 7,8. في هذا النموذج ، لتلبية احتياجات البحث عن المخدرات للفئران المدمنة ، تم إعطاء حقنتين تحت الجلد على فترات 12 ساعة. هذا النموذج لإدمان النيكوتين على الفئران مفيد لمحاكاة عادات التدخين البشرية والتعرض للسيليكا.
النماذج الحيوانية أحادية العامل لها قيود في دراسات الأمراض ، في حين أن الطريقة الموصوفة هنا تتضمن نموذجا للفأر ثنائي العامل للتعرض المشترك للنيكوتين والسيليكا. قبل التعرض للسيليكا ، تعرضت الفئران مسبقا للنيكوتين لتكرار التعرض للنيكوتين لدى الأشخاص الذين يدخنون. بعد ذلك ، حدث التعرض للسيليكا من اليوم 5 إلى اليوم 19 لتقليد التعرض للسيليكا في بيئة عمل للأفراد الذين لديهم تاريخ من التدخين.
من المعروف أن البلاعم السنخية تلعب دورا مهما في تنظيم التهاب الرئة والتليف. لا يمكن للبلاعم تكسير السيليكا عند استنشاقها للسيليكا ، مما يؤدي إلى استقطاب البلاعم أو موت الخلايا المبرمج9 وإطلاق السيتوكينات مثل عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β). الضامة M1 ، والتي يتم تحديدها من خلال وجود علامة السطح CD86 ، هي المحرضين الرئيسيين للاستجابة الالتهابية في السحار السيليكي ، في حين أن الضامة M2 ، التي تتميز CD206 ، هي المسؤولة عن المرحلة الليفية للحالة10. في الفئران ذات التعرض المزدوج ، تسبب النيكوتين في استقطاب الضامة نحو النمط الظاهري M2 في الرئتين المصابة بالسيليكا ، وبالتالي تعزيز التليف الرئوي. علاوة على ذلك ، TGF-β1 هو مفتاح تحريض التليف و EMT11. أدى التعبير المتزايد عن TGF-β1 إلى تسريع تطور تليف الرئة من خلال EMT. نجح هذا النموذج في تحليل آثار النيكوتين على السحار السيليسي وسلط الضوء على أهمية التوقف عن النيكوتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد النموذج الحيواني ثنائي التعرض ضروريا للتحقيق في الدور والآليات المحتملة للتعرض المتزامن للنيكوتين وثاني أكسيد السيليكون البلوري. تم تحقيق هذا النموذج في هذا العمل من خلال الحقن تحت الجلد للنيكوتين والتنقيط الأنفي للسيليكا. لضمان حقن النيكوتين بنجاح ، يجب أن يصبح المشغل على دراية بإ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج الابتكار التآزري الجامعي لمقاطعة آنهوي (GXXT-2021-077) وصندوق ابتكار الخريجين بجامعة آنهوي للعلوم والتكنولوجيا (2021CX2120).
Materials
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
