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फेफड़ों के उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण को बढ़ावा देने के लिए सिलिका-उजागर माउस मॉडल में निकोटीन का उपयोग करना

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65127
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 1,2,3,4
1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन प्रयोगात्मक सिलिकोसिस चूहों में फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस की प्रगति पर निकोटीन के सहक्रियात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक माउस मॉडल का वर्णन करता है। दोहरे-एक्सपोजर माउस मॉडल निकोटीन और सिलिका के एक साथ संपर्क के बाद फेफड़ों में पैथोलॉजिकल प्रगति का अनुकरण करता है। वर्णित विधियां सरल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं।

Abstract

धूम्रपान और सिलिका के संपर्क में व्यावसायिक श्रमिकों के बीच आम है, और सिलिका गैर-धूम्रपान करने वालों की तुलना में धूम्रपान करने वालों के फेफड़ों को घायल करने की अधिक संभावना है। सिलिकोसिस के विकास में सिगरेट में प्राथमिक नशे की लत घटक निकोटीन की भूमिका स्पष्ट नहीं है। इस अध्ययन में नियोजित माउस मॉडल सरल और आसानी से नियंत्रित था, और इसने मनुष्यों में उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण के माध्यम से फेफड़ों के फाइब्रोसिस पर क्रोनिक निकोटीन अंतर्ग्रहण और सिलिका के बार-बार संपर्क के प्रभावों को प्रभावी ढंग से अनुकरण किया। इसके अलावा, यह मॉडल सिगरेट के धुएं में अन्य घटकों के प्रभाव ों से बचते हुए सिलिकोसिस पर निकोटीन के प्रभावों के प्रत्यक्ष अध्ययन में मदद कर सकता है।

पर्यावरणीय अनुकूलन के बाद, चूहों को 40 दिनों में 12 घंटे के अंतराल पर हर सुबह और शाम गर्दन पर ढीली त्वचा में 0.25 मिलीग्राम / किलोग्राम निकोटीन घोल के साथ इंजेक्शन दिया गया था। इसके अतिरिक्त, क्रिस्टलीय सिलिका पाउडर (1-5 μm) को सामान्य खारा में निलंबित कर दिया गया था, 20 मिलीग्राम / एमएल के निलंबन तक पतला किया गया था, और अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान का उपयोग करके समान रूप से फैलाया गया था। आइसोफ्लुरेन-एनेस्थेटाइज्ड चूहों ने नाक के माध्यम से इस सिलिका डस्ट सस्पेंशन के 50 μL को सांस में लिया और छाती की मालिश के माध्यम से जगाया गया। सिलिका एक्सपोजर को 5-19 दिनों में दैनिक रूप से प्रशासित किया गया था।

डबल-एक्सपोज़्ड माउस मॉडल निकोटीन और फिर सिलिका के संपर्क में था, जो उन श्रमिकों के जोखिम इतिहास से मेल खाता है जो दोनों हानिकारक कारकों के संपर्क में हैं। इसके अलावा, निकोटीन ने चूहों में उपकला-मेसेनकाइमल परिवर्तन (ईएमटी) के माध्यम से फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस को बढ़ावा दिया। इस पशु मॉडल का उपयोग सिलिकोसिस के विकास पर कई कारकों के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

कुछ व्यावसायिक सेटिंग्स में श्रमिकों में सिलिका एक्सपोजर अपरिहार्य है, और एक बार सिलिका के संपर्क में आने के बाद, पर्यावरण से हटाने के बाद भी गिरावट बढ़ती है। इसके अलावा, इनमें से अधिकांश श्रमिक धूम्रपान करते हैं, और पारंपरिक सिगरेट में हजारों रसायन होते हैं, जिसमें प्रमुख नशे की लत घटक निकोटीन1 है। ई-सिगरेट युवा आयु समूहों में तेजी से लोकप्रिय हो रहे हैं2; ये ई-सिगरेट निकोटीन वितरण प्रणाली के रूप में कार्य करते हैं और निकोटीन पहुंच को बढ़ाते हैं, इस प्रकार फेफड़ों की संवेदनशीलता और निमोनिया3 को बढ़ाते हैं। सिगरेट का धुआं ब्लीमाइसिन-उजागर चूहों में फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस को भी तेज करता है 4 और सिलिका-उजागरचूहों में फुफ्फुसीय विषाक्तता और फाइब्रोसिस को बढ़ाता है 5,6. हालांकि, क्या निकोटीन सिलिका के कारण सूजन और फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है, इसकी जांच की जानी बाकी है।

श्वासनली में सिलिका की उच्च खुराक के एक बार साँस लेने से स्थापित सिलिकोसिस माउस मॉडल चूहों के लिए दर्दनाक है। यद्यपि यह विधि जल्दी से सिलिकोसिस मॉडल प्रदान करती है, यह एक ऐसे वातावरण की वास्तविकता से मेल नहीं खाती है जहां श्रमिकों को बार-बार सिलिका के संपर्क में लाया जाता है। इसलिए, हमने नाक ड्रिप के माध्यम से सिलिका निलंबन की कम खुराक देकर बार-बार सिलिका-उजागर माउस मॉडल स्थापित किया; यह खुराक चूहों में सूजन और फाइब्रोसिस का कारण बन सकती है।

अन्य सिगरेट घटकों के प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, इस माउस मॉडल को सिलिकोसिस पर नशे की लत घटक, निकोटीन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए गर्दन की ढीली त्वचा में निकोटीन के साथ इंजेक्शन दिया गया था। चमड़े के नीचे इंजेक्शन देने से, सटीक खुराक प्राप्त की जा सकती है, इस प्रकार निकोटीन एक्सपोजर मॉडल बनाना और खुराक-विषाक्तता प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ लत का निरीक्षण करना संभव हो जाता है। पुरुष चूहों में एक निकोटीन की लत मॉडल विकसित किया गया है, जिसमें 0.2-0.4 मिलीग्राम / किग्रा 7,8 की निकोटीन इंजेक्शन खुराक है। उस मॉडल में, आदी चूहों की दवा की मांग की जरूरतों को पूरा करने के लिए, 12 घंटे के अंतराल पर दो चमड़े के नीचे इंजेक्शन दिए गए थे। यह माउस निकोटीन की लत मॉडल मानव धूम्रपान की आदतों और सिलिका के संपर्क का अनुकरण करने के लिए उपयोगी है।

एकल-कारक पशु मॉडल में रोग अध्ययन में सीमाएं हैं, जबकि यहां वर्णित विधि में निकोटीन और सिलिका सह-जोखिम का दो-कारक माउस मॉडल शामिल है। सिलिका एक्सपोजर से पहले, चूहों को धूम्रपान करने वाले लोगों में निकोटीन एक्सपोजर को दोहराने के लिए निकोटीन के संपर्क में आने से पहले से अवगत कराया गया था। इसके बाद, धूम्रपान के इतिहास वाले व्यक्तियों के लिए काम के माहौल में सिलिका एक्सपोजर की नकल करने के लिए दिन 5 से दिन 19 तक सिलिका एक्सपोजर हुआ।

वायुकोशीय मैक्रोफेज फेफड़ों की सूजन और फाइब्रोसिस के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाने जाते हैं। मैक्रोफेज सिलिका के साँस लेने पर सिलिका को तोड़ नहीं सकते हैं, जिससे मैक्रोफेज ध्रुवीकरण या एपोप्टोसिस9 और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ -α) और ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा (टीजीएफ -β) जैसे साइटोकिन्स की रिहाई होती है। एम 1 मैक्रोफेज, जिन्हें सतह मार्कर सीडी 86 की उपस्थिति से पहचाना जाता है, सिलिकोसिस में भड़काऊ प्रतिक्रिया के प्राथमिक प्रेरक हैं, जबकि एम 2 मैक्रोफेज, जो सीडी 206 द्वारा चिह्नित हैं, स्थिति10 के फाइब्रोटिक चरण के लिए जिम्मेदार हैं। दोहरे-उजागर चूहों में, निकोटीन ने सिलिका-घायल फेफड़ों में एम 2 फेनोटाइप की ओर मैक्रोफेज के ध्रुवीकरण को प्रेरित किया, इस प्रकार फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस को बढ़ावा दिया। इसके अलावा, टीजीएफ-1 फाइब्रोसिस और ईएमटी11 के प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है; टीजीएफ-1 की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति ने ईएमटी के माध्यम से फेफड़ों के फाइब्रोसिस की प्रगति को तेज कर दिया। इस मॉडल ने सिलिकोसिस पर निकोटीन के प्रभावों का सफलतापूर्वक विश्लेषण किया और आगे निकोटीन समाप्ति के महत्व पर प्रकाश डाला।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान गाइड (एनआरसी का 8 वां संस्करण) द्वारा जारी दिशानिर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था और अनहुई यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी एनिमल एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. पशु तैयारी

  1. घर 32 पुरुष सी 57 / बीएल 6 चूहों को 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र के साथ एक प्रयोगशाला में 8 सप्ताह की आयु में। सुनिश्चित करें कि चूहों को भोजन और पानी तक मुफ्त पहुंच है।
  2. पर्यावरण के अनुकूल होने के 2 सप्ताह के बाद, जब 10 सप्ताह के चूहों का वजन 23-26 ग्राम होता है, तो कंप्यूटर द्वारा उत्पन्न यादृच्छिक संख्याओं का उपयोग बिना विभाजन के जानवरों को यादृच्छिक रूप से समूहीकृत करने के लिए किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप चूहों के चार समूह होते हैं: नियंत्रण समूह (कॉन), निकोटीन समूह (एनआईसी), सिलिका समूह (एसआईओ 2), और सिलिका समूह (निक + एसआईओ2) के साथ संयुक्त निकोटीन।

2. निकोटीन की तैयारी

नोट: निकोटीन घनत्व 1.01 ग्राम /

  1. निर्जल इथेनॉल में निकोटीन को घोलें, और 50 मिलीग्राम / एमएल के निकोटीन स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए 20x को पतला करें।
  2. निकोटीन स्टॉक घोल को बाँझ सामान्य लवण के साथ 1,000x पतला करें ताकि 0.05 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर एक कार्यशील समाधान बनाया जा सके।
    नोट: निकोटीन को प्रकाश से दूर रखें। स्टॉक समाधान को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. सिलिका की तैयारी

  1. 20 मिलीग्राम / एमएल सिलिका सस्पेंशन तैयार करने के लिए बाँझ क्रिस्टलीय सिलिका को नमकीन में निलंबित करें, और इसे 25 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक हिलाने वाले पानी के स्नान में घुमाएं।
  2. चूहों को नाक ड्रिप प्राप्त करने से पहले 3 मिनट के लिए एक भंवर ऑसिलेटर के साथ सिलिका निलंबन को हिलाएं। सिलिका सस्पेंशन को 200 μL पिपेट के साथ 2x-3x को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, और फिर नाक ड्रिप के लिए 50 μL लें।
    नोट: सिलिकॉन डाइऑक्साइड निलंबन को जल्द से जल्द नाक ड्रिप के माध्यम से मिश्रित और प्रशासित किया जाना चाहिए।

4. माउस कैप्चर और निकोटीन एक्सपोज़र

  1. चूहों का वजन करें, और एक्सपोजर से पहले रोजाना वजन रिकॉर्ड करें।
  2. 1-40 दिनों में, चमड़े के नीचे निक और निक + एसआईओ2 समूहों में चूहों में रोजाना दो बार (12 घंटे अलग) निकोटीन इंजेक्ट करें। 0.25 मिलीग्राम / किग्रा की निकोटीन खुराक का उपयोग करें; उदाहरण के लिए, सुनिश्चित करें कि 25 ग्राम वजन वाले माउस को निकोटीन का 6.25 μg प्राप्त होता है। इस माउस के लिए, इंजेक्शन की मात्रा निम्नानुसार होगी: 6.25/0.05 = 125 μL. इसके साथ ही, कॉन समूह में चूहों को लवण की समान मात्रा के साथ इंजेक्ट करें।
  3. प्रत्येक समूह के लिए आवश्यक 1 एमएल सिरिंज तैयार करें, और उन्हें निकोटीन या खारा के इंजेक्शन की मात्रा को कम करने के लिए उपयोग करें। निकोटीन लेने से पहले, पहले सिरिंज में 0.1-0.2 एमएल हवा खींचें, और फिर निकोटीन के 125 μL खींचें। निकोटीन के साथ सुई और सिरिंज के सामने के छोर को भरने के लिए सिरिंज को ध्यान से टैप करें। निकोटीन युक्त सिरिंज को प्रकाश से संरक्षित ट्रे में रखें।
    नोट: इंजेक्शन के समय, निकोटीन के पीछे 0.1-0.2 एमएल हवा स्थित होती है, यह गारंटी देती है कि सभी तरल सफलतापूर्वक माउस को प्रशासित किया जाता है।
  4. दाएं हाथ से माउस की पूंछ को पकड़ें, और जब जानवर आराम करता है, तो मध्यम दबाव लागू करते हुए गर्दन के पीछे की त्वचा को पूंछ से सिर तक कान के किनारे तक दबाने के लिए बाएं अंगूठे और फोरफिंगर का उपयोग करें। उसके बाद, दाहिने हाथ को छोड़ दें, और पूंछ और पिछले अंगों को चुटकी लेने के लिए बाएं छोटे अंगूठे और अनामिका उंगली का उपयोग करें, जिस बिंदु पर माउस बाएं हाथ से पूरी तरह से स्थिर हो जाएगा।
    नोट: माउस को उचित बल के साथ पकड़ो। अपर्याप्त शक्ति चूहों के लिए काटने में आसान बनाती है, जबकि अत्यधिक ताकत के परिणामस्वरूप चूहों का श्वासावरोध हो सकता है।
  5. इंजेक्शन लगाने के लिए दाहिने हाथ का उपयोग करते हुए, सिरिंज के साथ सिर से पूंछ की दिशा में चूहों के कान के किनारे के पास गर्दन के पीछे की त्वचा को पंचर करें, और एक समान दर पर निकोटीन के साथ इंजेक्ट करें। एक अर्धवृत्ताकार त्वचा उभार की तलाश करें जो एक सफल इंजेक्शन को इंगित करता है।
    नोट: जब सुई त्वचा में पंचर हो गई है, तो प्रतिरोध की भावना होगी; सुई डालने के बाद प्रतिरोध गायब हो जाता है। इस बिंदु पर, सुई को धीरे-धीरे और समान रूप से इंजेक्ट करने के लिए थोड़ा वापस लेने की आवश्यकता होती है।

5. विवो में सिलिका एक्सपोजर।

  1. 5-19 दिनों में, SiO 2 और Nic+ SiO2 समूहों में चूहों की नाक गुहा में सिलिकॉन डाइऑक्साइड निलंबन डालें। 3.6 एमएल / घंटा की खुराक पर संज्ञाहरण मशीन में 2% आइसोफ्लुरेन के साथ प्रत्येक माउस को तेजी से एनेस्थेटाइज करें। संज्ञाहरण के बाद, माउस को एक हाथ की हथेली पर रखें, और माउस की नाक गुहा को उजागर करें। 4-8 सेकंड के भीतर नाक गुहा में सिलिका निलंबन के 50 μL डालें।
  2. सिलिका सस्पेंशन को जल्द से जल्द फेफड़ों में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए, इंजेक्शन के बाद, माउस के दिल को 3-5 एस, 3x-5x प्रति सेकंड के लिए इंडेक्स उंगली से धीरे से दबाएं ताकि इसकी श्वसन दर को बढ़ावा मिल सके।
  3. माउस का श्वसन धीरे-धीरे एक समान हो जाने के बाद, माउस को 3 मिनट के लिए निरीक्षण करने के लिए पिंजरे में रखें।
  4. सिलिका निलंबन प्राप्त करने वाले सभी चूहों के लिए, चरण 1-3 दोहराएं। नियंत्रण समूह में, 5-19 दिनों में नाक गुहा में 50 μL बाँझ खारा डालें।

6. ताजा और निश्चित फेफड़ों के ऊतकों का अधिग्रहण

  1. 41 वें दिन, चूहों को उनके शरीर के वजन के अनुसार 0.1 एमएल / 20 ग्राम की खुराक पर इंट्रापरिटोनियल रूप से एनेस्थेटाइज करने के लिए 50 मिलीग्राम / किग्रा सोडियम पेंटोबार्बिटल का उपयोग करें। फोम टेस्ट प्लेट पर अंगों को ठीक करें, और फर को 75% अल्कोहल के साथ स्प्रे करें।
  2. ताजा फेफड़ों के ऊतकों को प्राप्त करने के लिए कार्डियक छिड़काव करें, छाती गुहा को उजागर करने के लिए पेट की मध्य रेखा को काट दें, और दाहिने दिल के शीर्ष पर एक छोटा सा उद्घाटन करें। फिर, बाएं दिल के शीर्ष से धीरे-धीरे और समान रूप से प्री-कूल्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 20 एमएल इंजेक्ट करें, जिससे रक्त दाएं दिल के शीर्ष पर बनाए गए उद्घाटन से बाहर निकल जाए। पूरे फेफड़ों के लोब को बाहर निकालें, इसे प्री-कूल्ड 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें, और लंबित प्रोटीन निष्कर्षण के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें।
  3. पूरे फेफड़ों को ठीक करने के लिए एक ही स्थान पर 20 मिलीलीटर प्री-कूल्ड पीबीएस के साथ अन्य चूहों को परफ्यूज करें, इसके बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 10 मिलीलीटर का उपयोग करें; प्रत्येक फेफड़े को 4% पीएफए के 30 एमएल में संरक्षित करें।
  4. 72 घंटे के बाद, पैराफिन में निश्चित फेफड़ों के ऊतकों को एम्बेड करें।
    1. 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक अल्ट्रासोनिक पानी के स्नान में तैयार फिक्सेटिव में फेफड़ों के ऊतकों को डुबोएं, इसके बाद 75% इथेनॉल, 95% इथेनॉल और निर्जल इथेनॉल में निर्जलीकरण प्रक्रिया 50 मिनट के लिए करें।
    2. प्रत्येक 50 मिनट के लिए जाइलीन के साथ 2x धो लें।
    3. ऊतक को पिघले हुए पैराफिन मोम में 2-3 घंटे के लिए 55-60 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि फेफड़ों के ऊतकों में जाइलीन धीरे-धीरे पैराफिन मोम द्वारा प्रतिस्थापित किया जाए।
    4. पैराफिन के साथ एम्बेडिंग फ्रेम में फेफड़ों के ऊतकों को ठीक करें, और मोम ब्लॉक के सख्त होने की प्रतीक्षा करें। मोम ब्लॉक सख्त होने के बाद, फेफड़े को 4-5 μm पर स्लाइस करने के लिए पैराफिन सेक्शनिंग मशीन का उपयोग करें।
  5. फेफड़ों के अनुभागों को 45 डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्राप्योर पानी में रखें। एक बार पैराफिन पिघल जाने के बाद, फेफड़े के खंड को एक अनुयायी माइक्रोस्कोप स्लाइड पर लोड करें।

7. हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एचई) धुंधला होना।

  1. स्लाइड्स को 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, और स्लाइड्स को जाइलीन में 2 x 30 मिनट के लिए डीवैक्स में रखें। इसके बाद, स्लाइड को निर्जल इथेनॉल, 95% इथेनॉल, 85% इथेनॉल, और 75% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए रखें। अंत में, उन्हें अल्ट्राप्योर पानी के साथ 3 x 5 मिनट के लिए धो लें।
  2. एक पिपेट बंदूक के साथ फेफड़ों के ऊतकों पर हेमटोक्सीलिन धुंधला घोल के 50 μL गिराएं, और 5 मिनट के लिए दाग दें; फिर, स्लाइस को 5 मिनट के लिए बहते पानी से धो लें।
  3. अनुभाग पर इथेनॉल में 2% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के 50 μL जोड़ें, और 30 सेकंड के लिए आसुत पानी से कुल्ला करें। फिर, 1 मिनट के लिए दाग लगाने के लिए फेफड़ों के ऊतकों पर 50 μL ईओसिन धुंधला घोल जोड़ें।
  4. पैराफिन अनुभागों को निर्जलित, पारदर्शी और सील करें।
    1. एक संयुक्त प्लास्टिक रंगाई टैंक में 75% इथेनॉल, 85% इथेनॉल, 95% इथेनॉल, निर्जल इथेनॉल और जाइलीन के 100-150 एमएल जोड़ें। स्लाइड्स को निर्जलित करने के लिए 75%, 85%, 95%, और निर्जल इथेनॉल में 5 मिनट के लिए रखें।
    2. फिर, स्लाइड्स को पारदर्शी बनाने के लिए 5 मिनट के लिए जाइलीन में रखें।
    3. अंत में, फेफड़े के अनुभाग पर तटस्थ गम के 20 μL गिराएं, और इसे सील करने के लिए स्लाइड पर एक कवरस्लिप रखें।
      नोट: उपरोक्त चरण कमरे के तापमान पर किए जाते हैं।

8. मैसन धुंधला

  1. चरण 7.1 में वर्णित पैराफिन अनुभागों को डीवैक्स, हाइड्रेट और धोएं।
  2. 7 मिनट के लिए कॉन्फ़िगर किए गए वीगर के हेमटोक्सिलिन धुंधला घोल के 50 μL के साथ खंडों को दाग दें, इसके बाद 10 सेकंड के लिए 50 μL अम्लीय इथेनॉल फ्रैक्शनेशन घोल लें, और नाभिक को नीला करने के लिए बहते पानी से धो लें।
  3. 4 मिनट के लिए मैसन ट्राइक्रोम समाधान के 50 μL के साथ अनुभागों को दाग दें, और पानी से धो लें।
  4. 1 मिनट के लिए आसुत पानी के साथ अनुभागों को धो लें, और फिर 7 मिनट के लिए लिचुन लाल एसिड मैजेंटा के साथ दाग दें।
  5. 1-2 मिनट के लिए एक कमजोर एसिड वर्किंग घोल (30% हाइड्रोक्लोरिक एसिड), 1-2 मिनट के लिए फॉस्फोमोलिब्डिक एसिड घोल और 1-2 मिनट के लिए कमजोर एसिड वर्किंग घोल के साथ अनुभागों को धो लें।
  6. 2 मिनट के लिए एनिलिन ब्लू स्टेनिंग घोल में अनुभागों को दाग दें, और फिर 1 मिनट के लिए एक कमजोर एसिड वर्किंग घोल से धो लें।
  7. 95% इथेनॉल के साथ खंडों को निर्जलित करें, इसके बाद 1 सेकंड के लिए निर्जल इथेनॉल, 1 सेकंड के लिए जाइलीन के साथ पारदर्शी, और अंत में चरण 7.4 में वर्णित तटस्थ राल के साथ सील करें।

9. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. स्लाइस को 6 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें। चरण 7.1 में वर्णित पैराफिन अनुभागों को डीवैक्स, हाइड्रेट और धोएं।
  2. एंटीजन पुनर्प्राप्ति: स्लाइस को गर्मी प्रतिरोधी प्लास्टिक स्लाइसिंग बॉक्स में रखें जिसमें स्लाइस को डुबोने के लिए पर्याप्त साइट्रेट एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान हो, और 20-30 मिनट तक उबालें।
  3. कमरे के तापमान पर ठंडा करें, अनुभागों को हटा दें, और विआयनीकृत पानी से कुल्ला करें। इसके बाद, 0.5% ट्वीन -20 (पीबीएसटी) युक्त पीबीएस में 2 x 5 मिनट के लिए भिगोएं।
  4. हाइड्रोफोबिक सर्कल बनाने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन के साथ स्लाइड पर फेफड़े के खंड के पास एक लूप खींचें।
  5. स्लाइस में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान (3% एच 2 ओ2) ड्रॉपवाइज के 50 μL जोड़ें, और अंतर्जात पेरोक्सीडेज की निष्क्रियता के लिए प्रकाश से सुरक्षित कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. स्लाइस को 3 x 5 मिनट के लिए पीबीएसटी में भिगोदें।
  7. स्लाइस में 5% गोजातीय सीरम प्रोटीन (बीएसए) -पीबीएसटी ड्रॉपवाइज के 50 μL जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए ब्लॉक करें।
  8. ब्लॉकिंग समाधान को छोड़ दें, पतला प्राथमिक एंटीबॉडी सीडी 206 (कमजोर पड़ने: 1: 1,500), टीजीएफ-3 1 (तनुकरण: 1: 200), और विमेंटिन (कमजोर पड़ने: 1: 2,000) स्लाइस में 50 μL जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस काम में, सभी एंटीबॉडी 5% बीएसए में पतला हो गए थे।
  9. अगले दिन, स्लाइस को कमरे के तापमान (40 मिनट) पर वापस करें। चरण 9.6 में वर्णित स्लाइस धो लें।
  10. 5% बीएसए में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें। हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी (कमजोर पड़ने: 1: 500) ड्रॉपवाइज के 50 μL जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। चरण 9.6 में वर्णित स्लाइस धो लें।
  11. फेफड़ों के ऊतकों पर एंजाइम-लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी के अनुरूप 3,3'-डायमिनोबेंज़िडीन (डीएबी) समाधान के 50 μL गिराएं, और एक काले इम्यूनोहिस्टोकेमिकल वेट बॉक्स में 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। माइक्रोस्कोप के नीचे निरीक्षण करें जब तक कि रंग एक मजबूत भूरे रंग में विकसित न हो जाए। प्रतिक्रिया को समाप्त करने के लिए आसुत पानी के साथ स्लाइस को धोएं।
    नोट: भूरे रंग का धुंधलापन सकारात्मक धुंधलापन माना जाता है।
  12. 30 सेकंड के लिए 50 μL हेमटोक्सीलिन दाग के साथ दाग लें, और बहते पानी से धो लें। इसके बाद, स्लाइस को 75%, 85%, 95%, और निर्जल इथेनॉल में 3 मिनट के लिए भिगोएं और फिर 2 x 10 मिनट के लिए जाइलीन में भिगोएं। चरण 7.4 में वर्णित स्लाइड्स को सील करें।

10. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. फेफड़ों के ऊतकों को फ्रीजर से बाहर निकालें, और इसे तौलें। इसके बाद, प्रति 20 मिलीग्राम फेफड़ों के ऊतकों में पीएमएसएफ युक्त आरआईपीए लाइसिस बफर के 150 μL जोड़ें। माउस फेफड़ों को 3-5 मिनट के लिए बर्फ पर एक हैंडहेल्ड होमोजिनाइज़र का उपयोग करके लाइज़ करें, फेफड़ों के ऊतकों के पर्याप्त लाइसिस की अनुमति देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए धीरे से हिलाएं, 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और 15 मिनट के लिए 14,800 × ग्राम , और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें।
    नोट: आरआईपीए लाइसिस बफर का उपयोग करने से कुछ मिनट पहले 100 एमएम फेनिलमेथेनसल्फोनिलफ्लोराइड (पीएमएसएफ) जोड़ें। PMSF की अंतिम सांद्रता 1 mM है (उदाहरण के लिए, PMSF का 10 μL + RIPA का 990 μL)।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करके नमूने की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए बीसीए प्रोटीन एकाग्रता किट का उपयोग करें। निर्धारण के बाद, एक आधार के रूप में प्रोटीन लाइसेट की सबसे छोटी एकाग्रता का उपयोग करके, समान द्रव्यमान और मात्रा प्राप्त करने के लिए आरआईपीए के साथ प्रोटीन लाइसेट के एक ही बैच को सबसे छोटी एकाग्रता तक पतला करें।
    नोट: फेफड़ों के ऊतक लोडिंग की कुल मात्रा 30 μg है।
  3. प्रोटीन लाइसेट के 160 μL में 5x लोडिंग बफर के 40 μL जोड़ें, और इसे 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
  4. पश्चिमी ब्लोटिंग वैद्युतकणसंचलन प्रणाली में तैयार 10% सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) जेल को इकट्ठा करें, एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन बफर जोड़ें, धीरे से वैद्युतकणसंचलन कंघी को बाहर निकालें, और धीरे-धीरे और समान रूप से प्रति अच्छी तरह से प्रोटीन नमूने के 20 μL जोड़ें। बिजली चालू करें, और 30 मिनट के लिए 80 वी पर वैद्युतकणसंचलन शुरू करें। प्रोटीन निचली जेल परत तक पहुंचने के बाद, 100 वी पर स्विच करें, और 60-70 मिनट के लिए वैद्युतकणसंचलन जारी रखें।
    नोट: वैद्युतकणसंचलन को ताजा वैद्युतकणसंचलन बफर की आवश्यकता होती है।
  5. गीले हस्तांतरण द्वारा प्रोटीन को पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें। पहले से मेथनॉल के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को सक्रिय करें (5-30 एस)। वैद्युतकणसंचलन जेल प्लेट को बाहर निकालें, इसे ध्यान से खोलें, विभाजक जेल को गीले ट्रांसफर बफर में रखें, इलेक्ट्रिक ट्रांसफर सैंडविच बनाएं, और गीले ट्रांसफर सिस्टम को इकट्ठा करें। वैद्युतकणसंचलन टैंक को स्थानांतरण बफर के साथ भरें, और 90 मिनट के लिए 400 एमए पर स्थानांतरित करें।
    नोट: गीले हस्तांतरण के दौरान उच्च तापमान के प्रभाव से बचने के लिए स्थानांतरण बफर को अग्रिम में ठंडा किया जाता है।
  6. पीवीडीएफ झिल्ली को 3 x 5 मिनट के लिए 0.5% ट्वीन -20 (टीबीएसटी) के साथ ट्रिस-बफर्ड सेलाइन से धोएं। टीबीएसटी में पतला 5% स्किम दूध के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध करें, और 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर शेकर पर इनक्यूबेट करें; फिर, 2 मिनट के लिए टीबीएसटी से धो लें। धोने के बाद, झिल्ली को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी विमेंटिन (1: 5,000) और जीएपीडीएच (1: 10,000) के साथ 5% बीएसए में पतला करें।
  7. झिल्ली को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें, और 5 x 5 मिनट के लिए टीबीएसटी से धो लें। धोने के बाद, झिल्ली को द्वितीयक एंटीबॉडी (1: 10,000) के साथ इनक्यूबेट करें जो कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए 5% स्किम दूध में पतला होता है।
  8. झिल्ली, प्रोटीन-साइड को ऊपर रखें, तैयार ईसीएल वर्किंग सॉल्यूशन को छोड़ दें, 1-2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और जेल इमेजर के साथ परिणामों का निरीक्षण करें। प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरों का मूल्यांकन करने के लिए जेल इमेजर में सॉफ़्टवेयर द्वारा मापा गया ग्रेस्केल मानों का उपयोग करें।
    नोट: यहां, जीएपीडीएच ने एक आंतरिक संदर्भ के रूप में कार्य किया।

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Representative Results

चूहों में सिलिकोसिस की प्रगति में निकोटीन की संभावित भूमिका की जांच करने के लिए सिलिका एक्सपोजर के साथ संयुक्त निकोटीन का अध्ययन करने के लिए एक माउस मॉडल स्थापित किया गया था। चित्रा 1 एक दोहरे एक्सपोजर माउस मॉडल का उपयोग करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया को दर्शाता है, जिसने सिलिका निलंबन के नाक इंजेक्शन के साथ एक निकोटीन इंजेक्शन को जोड़ा। प्रत्येक समूह में चूहों के पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को एचई स्टेनिंग का उपयोग करके देखा गया था। सिलिका के साथ संयुक्त निकोटीन के संपर्क में आने वाले चूहों में अकेले निकोटीन या सिलिका के संपर्क में आने वालों की तुलना में फेफड़ों की क्षति काफी अधिक थी। निकोटीन-उजागर चूहों के फेफड़ों में लसीका वाहिकाओं के पास लिम्फोसाइट्स बढ़ गए, जिससे भड़काऊ सेल क्लस्टर बन गए। मैसन स्टेनिंग ने अन्य समूहों में फेफड़ों की तुलना में सिलिका के साथ संयुक्त निकोटीन के संपर्क में आने वाले फेफड़ों में कोलेजन फाइबर जमाव में उल्लेखनीय वृद्धि का खुलासा किया, और यह मैसन स्टेनिंग परिमाणीकरण (चित्रा 2) द्वारा समर्थित था। सिलिका-उजागर चूहों में वायुकोशीय संरचना नष्ट हो गई थी, और मैक्रोफेज की संख्या में वृद्धि हुई थी। हालांकि, सिलिका के साथ संयुक्त निकोटीन के संपर्क में आने के बाद, महत्वपूर्ण भड़काऊ सेल घुसपैठ हुई, और फाइब्रोब्लास्ट नोड्यूल दिखाई दिए। इसके अलावा, संचित मैक्रोफेज, विशेष रूप से एम 2 मैक्रोफेज, डबल-उजागर समूह में मौजूद हैं। एम 2 मैक्रोफेज सिलिकोसिस के उन्नत फाइब्रोटिक चरण के लिए आवश्यक हैं।

इसके अतिरिक्त, प्रो-फाइब्रोटिक कारक टीजीएफ-1 में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दोहरे-उजागर चूहों के फेफड़ों में इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) धुंधला होने से देखी गई थी, विशेष रूप से लसीका वाहिकाओं के पास भड़काऊ कोशिकाओं में (चित्रा 3)। मैक्रोफेज द्वारा स्रावित टीजीएफ-1 उपकला कोशिकाओं और फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस12 के ईएमटी को बढ़ावा देता है। अकेले सिलिका के संपर्क में आने वाले चूहों की तुलना में, दोहरे जोखिम वाले चूहों के फेफड़ों में विमेंटिन का स्तर काफी ऊंचा था। आईएचसी धुंधला पन और प्रोटीन परिमाणीकरण दोनों ने दोहरे उजागर चूहों में गंभीर ईएमटी का संकेत दिया (चित्रा 4)। संयुक्त सबूत बताते हैं कि क्रोनिक सिलिका एक्सपोजर टीजीएफ-1 के अपरेगुलेशन के बाद ईएमटी को बढ़ावा देता है, जिससे फाइब्रोब्लास्ट और प्रगतिशील फाइब्रोसिस में वृद्धि होती है। इसी समय, निकोटीन के अलावा ईएमटी को बढ़ाकर फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस की प्रक्रिया को तेज करता है, जिससे फेफड़ों के फाइब्रोसिस को पहले प्रकट होने की अनुमति मिलती है। यह मॉडल फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस पर निकोटीन के प्रभाव का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो मनुष्यों में पुरानी सिलिका जोखिम का परिणाम है।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों में निकोटीन और सिलिका के संयुक्त जोखिम के एक प्रयोगात्मक मॉडल का डिजाइन। 1-40 दिनों के लिए निकोटीन का निरंतर इंजेक्शन और 5-19 दिनों के लिए सिलिका का निरंतर नाक इंजेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: निकोटीन सिलिका-उजागर चूहों के फेफड़ों में फाइब्रोब्लास्टिक द्रव्यमान के गठन को बढ़ावा देता है। (ए) फेफड़ों में पैथोलॉजिकल परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए एचई धुंधला का उपयोग किया गया था। दोहरे उजागर चूहों में गंभीर भड़काऊ कोशिका घुसपैठ और फाइब्रोसिस था। हरे तीर भड़काऊ कोशिका द्रव्यमान का संकेत देते हैं। स्केल बार = 50 μm. (B) फेफड़ों में कोलेजन फाइबर दिखाने के लिए मैसन स्टेनिंग का उपयोग किया गया था। स्केल बार = 50 μm. (C) फेफड़ों में कोलेजन फाइबर का परिमाणीकरण। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, ***पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: निकोटीन और सिलिका दोहरे-उजागर चूहों के फेफड़ों में सीडी 206-पॉजिटिव कोशिकाओं और टीजीएफ-1 में वृद्धि। (ए) सीडी 206 के आईएचसी धुंधलापन का उपयोग दोहरे-उजागर चूहों में मैक्रोफेज के वितरण और अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए किया गया था। संयुक्त निकोटीन और सिलिका एक्सपोजर के बाद चूहों के फेफड़ों में सीडी 206-पॉजिटिव मैक्रोफेज बढ़ गए। छोटे तीर सीडी 206-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 50 μm. (B) फाइब्रोसिस के प्रमोटर TGF-1 को दोहरे-उजागर चूहों में बढ़ाया गया था। लंबे तीर टीजीएफ-1-पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 50 μm. (C, D) CD206 और TGF-1 का AOD. एओडी = आईओडी (एकीकृत ऑप्टिकल घनत्व)/क्षेत्र। एओडी प्रति इकाई क्षेत्र में सीडी 206 और टीजीएफ-1 की एकाग्रता को दर्शाता है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, ***पी < 0.001, ****पी < 0.0001। संक्षेप: टीजीएफ-1 = विकास कारक-बीटा को बदलना; आईएचसी = इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री; एओडी = औसत ऑप्टिकल घनत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईएमटी की वृद्धि के माध्यम से सिलिका-उजागर चूहों में निकोटीन द्वारा फेफड़ों के फाइब्रोसिस को बढ़ावा देना। निकोटीन और सिलिका के संपर्क में आने वाले चूहों के फेफड़ों में विमेंटिन को दृढ़ता से व्यक्त किया गया था। स्केल बार = 50 μm.(B) प्रत्येक एक्सपोजर समूह में विमेंटिन अभिव्यक्ति का पश्चिमी धब्बा, डबल-उजागर चूहों के फेफड़ों के ऊतकों में विमेंटिन में वृद्धि के साथ। (ग) अन्य समूहों की तुलना में डबल-एक्सपोज़्ड समूह में विमेंटिन का एओडी मूल्य काफी अधिक था। (डी) जीएपीडीएच की तुलना में विमेंटिन का सापेक्ष प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर। डबल-एक्सपोज़र समूह में विमेंटिन अभिव्यक्ति निकोटीन- या सिलिका-एक्सपोज़र समूहों की तुलना में काफी अधिक थी। *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. संक्षेप: ईएमटी = उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण; एओडी = औसत ऑप्टिकल घनत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

निकोटीन और क्रिस्टलीय सिलिकॉन डाइऑक्साइड के समवर्ती जोखिम की भूमिका और संभावित तंत्र की जांच के लिए एक दोहरे जोखिम पशु मॉडल की आवश्यकता है। निकोटीन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन और सिलिका के नाक ड्रिप के माध्यम से इस काम में यह मॉडल हासिल किया गया था। एक सफल निकोटीन इंजेक्शन सुनिश्चित करने के लिए, ऑपरेटर को चूहों को पकड़ने से परिचित होना होगा, क्योंकि गर्दन के पीछे की त्वचा को पकड़ना उनके लिए दर्दनाक हो सकता है। इसलिए, चूहों को धीरे-धीरे समझने के लिए अनुकूलित करने की अनुमति देना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, चूहों में सिलिका एक्सपोजर में एक महत्वपूर्ण कदम नाक ड्रिप है। प्रक्रिया की सफलता और चूहों की जीवित रहने की दर को बढ़ाने के लिए, पहले से नाक ड्रिप का अभ्यास करना आवश्यक है।

इंजेक्शन करते समय, सिरिंज को माउस के सिर पर स्किम्ड किया जाना चाहिए ताकि जब माउस सिरिंज देखता है तो एक मजबूत संघर्ष से बचा जा सके। माउस की पूंछ को दाहिने हाथ से मजबूती से पकड़ा जाना चाहिए, जबकि बाएं हाथ का उपयोग गर्दन के पीछे त्वचा को कान के मार्जिन तक ध्यान से और धीरे से धक्का देने और वहां की त्वचा को चुटकी लेने के लिए किया जाना चाहिए। दाएं हाथ से माउस की पूंछ को छोड़ने के बाद, काटने को रोकने के लिए बाएं अंगूठे और अंगूठी की उंगली का उपयोग करके पूंछ और पिछले अंगों को स्थिर किया जाना चाहिए। दाहिने हाथ में 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करके, सुई को गर्दन के ऊपर ढीली त्वचा में सिर-से-पूंछ की दिशा में 30 डिग्री कोण पर डाला जाना चाहिए। प्रतिरोध खो जाने के बाद सुई को थोड़ा वापस ले लिया जाना चाहिए, और इंजेक्शन को धीरे-धीरे और समान रूप से प्रशासित किया जाना चाहिए। 5-19 दिनों में, दोहरे-उजागर समूह में चूहों को निकोटीन और सिलिका के संपर्क में लाया गया था। यह अनुशंसा की जाती है कि निकोटीन को 08:00 बजे इंजेक्ट किया जाए, इसके बाद 14:00 बजे सिलिकॉन डाइऑक्साइड की नाक ड्रिप और 20:00 बजे निकोटीन का एक और इंजेक्शन दिया जाए। चूहों पर बार-बार पकड़ने के प्रभाव से बचने के लिए दो निकोटीन इंजेक्शन 12 घंटे के अंतर पर दिए जाने चाहिए।

चमड़े के नीचे इंजेक्शन और नाक ड्रिप प्रदर्शन कई तकनीकी चुनौतियां प्रस्तुत करता है। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए, चूहों को उचित बल के साथ समझा जाना चाहिए। यदि गर्दन के पीछे की त्वचा को बहुत कसकर दबाया जाता है, तो माउस का वायुमार्ग अवरुद्ध हो जाएगा, जिससे जल्दी से दम घुट जाएगा। इष्टतम शक्ति के लिए, गर्दन के पीछे की त्वचा को तब तक दबाया जाना चाहिए जब तक कि नेत्रगोलक थोड़ा बाहर न निकल जाएं। इस समय, माउस सबसे कम दर्द महसूस करता है और आसानी से सांस लेता है। इसके अलावा, एक 1 एमएल सिरिंज जो हवा से खाली हो जाती है, का उपयोग ट्यूब से निकोटीन इंजेक्शन खींचने के लिए किया जाना चाहिए, इसके बाद हवा का 0.1-0.2 एमएल होना चाहिए। इंजेक्शन लगाने से पहले, बुलबुले को धीरे से बाहर निकाला जाना चाहिए। इंजेक्शन की छोटी मात्रा के कारण, सुई के अंत की नोक पर छोड़े गए निकोटीन से अपर्याप्त खुराक हो सकती है। इंजेक्शन के प्रमुख भाग सुई को जल्दी से डाल रहे हैं, निकोटीन को धीरे-धीरे इंजेक्ट कर रहे हैं, और सुई को धीरे से हटा रहे हैं। नाक ड्रिप के लिए, इस अध्ययन में, चूहों की नाक गुहा को गहरी संज्ञाहरण के तहत पूरी तरह से उजागर किया गया था, इसके बाद सिलिकॉन डाइऑक्साइड निलंबन की धीमी और समान उत्तेजना थी। खांसी या घुटन से बचने के लिए सिलिका एक्सपोजर के बाद वक्ष गुहा को धीरे से दबाना भी महत्वपूर्ण है।

इस मॉडल की कुछ सीमाएं हैं। प्रयोगों में उपयोग किए गए 1-5 μm सिलिका कण पर्यावरण से एकत्र नहीं किए गए थे और शुद्ध सिलिका कण थे। इसके विपरीत, वास्तविक व्यावसायिक सेटिंग्स में, श्रमिकों को विभिन्न प्रकार की खतरनाक सामग्रियों के संपर्क में लाया जा सकता है, न कि केवल सिलिका कण, जैसे कि सिरेमिक कारखाने या कोयले की खान में कोयले और सिलिका धूल का मिश्रण। हमने कम खुराक प्राप्त करने के लिए नाक के इंजेक्शन सिलिका का उपयोग किया और श्रमिकों के पुराने जोखिम को अनुकरण करने के लिए कई एक्सपोज़र दोहराए। दोहरे जोखिम माउस मॉडल में, हालांकि निकोटीन सिगरेट के धुएं के संपर्क से नहीं आता है, इंजेक्शन निकोटीन सीधे रक्तप्रवाह में प्रवेश करता है, जिससे सिलिकोसिस प्रक्रिया में निकोटीन की भूमिका की अधिक केंद्रित खोज और सिगरेट के धुएं के अन्य घटकों के प्रभावों से बचने की अनुमति मिलती है।

सिलिकोसिस पर वैज्ञानिक अनुसंधान ने आमतौर पर बीमारी के विकास में सिलिका की भूमिका का आकलन करने के लिए सिलिका के साँस लेना या ब्रोन्कियल छिड़काव के माध्यम से एकल-कारक माउस मॉडल का उपयोग किया है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सिलिकॉन डाइऑक्साइड का नाक का इंजेक्शन है, जो सरल और आसान है और बार-बार और पुरानी सिलिका एक्सपोजर मॉडल13 की स्थापना के लिए अनुमति देता है। अच्छी तरह से स्थापित सिलिकॉन डाइऑक्साइड नाक ड्रिप मॉडल चूहों को न्यूनतम नुकसान पहुंचाता है और इसे बहु-कारक-उजागर पशु मॉडल बनाने के लिए अन्य कारकों के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चूहों में निकोटीन एक्सपोजर के मुख्य तरीकों में पीने के पानी में निकोटीन, निकोटीन का चमड़े के नीचे इंजेक्शन, आसमाटिक मिनीपंप के माध्यम से निकोटीन जलसेक और तंबाकू के धुएं का जोखिमशामिल है। दोहरे जोखिम मॉडल में उपयोग किए जाने वाले चमड़े के नीचे इंजेक्शन निकोटीन की खुराक और समय को ठीक से सेट करने की अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक माउस को एक ही खुराक दी जाती है।

संक्षेप में, सिलिका एक्सपोजर के साथ संयोजन में निकोटीन का पशु मॉडल एक यथार्थवादी क्रोनिक एक्सपोज़र पैटर्न को दोहराता है, और इस मॉडल का उपयोग सिलिकोसिस के विकास में सूजन और फाइब्रोसिस पर निकोटीन के प्रभावों पर आगे की जांच के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह मॉडल कई खुराक और समय सीमा के साथ दोहरे जोखिम वाले पशु मॉडल बनाने के लिए एक नींव के रूप में कार्य करता है।

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Disclosures

सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को अनहुई प्रांत के यूनिवर्सिटी सिनर्जी इनोवेशन प्रोग्राम (जीएक्सएक्सटी-2021-077) और अनहुई यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी ग्रेजुएट इनोवेशन फंड (2021सीएक्स 2120) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% formalin neutral fixative Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.
alcohol disinfectant Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.
BSA, Fraction V Beyotime Biotechnology ST023-200g
CD206 Monoclonal antibody Proteintech 60143-1-IG
Citrate Antigen Retrieval Solution biosharp life science BL619A
dimethyl benzene West Asia Chemical Technology (Shandong) Co
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime Biotechnology P0009
GAPDH Polyclonal antibody Proteintech 10494-1-AP
Hematoxylin and Eosin (H&E) Beyotime Biotechnology C0105S
HRP substrate Millipore Corporation P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Proteintech SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Proteintech SA00001-2
ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate Vector Laboratories SK-4103-100
Masson's Trichrome Stain Kit Solarbio G1340
Methanol Macklin
Nicotine Sigma N-3876
phosphate buffered saline (PBS)  Biosharp BL601A
Physiological saline  The First People's Hospital of Huainan City
PMSF Beyotime Biotechnological ST505
Positive fluorescence microscope OlympusCorporation BX53+DP74
Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder Beyotime Biotechnology P0071
PVDF membranes Millipore 3010040001
RIPA Lysis Buffer Beyotime Biotechnology P0013B
SDS-PAGE gel preparation kit Beyotime Biotechnology P0012A
Silicon dioxide Sigma #BCBV6865
TGF-β Bioss bs-0086R
Vimentin Polyclonal antibody Proteintech 10366-1-AP
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
0.5 mL Tube Biosharp BS-05-M
Oscillatory thermostatic metal bath Abson
Paraffin Embedding Machine Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. PBM-A
Paraffin Slicer Jinhua Kratai Instruments Co.
Pipettes Eppendorf
Polarized light microscope Olympus BX51
Precision Balance Acculab ALC-110.4
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system RSJ RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker Scilogex
Small animal anesthesia machine Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. ZL-04A
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1011
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1212
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1313
Vortex Mixers  VWR
Name of Material/ Equipment
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0

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References

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निकोटीन सिलिका फेफड़े के उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण सिलिकोसिस माउस मॉडल क्रोनिक निकोटीन अंतर्ग्रहण सिलिका के बार-बार संपर्क फेफड़े की फाइब्रोसिस सिगरेट का धुआं चमड़े के नीचे इंजेक्शन क्रिस्टलीय सिलिका पाउडर साँस लेना जोखिम डबल-उजागर माउस मॉडल
फेफड़ों के उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण को बढ़ावा देने के लिए सिलिका-उजागर माउस मॉडल में निकोटीन का उपयोग करना
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