Summary
Cette étude décrit un modèle murin pour étudier l’effet synergique de la nicotine sur la progression de la fibrose pulmonaire chez des souris expérimentales de silicose. Le modèle murin à double exposition simule la progression pathologique dans le poumon après une exposition simultanée à la nicotine et à la silice. Les méthodes décrites sont simples et hautement reproductibles.
Abstract
Le tabagisme et l’exposition à la silice sont fréquents chez les travailleurs professionnels, et la silice est plus susceptible de blesser les poumons des fumeurs que des non-fumeurs. Le rôle de la nicotine, le principal ingrédient addictif des cigarettes, dans le développement de la silicose n’est pas clair. Le modèle murin utilisé dans cette étude était simple et facile à contrôler, et il simulait efficacement les effets de l’ingestion chronique de nicotine et de l’exposition répétée à la silice sur la fibrose pulmonaire par la transition épithélio-mésenchymateuse chez l’être humain. De plus, ce modèle peut aider à l’étude directe des effets de la nicotine sur la silicose tout en évitant les effets d’autres composants de la fumée de cigarette.
Après adaptation à l’environnement, les souris ont été injectées par voie sous-cutanée avec une solution de nicotine de 0,25 mg / kg dans la peau lâche du cou tous les matins et soirs à des intervalles de 12 heures pendant 40 jours. De plus, de la poudre de silice cristalline (1 à 5 μm) a été mise en suspension dans une solution saline normale, diluée à une suspension de 20 mg/mL et dispersée uniformément à l’aide d’un bain-marie à ultrasons. Les souris anesthésiées à l’isoflurane ont inhalé 50 μL de cette suspension de poussière de silice par le nez et ont été réveillées par un massage thoracique. L’exposition à la silice a été administrée quotidiennement les jours 5 à 19.
Le modèle de souris doublement exposé a été exposé à la nicotine, puis à la silice, ce qui correspond aux antécédents d’exposition des travailleurs exposés aux deux facteurs nocifs. De plus, la nicotine a favorisé la fibrose pulmonaire par transformation épithélio-mésenchymateuse (EMT) chez la souris. Ce modèle animal peut être utilisé pour étudier les effets de plusieurs facteurs sur le développement de la silicose.
Introduction
L’exposition à la silice chez les travailleurs est inévitable dans certains milieux de travail, et une fois exposée à la silice, la détérioration progresse même après l’élimination de l’environnement. De plus, la plupart de ces travailleurs fument et les cigarettes traditionnelles contiennent des milliers de produits chimiques, le principal composant addictif étant la nicotine1. Les cigarettes électroniques sont de plus en plus populaires dans les groupes d’âge plus jeunes2 ; Ces cigarettes électroniques agissent comme un système d’administration de nicotine et augmentent l’accès à la nicotine, augmentant ainsi la susceptibilité pulmonaire et la pneumonie3. La fumée de cigarette accélère également la fibrose pulmonaire chez les souris exposées à la bléomycine4 et augmente la toxicité pulmonaire et la fibrose chez les souris exposées à la silice 5,6. Cependant, la question de savoir si la nicotine peut affecter le processus de fibrose inflammatoire et pulmonaire causé par la silice reste à étudier.
Le modèle murin de silicose établi par l’inhalation unique d’une forte dose de silice dans la trachée est traumatisant pour les souris. Bien que cette méthode fournisse rapidement un modèle de silicose, elle ne correspond pas à la réalité d’un environnement où les travailleurs sont exposés de manière répétée à la silice. Par conséquent, nous avons établi un modèle de souris exposées à la silice en administrant à plusieurs reprises une faible dose de suspensions de silice via un goutte-à-goutte nasal ; Cette dose peut provoquer une inflammation et une fibrose chez la souris.
Pour contourner les effets d’autres composants de la cigarette, ce modèle de souris a été injecté par voie sous-cutanée avec de la nicotine dans la peau lâche du cou pour déterminer l’effet du composant addictif, la nicotine, sur la silicose. L’administration d’injections sous-cutanées permet d’obtenir un dosage précis, ce qui permet de créer des modèles d’exposition à la nicotine et d’observer les réponses dose-toxicité, ainsi que la dépendance. Un modèle de dépendance à la nicotine a été développé chez des souris mâles, avec une dose d’injection de nicotine de 0,2 à 0,4 mg/kg 7,8. Dans ce modèle, pour répondre aux besoins de recherche de drogue des souris dépendantes, deux injections sous-cutanées ont été administrées à des intervalles de 12 heures. Ce modèle de dépendance à la nicotine chez la souris est utile pour simuler les habitudes de tabagisme et l’exposition des humains à la silice.
Les modèles animaux à facteur unique ont des limites dans les études sur les maladies, alors que la méthode décrite ici implique un modèle murin à deux facteurs de co-exposition à la nicotine et à la silice. Avant l’exposition à la silice, les souris ont été préexposées à la nicotine pour reproduire l’exposition à la nicotine chez les fumeurs. Par la suite, l’exposition à la silice a eu lieu du jour 5 au jour 19 pour imiter l’exposition à la silice dans un environnement de travail pour les personnes ayant des antécédents de tabagisme.
Les macrophages alvéolaires sont connus pour jouer un rôle important dans la régulation de l’inflammation et de la fibrose pulmonaires. Les macrophages ne peuvent pas décomposer la silice lors de son inhalation de silice, ce qui entraîne la polarisation des macrophages ou l’apoptose9 et la libération de cytokines telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β). Les macrophages M1, qui sont identifiés par la présence du marqueur de surface CD86, sont les principaux instigateurs de la réponse inflammatoire dans la silicose, tandis que les macrophages M2, qui sont marqués par CD206, sont responsables de la phase fibrotique de la maladie10. Chez les souris doublement exposées, la nicotine a induit la polarisation des macrophages vers le phénotype M2 dans les poumons lésés par la silice, favorisant ainsi la fibrose pulmonaire. De plus, le TGF-β1 est essentiel à l’induction de la fibrose et de l’EMT11 ; l’augmentation de l’expression de TGF-β1 a accéléré la progression de la fibrose pulmonaire par l’EMT. Ce modèle a analysé avec succès les effets de la nicotine sur la silicose et a mis en évidence l’importance de l’arrêt de la nicotine.
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Protocol
Toutes les procédures ont été menées conformément aux directives publiées par le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (la 8e édition du NRC) et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université des sciences et technologies de l’Anhui.
1. Préparation des animaux
- Héberger 32 souris mâles C57/BL6 âgées de 8 semaines dans un laboratoire avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Assurez-vous que les souris ont libre accès à la nourriture et à l’eau.
- Après 2 semaines d’acclimatation à l’environnement, lorsque les souris âgées de 10 semaines pèsent 23 à 26 g, utilisez des nombres aléatoires générés par un ordinateur pour regrouper au hasard les animaux sans cloisonnement, ce qui donne quatre groupes de souris : le groupe témoin (Con), le groupe nicotine (Nic), le groupe silice (SiO 2) et le groupe nicotine combiné à la silice (Nic+ SiO2).
2. Préparation de la nicotine
REMARQUE : La densité de nicotine est de 1,01 g/mL.
- Dissoudre la nicotine dans de l’éthanol anhydre et diluer 20 fois pour préparer une solution mère de nicotine de 50 mg/mL.
- Diluer la solution mère de nicotine 1 000 fois avec une solution saline normale stérile pour obtenir une solution efficace à une concentration de 0,05 mg/mL.
REMARQUE : Conservez la nicotine à l’abri de la lumière. La solution mère peut être conservée à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
3. Préparation de la silice
- Suspendre de la silice cristalline stérile dans une solution saline pour préparer une suspension de silice à 20 mg/mL et la faire osciller dans un bain-marie à agitation ultrasonique pendant 25 min.
- Agitez la suspension de silice avec un oscillateur vortex pendant 3 minutes avant que les souris ne reçoivent l’écoulement nasal. Mélangez la suspension de silice en pipetant de haut en bas 2x-3x avec une pipette de 200 μL, puis prélevez 50 μL pour l’écoulement nasal.
REMARQUE : La suspension de dioxyde de silicium doit être mélangée et administrée par goutte à goutte nasale dès que possible.
4. Capture de souris et exposition à la nicotine
- Pesez les souris et notez les poids tous les jours avant l’exposition.
- Du 1er au 40e jour, injecter par voie sous-cutanée de la nicotine deux fois par jour (à 12 h d’intervalle) chez les souris des groupes Nic et Nic+ SiO2 . Utilisez une dose de nicotine de 0,25 mg/kg ; Par exemple, assurez-vous qu’une souris pesant 25 g reçoit 6,25 μg de nicotine. Pour cette souris, le volume d’injection serait le suivant : 6,25/0,05 = 125 μL. Simultanément, injectez aux souris du groupe Con un volume égal de solution saline.
- Préparez les seringues de 1 ml requises pour chaque groupe et utilisez-les pour aspirer le volume d’injection de nicotine ou de solution saline. Avant d’absorber la nicotine, aspirez d’abord 0,1 à 0,2 mL d’air dans la seringue, puis aspirez 125 μL de nicotine. Tapotez délicatement la seringue pour remplir l’aiguille et l’extrémité avant de la seringue avec la nicotine. Placez la seringue contenant de la nicotine dans un plateau à l’abri de la lumière.
REMARQUE : Au moment de l’injection, 0,1 à 0,2 mL d’air est situé derrière la nicotine, ce qui garantit que tout le liquide est administré avec succès à la souris. - Saisissez la queue de la souris avec la main droite et, lorsque l’animal se détend, utilisez le pouce et l’index gauches pour appuyer sur la peau de l’arrière du cou, de la queue à la tête jusqu’au bord de l’oreille, en appliquant une pression modérée. Après cela, relâchez la main droite et utilisez le petit pouce gauche et l’annulaire pour pincer la queue et les membres postérieurs, auquel cas la souris sera complètement immobilisée par la main gauche.
REMARQUE : Saisissez la souris avec la force appropriée. Une force insuffisante permet aux souris de mordre facilement, tandis qu’une force excessive peut entraîner l’asphyxie des souris. - À l’aide de la main droite pour injecter, percez la peau à l’arrière du cou près du bord de l’oreille des souris dans le sens de la tête à la queue avec la seringue et injectez de la nicotine à un taux uniforme. Recherchez un renflement cutané semi-circulaire qui indique une injection réussie.
REMARQUE : Lorsque l’aiguille a perforé la peau, il y aura une sensation de résistance ; La résistance disparaît après l’insertion de l’aiguille. À ce stade, l’aiguille doit être légèrement retirée pour être injectée lentement et uniformément.
5. Exposition à la silice in vivo
- Du 5e au 19e jour, instillez la suspension de dioxyde de silicium dans la cavité nasale des souris des groupes SiO 2 et Nic+ SiO2. Anesthésier rapidement chaque souris avec de l’isoflurane à 2 % dans un appareil d’anesthésie à une dose de 3,6 mL/h. Après l’anesthésie, placez la souris sur la paume d’une main et exposez la cavité nasale de la souris. Instiller 50 μL de suspension de silice dans la cavité nasale dans un délai de 4 à 8 s.
- Pour permettre à la suspension de silice de pénétrer dans les poumons le plus rapidement possible, après l’instillation, appuyez doucement sur le cœur de la souris avec l’index pendant 3 à 5 s, 3 à 5 fois par seconde, pour favoriser sa fréquence respiratoire.
- Une fois que la respiration de la souris devient progressivement uniforme, placez la souris dans une cage pour l’observer pendant 3 minutes.
- Pour toutes les souris recevant la suspension de silice, répétez les étapes 1 à 3. Dans le groupe témoin, instiller 50 μL de solution saline stérile dans la cavité nasale les jours 5 à 19.
6. Acquisition de tissus pulmonaires frais et fixes
- Au jour 41, utiliser 50 mg/kg de pentobarbital sodique pour anesthésier les souris par voie intrapéritonéale à une dose de 0,1 mL/20 g en fonction de leur poids corporel. Fixez les membres sur une plaque d’essai en mousse et vaporisez la fourrure avec de l’alcool à 75%.
- Effectuez une perfusion cardiaque pour obtenir du tissu pulmonaire frais, coupez la ligne médiane de l’abdomen pour exposer la cavité thoracique et faites une petite ouverture à l’apex du cœur droit. Ensuite, injectez 20 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pré-refroidie lentement et uniformément à partir de l’apex du cœur gauche, ce qui fait sortir le sang de l’ouverture créée à l’apex du cœur droit. Prélevez tout le lobe pulmonaire, placez-le dans un tube à centrifuger de 1,5 ml pré-refroidi et transférez-le à −80 °C pour le stockage en attendant l’extraction des protéines.
- Perfuser d’autres souris avec 20 mL de PBS pré-refroidi suivi de 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % au même endroit pour fixer les poumons entiers ; conserver chaque poumon dans 30 mL de PFA à 4 %.
- Après 72 h, enfoncer les tissus pulmonaires fixes dans de la paraffine.
- Immergez le tissu pulmonaire dans le fixateur préparé dans un bain-marie à ultrasons à 40 °C pendant 30 minutes, suivi d’un processus de déshydratation dans de l’éthanol à 75 %, de l’éthanol à 95 % et de l’éthanol anhydre pendant 50 minutes chacun.
- Laver 2 fois avec du xylène pendant 50 min chacun.
- Placez le tissu dans de la cire de paraffine fondue à 55-60 °C pendant 2-3 h afin que le xylène dans le tissu pulmonaire soit progressivement remplacé par de la cire de paraffine.
- Fixez le tissu pulmonaire dans le cadre d’enrobage avec de la paraffine et attendez que le bloc de cire durcisse. Une fois que le bloc de cire a durci, utilisez la machine à sectionner la paraffine pour trancher le poumon à 4-5 μm.
- Placez les sections pulmonaires dans de l’eau ultra-pure à 45 °C. Une fois que la paraffine a fondu, chargez la section pulmonaire sur une lame de microscope adhérente.
7. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)
- Cuire les lames à 60 °C pendant 2 h, et placer les lames dans du xylène pour les dépatisser pendant 2 x 30 min. Ensuite, placez les lames dans de l’éthanol anhydre, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 85 % et de l’éthanol à 75 % pendant 5 minutes chacune. Enfin, lavez-les pendant 3 x 5 min avec de l’eau ultra-pure.
- Déposer 50 μL de solution de coloration à l’hématoxyline sur le tissu pulmonaire à l’aide d’un pistolet à pipette et colorer pendant 5 min ; Ensuite, lavez les tranches à l’eau courante pendant 5 min.
- Ajouter 50 μL d’acide chlorhydrique à 2 % dans de l’éthanol sur la section et rincer à l’eau distillée pendant 30 s. Ensuite, ajoutez 50 μL de solution de coloration à l’éosine sur le tissu pulmonaire pour colorer pendant 1 min.
- Déshydratez, transparentez et scellez les sections de paraffine.
- Ajouter 100 à 150 ml d’éthanol à 75 %, d’éthanol à 85 %, d’éthanol à 95 %, d’éthanol anhydre et de xylène dans un réservoir de teinture plastique combiné. Placez les lames dans de l’éthanol à 75 %, 85 %, 95 % et anhydre pendant 5 min chacune pour les déshydrater.
- Ensuite, placez les lames dans du xylène pendant 5 min pour les rendre transparentes.
- Enfin, déposez 20 μL de gomme neutre sur la section pulmonaire et placez une lamelle sur la lame pour la sceller.
REMARQUE : Les étapes ci-dessus sont effectuées à température ambiante.
8. Coloration Masson
- Déparaffinez, hydratez et lavez les sections de paraffine comme décrit à l’étape 7.1.
- Teindre les sections avec 50 μL de solution de coloration à l’hématoxyline de Weigert configurée pendant 7 min, puis 50 μL de solution de fractionnement à l’éthanol acide pendant 10 s, et laver à l’eau courante pour rendre les noyaux bleus.
- Teindre les sections avec 50 μL de solution trichrome Masson pendant 4 min, puis laver à l’eau.
- Rincez les sections à l’eau distillée pendant 1 min, puis colorez avec du magenta acide rouge Lichun pendant 7 min.
- Lavez les sections avec une solution de travail acide faible (acide chlorhydrique à 30%) pendant 1 à 2 minutes, une solution d’acide phosphomolybdique pendant 1 à 2 minutes et une solution de travail acide faible pendant 1 à 2 minutes.
- Teindre les sections dans une solution colorante au bleu d’aniline pendant 2 minutes, puis laver avec une solution de travail acide faible pendant 1 minute.
- Déshydrater les sections avec de l’éthanol à 95 % suivi d’éthanol anhydre pendant 1 s, les transparentiser avec du xylène pendant 1 s, puis les sceller avec de la résine neutre comme décrit à l’étape 7.4.
9. Immunohistochimie
- Faites cuire les tranches à 60 °C pendant 6 h. Déparaffinez, hydratez et lavez les sections de paraffine comme décrit à l’étape 7.1.
- Récupération de l’antigène : placez les tranches dans une boîte à trancher en plastique résistant à la chaleur contenant suffisamment de solution de récupération d’antigène de citrate pour immerger les tranches, et faites bouillir pendant 20 à 30 minutes.
- Laisser refroidir à température ambiante, retirer les sections et rincer à l’eau déminéralisée. Par la suite, faire tremper pendant 2 x 5 min dans du PBS contenant 0,5 % de Tween-20 (PBST).
- Dessinez une boucle près de la section pulmonaire de la diapositive avec un stylo hydrophobe pour former un cercle hydrophobe.
- Ajouter 50 μL de solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % (3% H 2 O2) goutte à goutte aux tranches, et incuber pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière pour l’inactivation de la peroxydase endogène.
- Faites tremper les tranches dans le PBST pendant 3 x 5 min.
- Ajouter 50 μL de protéines sériques bovines (BSA)-PBST à 5 % goutte à goutte aux tranches et bloquer pendant 1 h à température ambiante.
- Jeter la solution bloquante, ajouter 50 μL d’anticorps primaires dilués CD206 (dilution : 1 :1 500), TGF-β1 (dilution : 1 :200) et vimentine (dilution : 1 :2 000) goutte à goutte aux tranches, et incuber toute la nuit à 4 °C.
NOTE : Dans ce travail, tous les anticorps ont été dilués dans 5 % de BSA. - Le lendemain, remettez les tranches à température ambiante (40 min). Lavez les tranches comme décrit à l’étape 9.6.
- Diluer l’anticorps secondaire dans 5 % de BSA. Ajouter 50 μL d’anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort (dilution : 1 :500) goutte à goutte et incuber pendant 1 h à température ambiante. Lavez les tranches comme décrit à l’étape 9.6.
- Déposer 50 μL de solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) correspondant à l’anticorps secondaire marqué par l’enzyme sur le tissu pulmonaire et incuber pendant 5 à 10 minutes dans une boîte humide immunohistochimique noire. Observez au microscope jusqu’à ce que la couleur devienne un brun intense. Rincez les tranches avec de l’eau distillée pour mettre fin à la réaction.
REMARQUE : La coloration brune est considérée comme une coloration positive. - Teindre avec 50 μL de teinture à l’hématoxyline pendant 30 s et laver à l’eau courante. Ensuite, faites tremper les tranches dans de l’éthanol anhydre à 75 %, 85 %, 95 % et pendant 3 min chacune, puis dans du xylène pendant 2 x 10 min. Scellez les lames comme décrit à l’étape 7.4.
10. Analyse par transfert Western
- Sortez le tissu pulmonaire du congélateur et pesez-le. Ensuite, ajoutez 150 μL de tampon de lyse RIPA contenant du PMSF pour 20 mg de tissu pulmonaire. Lyser les poumons de la souris sur de la glace pendant 3 à 5 min à l’aide d’un homogénéisateur portatif, agiter doucement pendant 2 h à 4 °C pour permettre une lyse adéquate du tissu pulmonaire, centrifuger à 4 °C et 14 800 × g pendant 15 min et recueillir le surnageant.
REMARQUE : Ajouter 100 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF) quelques minutes avant d’utiliser le tampon de lyse RIPA. La concentration finale de PMSF est de 1 mM (p. ex., 10 μL de PMSF + 990 μL de RIPA). - Utilisez une trousse de concentration de protéines BCA pour déterminer la concentration en protéines de l’échantillon en suivant les instructions du fabricant. Après détermination, en utilisant la plus petite concentration de lysat de protéines comme base, diluer le même lot de lysat de protéines avec du RIPA à la plus petite concentration pour obtenir la même masse et le même volume.
REMARQUE : La quantité totale de charge en tissu pulmonaire est de 30 μg. - Ajouter 40 μL de tampon de charge 5x à 160 μL de lysat de protéines et chauffer à 100 °C pendant 10 min.
- Assembler le gel d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium à 10 % (SDS-PAGE) préparé dans le système d’électrophorèse Western Blot, ajouter le tampon d’électrophorèse SDS-PAGE, retirer doucement le peigne d’électrophorèse et ajouter 20 μL d’échantillon de protéines par puits lentement et uniformément. Mettez l’appareil sous tension et démarrez l’électrophorèse à 80 V pendant 30 min. Une fois que les protéines ont atteint la couche inférieure du gel, passez à 100 V et continuez l’électrophorèse pendant 60 à 70 minutes.
REMARQUE : L’électrophorèse nécessite un tampon d’électrophorèse frais. - Transférer les protéines sur une membrane PVDF par transfert humide. Activer la membrane PVDF avec du méthanol à l’avance (5-30 s). Retirez la plaque de gel d’électrophorèse, ouvrez-la avec précaution, placez le gel séparateur dans le tampon de transfert humide, faites le sandwich de transfert électrique et assemblez le système de transfert humide. Remplir le réservoir d’électrophorèse avec un tampon de transfert et transférer à 400 mA pendant 90 min.
REMARQUE : Le tampon de transfert est refroidi à l’avance pour éviter les effets des températures élevées pendant le transfert humide. - Lavez la membrane PVDF avec une solution saline tamponnée Tris avec 0,5 % de Tween-20 (TBST) pendant 3 x 5 min. Bloquer la membrane PVDF avec du lait écrémé à 5 % dilué dans du TBST, et incuber sur un shaker à température ambiante pendant 60 min ; ensuite, laver avec TBST pendant 2 min. Après le lavage, incuber la membrane pendant une nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire vimentine (1 :5 000) et GAPDH (1 :10 000) dilués dans 5 % de BSA.
- Placez la membrane à température ambiante pendant 30 min et lavez-la avec TBST pendant 5 x 5 min. Après le lavage, incuber la membrane avec l’anticorps secondaire (1 :10 000) dilué dans du lait écrémé à 5 % pendant 60 min à température ambiante.
- Placez la membrane, côté protéine vers le haut, déposez la solution de travail ECL préparée, incubez pendant 1 à 2 minutes et observez les résultats avec un imageur sur gel. Utilisez les valeurs en niveaux de gris mesurées par le logiciel dans l’imageur de gel pour évaluer les niveaux d’expression des protéines.
REMARQUE : En l’espèce, le GAPDH a servi de référence interne.
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Representative Results
Un modèle murin pour étudier la nicotine combinée à l’exposition à la silice a été établi pour étudier le rôle potentiel de la nicotine dans la progression de la silicose chez la souris. La figure 1 illustre la procédure expérimentale d’utilisation d’un modèle de souris à double exposition, qui a associé une injection de nicotine à l’instillation nasale d’une suspension de silice. Les changements pathologiques des souris de chaque groupe ont été observés à l’aide de la coloration HE. Les souris exposées à la nicotine combinée à de la silice présentaient des lésions pulmonaires significativement plus graves que celles exposées à la nicotine ou à la silice seule. Les lymphocytes ont augmenté près des vaisseaux lymphatiques dans les poumons des souris exposées à la nicotine, formant des amas de cellules inflammatoires. La coloration de Masson a révélé une augmentation significative du dépôt de fibres de collagène dans les poumons exposés à la nicotine combinée à de la silice par rapport aux poumons des autres groupes, ce qui a été confirmé par la quantification de la coloration de Masson (Figure 2). La structure alvéolaire a été détruite chez les souris exposées à la silice et le nombre de macrophages a augmenté. Cependant, après l’exposition à la nicotine combinée à la silice, il y a eu une infiltration cellulaire inflammatoire importante et des nodules de fibroblastes sont apparus. De plus, les macrophages accumulés, en particulier les macrophages M2, sont présents dans le groupe doublement exposé. Les macrophages M2 sont essentiels au stade fibrotique avancé de la silicose.
De plus, une augmentation significative du facteur pro-fibrotique TGF-β1 a été observée par coloration immunohistochimique (IHC) dans les poumons de souris doublement exposées, en particulier dans les cellules inflammatoires situées à proximité des vaisseaux lymphatiques (Figure 3). Le TGF-β1 sécrété par les macrophages favorise l’EMT des cellules épithéliales et la fibrose pulmonaire12. Par rapport aux souris exposées à la silice seule, les niveaux de vimentine étaient significativement élevés dans les poumons des souris à double exposition. La coloration IHC et la quantification des protéines ont toutes deux indiqué une EMT sévère chez les souris doublement exposées (Figure 4). Les preuves combinées suggèrent que l’exposition chronique à la silice favorise l’EMT après la régulation à la hausse du TGF-β1, conduisant à une augmentation des fibroblastes et à une fibrose progressive. Dans le même temps, l’ajout de nicotine accélère le processus de fibrose pulmonaire en aggravant l’EMT, permettant à la fibrose pulmonaire d’apparaître plus tôt. Ce modèle est conçu pour explorer l’impact de la nicotine sur la fibrose pulmonaire, qui est une conséquence de l’exposition chronique à la silice chez l’homme.
Figure 1 : Conception d’un modèle expérimental d’exposition combinée à la nicotine et à la silice chez la souris. Injection continue de nicotine pendant 1 à 40 jours et instillation nasale continue de silice pendant 5 à 19 jours. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La nicotine favorise la formation de masses fibroblastiques dans les poumons des souris exposées à la silice. (A) La coloration HE a été utilisée pour visualiser les changements pathologiques dans les poumons. Les souris doublement exposées présentaient une infiltration de cellules inflammatoires sévère et une fibrose. Les flèches vertes indiquent les masses cellulaires inflammatoires. Barre d’échelle = 50 μm. (B) La coloration de Masson a été utilisée pour montrer les fibres de collagène dans les poumons. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Quantification des fibres de collagène dans les poumons. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Augmentation des cellules CD206 positives et du TGF-β1 dans les poumons de souris doublement exposées à la nicotine et à la silice. (A) La coloration IHC de CD206 a été utilisée pour observer la distribution et l’expression des macrophages chez les souris doublement exposées. Les macrophages CD206 positifs ont augmenté dans les poumons des souris après une exposition combinée à la nicotine et à la silice. Les flèches courtes représentent les cellules CD206 positives. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Le TGF-β1, un promoteur de la fibrose, a été élevé chez les souris doublement exposées. Les flèches longues représentent les cellules TGF-β1 positives. Barre d’échelle = 50 μm. (C,D) AOD de CD206 et TGF-β1. AOD = IOD (densité optique intégrée)/surface. L’AOD reflète la concentration de CD206 et de TGF-β1 par unité de surface. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abréviations : TGF-β1 = facteur de croissance transformant-bêta ; IHC = immunohistochimie ; AOD = densité optique moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Promotion de la fibrose pulmonaire par la nicotine chez des souris exposées à la silice par l’aggravation de l’EMT. (A) L’expression de la vimentine dans chaque groupe a été observée par coloration IHC. La vimentine était fortement exprimée dans les poumons des souris exposées à la nicotine et à la silice. Barre d’échelle = 50 μm.(B) Western blot d’expression de la vimentine dans chaque groupe d’exposition, avec une augmentation de la vimentine dans les tissus pulmonaires des souris doublement exposées. (C) La valeur AOD de la vimentine était significativement plus élevée dans le groupe doublement exposé que dans les autres groupes. (D) Le niveau relatif d’expression protéique de la vimentine par rapport à la GAPDH. L’expression de la vimentine dans le groupe de double exposition était significativement plus élevée que dans les groupes d’exposition à la nicotine ou à la silice. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abréviations : EMT = transition épithélio-mésenchymateuse ; AOD = densité optique moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un modèle animal à double exposition est nécessaire pour étudier le rôle et les mécanismes potentiels de l’exposition concomitante à la nicotine et au dioxyde de silicium cristallin. Ce modèle a été réalisé dans ce travail par l’injection sous-cutanée de nicotine et l’écoulement nasal de silice. Pour assurer une injection de nicotine réussie, l’opérateur doit se familiariser avec la préhension des souris, car la préhension de la peau à l’arrière du cou pourrait être douloureuse pour elles. Par conséquent, il est important de permettre aux souris de s’adapter progressivement à la préhension. De plus, une étape critique de l’exposition à la silice chez la souris est l’écoulement nasal. Pour augmenter le succès de la procédure et le taux de survie des souris, il est essentiel de pratiquer le goutte-à-goutte nasal au préalable.
Lors de l’injection, la seringue doit être passée au-dessus de la tête de la souris pour éviter une forte lutte lorsque la souris voit la seringue. La queue de la souris doit être fermement saisie avec la main droite, tandis que la main gauche doit être utilisée pour pousser la peau jusqu’au bord de l’oreille à l’arrière du cou avec précaution et pour pincer la peau à cet endroit. Après avoir relâché la queue de la souris avec la main droite, la queue et les membres postérieurs doivent être stabilisés à l’aide du pouce et de l’annulaire gauches pour éviter de mordre. À l’aide d’une seringue de 1 ml dans la main droite, l’aiguille doit être insérée dans la peau lâche au-dessus du cou à un angle de 30° dans le sens de la tête à la queue. L’aiguille doit être retirée légèrement après la perte de la résistance et l’injection doit être administrée lentement et uniformément. Du 5e au 19e jour, les souris du groupe à double exposition ont été exposées à la nicotine et à la silice. Il est recommandé d’injecter la nicotine à 08h00, suivie de la goutte nasale de dioxyde de silicium à 14h00 et d’une autre injection de nicotine à 20h00. Les deux injections de nicotine doivent être administrées à 12 h d’intervalle pour éviter les effets de préhension répétée sur les souris.
La réalisation d’injections sous-cutanées et d’écoulement nasal présente plusieurs défis techniques. Pour les injections sous-cutanées, les souris doivent être saisies avec une force appropriée. Si la peau à l’arrière du cou est trop serrée, les voies respiratoires de la souris seront bloquées, ce qui entraînera rapidement une suffocation. Pour une résistance optimale, la peau à l’arrière du cou doit être pincée jusqu’à ce que les globes oculaires dépassent légèrement. À ce moment-là, la souris ressent la douleur la plus faible et respire doucement. De plus, une seringue de 1 ml vidée d’air doit être utilisée pour aspirer l’injection de nicotine du tube, suivie de 0,1 à 0,2 ml d’air supplémentaire. Avant l’injection, les bulles doivent être doucement éliminées. En raison du faible volume de l’injection, la nicotine laissée à l’extrémité de l’aiguille peut entraîner une dose insuffisante. Les éléments clés de l’injection sont l’insertion rapide de l’aiguille, l’injection lente de la nicotine et le retrait progressif de l’aiguille. Pour l’écoulement nasal, dans cette étude, la cavité nasale des souris a été entièrement exposée sous anesthésie profonde, suivie de l’instillation lente et uniforme d’une suspension de dioxyde de silicium. Il est également important d’appuyer doucement sur la cavité thoracique après une exposition à la silice pour éviter la toux ou l’étouffement.
Ce modèle présente certaines limites. Les particules de silice de 1 à 5 μm utilisées dans les expériences n’ont pas été prélevées dans l’environnement et étaient des particules de silice pures. En revanche, dans les milieux de travail réels, les travailleurs peuvent être exposés à une variété de matières dangereuses, et pas seulement à des particules de silice, comme un mélange de charbon et de poussière de silice dans une usine de céramique ou une mine de charbon. Nous avons utilisé de la silice d’instillation nasale pour obtenir de faibles doses et des expositions multiples répétées pour simuler l’exposition chronique des travailleurs. Dans le modèle murin à double exposition, bien que la nicotine ne provienne pas de l’exposition à la fumée de cigarette, la nicotine injectée pénètre directement dans la circulation sanguine, ce qui permet d’explorer plus ciblément le rôle de la nicotine dans le processus de silicose et d’éviter les effets des autres composants de la fumée de cigarette.
La recherche scientifique sur la silicose a généralement utilisé des modèles murins à facteur unique, soit par inhalation, soit par perfusion bronchique de silice, pour évaluer le rôle de la silice dans le développement de la maladie. Une autre approche est l’instillation nasale de dioxyde de silicium, qui est simple et facile et permet d’établir des modèles d’exposition répétée et chronique à la silice13. Le modèle bien établi de goutte à goutte nasale de dioxyde de silicium cause des dommages minimes aux souris et pourrait être combiné avec d’autres facteurs pour créer un modèle animal multifactoriel exposé. De plus, les principales méthodes d’exposition à la nicotine chez la souris comprennent la nicotine dans l’eau potable, l’injection sous-cutanée de nicotine, la perfusion de nicotine via des minipompes osmotiques et l’exposition à la fumée de tabac14. L’injection sous-cutanée utilisée dans le modèle à double exposition permet de régler avec précision le dosage et le moment de la nicotine, garantissant ainsi que chaque souris reçoit la même dose.
En bref, le modèle animal de la nicotine en combinaison avec l’exposition à la silice reproduit un modèle d’exposition chronique réaliste, et ce modèle peut être utilisé pour d’autres recherches sur les impacts de la nicotine sur l’inflammation et la fibrose dans le développement de la silicose. De plus, ce modèle sert de base à la formation d’un modèle animal à double exposition avec plusieurs doses et délais.
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Disclosures
Tous les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le programme d’innovation en synergie universitaire de la province d’Anhui (GXXT-2021-077) et le Fonds d’innovation pour les diplômés de l’Université des sciences et technologies de l’Anhui (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
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