Summary
본 연구는 실험용 규폐증 마우스에서 니코틴이 폐섬유증 진행에 미치는 시너지 효과를 연구하기 위한 마우스 모델을 설명한다. 이중 노출 마우스 모델은 니코틴과 실리카에 동시에 노출된 후 폐의 병리학적 진행을 시뮬레이션합니다. 설명된 방법은 간단하고 재현성이 높습니다.
Abstract
흡연과 실리카에 대한 노출은 직업 근로자들 사이에서 흔하며 실리카는 비흡연자보다 흡연자의 폐를 손상시킬 가능성이 더 높습니다. 담배의 주요 중독 성분인 니코틴이 규폐증 발병에 미치는 역할은 불분명하다. 본 연구에 사용된 마우스 모델은 간단하고 쉽게 제어할 수 있었으며, 인간의 상피-중간엽 전이를 통해 만성 니코틴 섭취 및 실리카 반복 노출이 폐 섬유증에 미치는 영향을 효과적으로 시뮬레이션했습니다. 또한 이 모델은 담배 연기에서 다른 성분의 영향을 피하면서 규폐증에 대한 니코틴의 영향을 직접 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.
환경 적응 후, 생쥐에게 0.25mg/kg의 니코틴 용액을 40일 동안 매일 아침과 저녁에 12시간 간격으로 목 위의 느슨한 피부에 피하 주사했습니다. 또한, 결정질 실리카 분말(1-5μm)을 생리식염수에 현탁시키고, 20mg/mL의 현탁액으로 희석하고, 초음파 수조를 사용하여 고르게 분산시켰다. 이소플루란에 마취된 마우스는 코를 통해 이 실리카 분진 현탁액 50μL를 흡입하고 가슴 마사지를 통해 깨어났습니다. 실리카 노출은 5-19일에 매일 투여되었습니다.
이중 노출된 마우스 모델은 니코틴에 노출된 다음 실리카에 노출되었는데, 이는 두 유해 요인에 모두 노출된 작업자의 노출 이력과 일치합니다. 또한 니코틴은 마우스에서 상피-중간엽 변환(EMT)을 통해 폐섬유증을 촉진했습니다. 이 동물 모델은 규폐증 발병에 대한 여러 요인의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
작업자의 실리카 노출은 일부 직업 환경에서 불가피하며, 실리카에 노출되면 환경에서 제거된 후에도 열화가 진행됩니다. 또한 이러한 근로자의 대부분은 담배를 피우며 전통적인 담배에는 수천 가지 화학 물질이 포함되어 있으며 주요 중독 성분은 니코틴입니다 1. 전자담배는 젊은 연령층에서 점점 더 인기를 얻고 있다2; 이러한 전자담배는 니코틴 전달 시스템 역할을 하며 니코틴 접근성을 높여 폐 감수성과 폐렴을 증가시킨다3. 담배 연기는 또한 블레오마이신에 노출된 마우스에서 폐섬유증을가속화하고4 실리카에 노출된 마우스에서 폐독성 및 섬유화를 증가시킨다 5,6. 그러나 니코틴이 실리카로 인한 염증 및 폐 섬유화 과정에 영향을 미칠 수 있는지 여부는 아직 조사되지 않았습니다.
기관으로 고용량의 실리카를 한 번 흡입하여 확립된 규폐증 마우스 모델은 마우스에게 외상을 입힙니다. 이 방법은 규폐증 모델을 빠르게 제공하지만, 작업자가 실리카에 반복적으로 노출되는 환경의 현실과 일치하지 않습니다. 따라서 우리는 비강 점적액을 통해 저용량의 실리카 현탁액을 반복적으로 투여하여 실리카 노출 마우스 모델을 확립했습니다. 이 복용량은 쥐에 있는 염증 그리고 섬유증을 일으키는 원인이 될 수 있습니다.
다른 담배 성분의 영향을 피하기 위해, 이 마우스 모델은 중독성 성분인 니코틴이 규폐증에 미치는 영향을 결정하기 위해 목의 느슨한 피부에 니코틴을 피하 주사했습니다. 피하 주사를 투여함으로써 정확한 투여를 얻을 수 있으므로 니코틴 노출 모델을 만들고 용량 독성 반응 및 중독을 관찰할 수 있습니다. 니코틴 중독 모델은 수컷 쥐에서 개발되었으며, 니코틴 주입 용량은 0.2-0.4 mg/kg 7,8입니다. 이 모델에서는 중독된 쥐의 약물 추구 요구를 충족시키기 위해 12시간 간격으로 두 번의 피하 주사를 투여했습니다. 이 마우스 니코틴 중독 모델은 인간의 흡연 습관과 실리카 노출을 시뮬레이션하는 데 유용합니다.
단일 요인 동물 모델은 질병 연구에서 한계가 있는 반면, 여기에 설명된 방법은 니코틴과 실리카 동시 노출의 2요인 마우스 모델을 포함합니다. 실리카에 노출되기 전에, 마우스는 담배를 피우는 사람들의 니코틴 노출을 재현하기 위해 니코틴에 미리 노출되었습니다. 그 후, 실리카 노출은 흡연 이력이 있는 개인의 작업 환경에서 실리카 노출을 모방하기 위해 5일째부터 19일째까지 일어났습니다.
폐포 대식세포는 폐 염증과 섬유증 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 대식세포는 실리카를 흡입할 때 실리카를 분해할 수 없어 대식세포 분극 또는 세포사멸(apoptosis)9 을 유발하고 종양괴사인자-알파(TNF-α) 및 형질전환성장인자베타(TGF-β)와 같은 사이토카인을 방출합니다. 표면 마커 CD86의 존재로 식별되는 M1 대식세포는 규폐증에서 염증 반응의 주요 유발인자인 반면, CD206으로 표시된 M2 대식세포는 상태10의 섬유화 단계를 담당합니다. 이중 노출된 마우스에서 니코틴은 실리카에 손상된 폐에서 M2 표현형을 향한 대식세포의 분극을 유도하여 폐 섬유증을 촉진했습니다. 또한 TGF-β1은 섬유증 및 EMT11 유도의 핵심입니다. TGF-β1의 증가된 발현은 EMT를 통한 폐 섬유증의 진행을 가속화했습니다. 이 모델은 규폐증에 대한 니코틴의 영향을 성공적으로 분석하고 니코틴 중단의 중요성을 더욱 강조했습니다.
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Protocol
모든 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(NRC 제8판)에서 발행한 지침에 따라 수행되었으며 안후이성과학기술대학 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 동물 준비
- 32 마리의 수컷 C57 / BL6 마우스를 12 시간의 밝음 / 어두움주기가있는 실험실에서 8 주 동안 숙성했습니다. 쥐가 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는지 확인하십시오.
- 환경에 적응한 지 2주 후, 10주 된 쥐의 무게가 23-26g일 때 컴퓨터에서 생성된 난수를 사용하여 동물을 분할하지 않고 무작위로 그룹화하여 대조군(Con), 니코틴기(Nic), 실리카기(SiO2) 및 실리카기와 결합된 니코틴(Nic+SiO2).
2. 니코틴 준비
참고: 니코틴 밀도는 1.01g/mL입니다.
- 니코틴을 무수 에탄올에 녹이고 20배 희석하여 50mg/mL의 니코틴 원액을 제조합니다.
- 니코틴 원액을 멸균 생리식염수로 1,000배 희석하여 0.05mg/mL 농도의 작업 용액을 만듭니다.
알림: 니코틴은 빛을 피하여 보관하십시오. 원액은 4°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
3. 실리카 준비
- 멸균 결정질 실리카를 식염수에 현탁시켜 20mg/mL 실리카 현탁액을 준비하고 초음파 진탕 수조에서 25분 동안 진동시킵니다.
- 생쥐가 비강 물방울을 받기 전에 소용돌이 발진기로 실리카 현탁액을 3분 동안 흔듭니다. 200 μL 피펫으로 2x-3x 위아래로 피펫팅하여 실리카 현탁액을 혼합한 다음 비강 점적에 50 μL를 사용합니다.
알림: 이산화규소 현탁액은 가능한 한 빨리 비강 물방울을 통해 혼합하여 투여해야 합니다.
4. 마우스 포획 및 니코틴 노출
- 생쥐의 무게를 측정하고 노출되기 전에 매일 체중을 기록하십시오.
- 1-40일째에 Nic 및 Nic+ SiO2 그룹의 마우스에 하루에 두 번(12시간 간격) 니코틴을 피하 주사합니다. 0.25mg/kg의 니코틴 용량을 사용하십시오. 예를 들어, 무게가 25g인 쥐가 6.25μg의 니코틴을 받도록 합니다. 이 마우스의 경우 주입 부피는 6.25/0.05 = 125μL입니다. 동시에 Con 그룹의 마우스에 동일한 부피의 식염수를 주입합니다.
- 각 그룹에 필요한 1mL 주사기를 준비하고 이를 사용하여 니코틴 또는 식염수 주입량을 흡인합니다. 니코틴을 흡입하기 전에 먼저 주사기에 0.1-0.2mL의 공기를 흡입한 다음 125μL의 니코틴을 흡입합니다. 주사기를 조심스럽게 두드려 바늘과 주사기 앞쪽 끝을 니코틴으로 채웁니다. 니코틴 함유 주사기를 빛으로부터 보호된 트레이에 넣습니다.
참고: 주입 시 0.1-0.2mL의 공기가 니코틴 뒤에 위치하여 모든 액체가 마우스에 성공적으로 투여되도록 합니다. - 오른손으로 쥐의 꼬리를 잡고 동물이 긴장을 풀면 왼손 엄지와 검지를 사용하여 꼬리에서 머리, 귀 가장자리까지 목 뒤쪽의 피부를 누르고 적당한 압력을 가합니다. 그런 다음 오른손을 떼고 왼쪽 작은 엄지와 약지를 사용하여 꼬리와 뒷다리를 꼬집으면 마우스가 왼손에 의해 완전히 고정됩니다.
주: 적절한 힘으로 마우스를 잡으십시오. 힘이 부족하면 쥐가 물기 쉬운 반면 힘이 너무 강하면 쥐가 질식할 수 있습니다. - 오른손으로 주사를 사용하여 주사기로 쥐의 귀 가장자리 부근의 목 뒤 피부를 머리에서 꼬리 방향으로 찔러 니코틴을 일정한 속도로 주입합니다. 주사가 성공했음을 나타내는 반원형의 피부 팽창을 찾으십시오.
알림: 바늘이 피부에 구멍을 뚫으면 저항감이 생깁니다. 바늘을 삽입하면 저항이 사라집니다. 이 시점에서 천천히 고르게 주입하려면 바늘을 약간 빼야 합니다.
5. 생체 내 실리카 노출
- 5-19일째에 SiO 2 및 Nic+ SiO2 그룹에 속한 마우스의 비강에 이산화규소 현탁액을 주입합니다. 마취 기계에서 3.6mL/h의 용량으로 각 마우스를 2% 이소플루란으로 빠르게 마취합니다. 마취 후 마우스를 한 손바닥에 놓고 마우스의 비강을 노출시킵니다. 50μL의 실리카 현탁액을 4-8초 이내에 비강에 주입합니다.
- 실리카 현탁액이 가능한 한 빨리 폐에 들어갈 수 있도록 점안 후 집게 손가락으로 쥐의 심장을 초당 3-5회, 초당 3-5회 동안 부드럽게 눌러 호흡수를 높입니다.
- 쥐의 호흡이 점차 균일해지면 쥐를 케이지에 넣어 3분 동안 관찰합니다.
- 실리카 현탁액을 투여받은 모든 마우스에 대해 1-3단계를 반복합니다. 대조군에서는 5-19일에 50μL의 멸균 식염수를 비강에 주입합니다.
6. 신선하고 고정된 폐 조직의 획득
- 41일째에 펜토바르비탈나트륨 50mg/kg을 사용하여 체중에 따라 0.1mL/20g의 용량으로 마우스를 복강내로 마취합니다. 발포 시험판에 팔다리를 고정하고 털에 75% 알코올을 뿌린다.
- 심장 관류를 시행하여 신선한 폐 조직을 얻고, 복부의 정중선을 잘라 흉강을 노출시키고, 오른쪽 심장의 정점에 작은 구멍을 만듭니다. 그런 다음 왼쪽 심장의 정점에서 20mL의 예냉식 인산염 완충 식염수(PBS)를 천천히 고르게 주입하여 오른쪽 심장의 정점에 생성된 구멍에서 혈액이 흘러나오도록 합니다. 폐엽 전체를 꺼내 예절된 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣고 단백질 추출을 위해 -80°C로 옮겨 보관합니다.
- 다른 마우스에 20mL의 예냉된 PBS를 주입한 후 동일한 위치에 10mL의 4% 파라포름알데히드를 주입하여 전체 폐를 고정합니다. 각 폐를 4% PFA 30mL로 보존합니다.
- 72시간 후 고정된 폐 조직을 파라핀에 삽입합니다.
- 40°C의 초음파 수조에 30분 동안 준비된 고정액에 폐 조직을 담근 다음 75% 에탄올, 95% 에탄올 및 무수 에탄올에서 각각 50분 동안 탈수 과정을 거칩니다.
- 자일렌으로 각각 50분씩 2번 세척합니다.
- 녹인 파라핀 왁스에 조직을 55-60°C에서 2-3시간 동안 두어 폐 조직의 크실렌이 점차적으로 파라핀 왁스로 대체되도록 합니다.
- 파라핀으로 임베딩 프레임에 폐 조직을 고정하고 왁스 블록이 굳을 때까지 기다립니다. 왁스 블록이 굳은 후 파라핀 절편 기계를 사용하여 폐를 4-5μm로 절단합니다.
- 폐 절편을 45°C의 초순수에 넣습니다. 파라핀이 녹으면 폐 부분을 부착 현미경 슬라이드에 장착합니다.
7. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색
- 슬라이드를 60°C에서 2시간 동안 굽고 슬라이드를 자일렌에 넣어 2 x 30분 동안 왁스를 제거합니다. 그런 다음 슬라이드를 무수 에탄올, 95% 에탄올, 85% 에탄올 및 75% 에탄올에 각각 5분 동안 놓습니다. 마지막으로 초순수로 3 x 5분 동안 씻는다.
- 피펫 건으로 50μL의 헤마톡실린 염색 용액을 폐 조직에 떨어뜨리고 5분 동안 염색합니다. 그런 다음 흐르는 물로 5분 동안 조각을 씻습니다.
- 에탄올에 50 μL의 2 % 염산을 섹션에 추가하고 증류수로 30 초 동안 헹굽니다. 그런 다음 50μL의 에오신 염색 용액을 폐 조직에 추가하여 1분 동안 염색합니다.
- 파라핀 부분을 탈수, 투명화 및 밀봉합니다.
- 100-150 mL의 75 % 에탄올, 85 % 에탄올, 95 % 에탄올, 무수 에탄올 및 크실렌을 결합 된 플라스틱 염색 탱크에 넣습니다. 슬라이드를 75%, 85%, 95% 및 무수 에탄올에 각각 5분 동안 넣어 탈수합니다.
- 그런 다음 슬라이드를 크실렌에 5분 동안 넣어 투명하게 만듭니다.
- 마지막으로 20μL의 중성 껌을 폐 부분에 떨어뜨리고 슬라이드 위에 커버슬립을 놓아 밀봉합니다.
알림: 위의 단계는 실온에서 수행됩니다.
8. 메이슨 염색
- 7.1단계에서 설명한 대로 파라핀 섹션을 왁스를 제거하고 수화하고 세척합니다.
- 구성된 Weigert의 헤마톡실린 염색 용액 50μL로 절편을 7분 동안 염색한 다음 50μL의 산성 에탄올 분별 용액을 10초 동안 염색하고 흐르는 물로 세척하여 핵을 파란색으로 만듭니다.
- 50μL의 Masson 삼크롬 용액으로 섹션을 4분 동안 염색하고 물로 세척합니다.
- 증류수로 1분 동안 섹션을 헹군 다음 Lichun 적산 마젠타로 7분 동안 염색합니다.
- 약산성 가용액(30% 염산)으로 1-2분, 포스포몰리브딕산 용액을 1-2분, 약산성 가용액으로 1-2분 동안 섹션을 세척합니다.
- 아닐린 블루 염색 용액으로 섹션을 2분 동안 염색한 다음 약산성 작업 용액으로 1분 동안 세척합니다.
- 95% 에탄올로 섹션을 탈수한 다음 1초 동안 무수 에탄올로 탈수하고, 1초 동안 크실렌으로 투명화하고, 마지막으로 7.4단계에서 설명한 대로 중성 수지로 밀봉합니다.
9. 면역조직화학
- 슬라이스를 60°C에서 6시간 동안 굽습니다. 7.1단계에서 설명한 대로 파라핀 섹션을 왁스를 제거하고 수화하고 세척합니다.
- 항원 회수: 슬라이스를 잠글 수 있을 만큼 충분한 구연산염 항원 회수 용액이 들어 있는 내열성 플라스틱 슬라이싱 상자에 슬라이스를 넣고 20-30분 동안 끓입니다.
- 실온으로 식히고 섹션을 제거하고 탈이온수로 헹굽니다. 그런 다음 0.5% Tween-20(PBST)이 함유된 PBS에 2 x 5분 동안 담그십시오.
- 소수성 펜으로 슬라이드의 폐 부분 근처에 고리를 그려 소수성 원을 형성합니다.
- 50μL의 3% 과산화수소 용액(3%H2O2)을 절편에 적가하고 내인성 과산화효소의 비활성화를 위해 빛으로부터 보호되는 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- PBST에 3 x 5분 동안 슬라이스를 담그십시오.
- 50μL의 5% 소 혈청 단백질(BSA)-PBST를 슬라이스에 적가하고 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
- 차단 용액을 버리고 희석된 1차 항체 CD206(희석: 1:1,500), TGF-β1(희석: 1:200) 및 비멘틴(희석: 1:2,000) 50μL를 절편에 적가하고 4°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 이 작업에서는 모든 항체를 5% BSA에 희석했습니다. - 다음날 슬라이스를 실온(40분)에 되돌립니다. 9.6단계에 설명된 대로 슬라이스를 씻습니다.
- 2차 항체를 5% BSA에 희석합니다. 50μL의 양고추냉이 과산화효소 표지 2차 항체(희석: 1:500)를 적가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 9.6단계에 설명된 대로 슬라이스를 씻습니다.
- 효소 표지 2차 항체에 해당하는 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 용액 50μL를 폐 조직에 떨어뜨리고 검은색 면역조직화학적 습식 상자에서 5-10분 동안 배양합니다. 색상이 강한 갈색으로 발전할 때까지 현미경으로 관찰하십시오. 반응을 종료하기 위해 증류수로 조각을 헹굽니다.
참고: 갈색 염색은 양성 염색으로 간주됩니다. - 50μL의 헤마톡실린 염색으로 30초 동안 염색하고 흐르는 물로 씻습니다. 다음으로 슬라이스를 75%, 85%, 95% 및 무수 에탄올에 각각 3분 동안 담근 다음 크실렌에 2 x 10분 동안 담근다. 7.4단계에 설명된 대로 슬라이드를 봉인합니다.
10. 웨스턴 블랏 분석
- 냉동실에서 폐 조직을 꺼내 무게를 잰다. 다음으로, 폐 조직 20mg당 PMSF를 함유한 RIPA 용해 완충액 150μL를 추가합니다. 휴대용 균질화기를 사용하여 생쥐 폐를 얼음 위에서 3-5분 동안 용해하고, 폐 조직이 적절하게 용해될 수 있도록 4°C에서 2시간 동안 부드럽게 흔든 다음, 4°C 및 14,800× g 에서 15분 동안 원심분리한 다음 상층액을 수집합니다.
참고: RIPA 용해 완충액을 사용하기 몇 분 전에 100mM 페닐메탄술포닐플루오라이드(PMSF)를 추가합니다. PMSF의 최종 농도는 1mM(예: PMSF 10μL + RIPA 990μL)입니다. - BCA 단백질 농축 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 샘플의 단백질 농도를 측정하십시오. 결정 후 가장 낮은 농도의 단백질 용해물을 베이스로 사용하여 동일한 단백질 용해물 배치를 RIPA로 가장 작은 농도로 희석하여 동일한 질량과 부피를 얻습니다.
참고: 폐 조직 로딩의 총량은 30μg입니다. - 160μL의 단백질 용해물에 40μL의 5x 로딩 버퍼를 추가하고 100°C에서 10분 동안 가열합니다.
- 준비된 10% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔을 웨스턴 블로팅 전기영동 시스템에 조립하고, SDS-PAGE 전기영동 버퍼를 추가하고, 부드럽게 전기영동 빗을 빼내고, 웰 당 단백질 샘플 20μL를 천천히 균일하게 추가합니다. 전원을 켜고 80분 동안 30V에서 전기영동을 시작합니다. 단백질이 더 낮은 젤 층에 도달한 후에, 100 V에 전환하고, 60-70 분 동안 전기 이동법을 계속하십시오.
참고: 전기영동에는 새로운 전기영동 완충액이 필요합니다. - 습식 전달을 통해 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다. PVDF 멤브레인을 메탄올로 미리 활성화하십시오 (5-30 초). 전기영동 겔 플레이트를 꺼내 조심스럽게 들어 올려 열고 분리기 겔을 습식 이송 버퍼에 넣고 전기 이송 샌드위치를 만들고 습식 이송 시스템을 조립합니다. 전기영동 탱크에 이송 버퍼를 채우고 400mA에서 90분 동안 이송합니다.
알림: 전송 버퍼는 습식 전송 중 고온의 영향을 피하기 위해 미리 냉각됩니다. - PVDF 멤브레인을 0.5% Tween-20(TBST)이 포함된 Tris 완충 식염수로 3 x 5분 동안 세척합니다. TBST에 희석한 5% 탈지유로 PVDF 멤브레인을 차단하고 실온에서 셰이커에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 TBST로 2분 동안 씻으십시오. 세척 후 5% BSA에 희석된 1차 항체 비멘틴(1:5,000) 및 GAPDH(1:10,000)를 사용하여 4°C에서 밤새 멤브레인을 배양합니다.
- 멤브레인을 실온에 30분 동안 두고 TBST로 5 x 5분 동안 세척합니다. 세척 후, 5% 탈지유에 희석된 2차 항체(1:10,000)로 멤브레인을 실온에서 60분 동안 배양합니다.
- 멤브레인을 단백질 면이 위로 향하게 놓고 준비된 ECL 작업 용액을 떨어뜨리고 1-2분 동안 배양하고 겔 이미저로 결과를 관찰합니다. 겔 이미저에서 소프트웨어로 측정한 그레이스케일 값을 사용하여 단백질 발현 수준을 평가합니다.
참고: 여기서 GAPDH는 내부 참조로 사용되었습니다.
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Representative Results
생쥐의 규폐증 진행에서 니코틴의 잠재적 역할을 조사하기 위해 실리카 노출과 결합된 니코틴을 연구하기 위한 마우스 모델이 확립되었습니다. 그림 1 은 니코틴 주입과 실리카 현탁액의 비강 점안을 결합한 이중 노출 마우스 모델을 사용하기 위한 실험 절차를 보여줍니다. 각 그룹에서 마우스의 병리학적 변화는 HE 염색을 사용하여 관찰되었습니다. 실리카와 결합된 니코틴에 노출된 쥐는 니코틴이나 실리카만 노출된 쥐보다 훨씬 더 심각한 폐 손상을 입었습니다. 림프구는 니코틴에 노출된 쥐의 폐에 있는 림프관 근처에서 증가하여 염증성 세포 클러스터를 형성했습니다. Masson 염색은 다른 그룹의 폐에 비해 실리카와 결합된 니코틴에 노출된 폐에서 콜라겐 섬유 침착이 크게 증가한 것으로 나타났으며, 이는 Masson 염색 정량화에 의해 뒷받침되었습니다(그림 2). 실리카에 노출된 마우스에서 폐포 구조가 파괴되고 대식세포의 수가 증가했습니다. 그러나 실리카와 결합된 니코틴에 노출된 후 상당한 염증성 세포 침윤이 있었고 섬유아세포 결절이 나타났습니다. 또한, 축적된 대식세포, 특히 M2 대식세포는 이중 노출 그룹에 존재합니다. M2 대식세포는 규폐증의 진행된 섬유화 단계에 필수적입니다.
또한, 이중 노출된 마우스의 폐, 특히 림프관 근처의 염증 세포에서 면역조직화학(IHC) 염색에 의해 섬유화 전증 인자 TGF-β1의 상당한 증가가 관찰되었습니다(그림 3). 대식세포에서 분비되는 TGF-β1은 상피세포의 EMT와 폐섬유증을 촉진한다12. 실리카에 단독으로 노출된 쥐와 비교했을 때, 이중 노출 쥐의 폐에서 비멘틴 수치가 현저하게 높아졌습니다. IHC 염색 및 단백질 정량화 모두 이중 노출 마우스에서 심각한 EMT를 나타냈습니다(그림 4). 결합된 증거는 만성 실리카 노출이 TGF-β1의 상향 조절 후 EMT를 촉진하여 섬유아세포와 진행성 섬유증의 증가로 이어진다는 것을 시사합니다. 동시에 니코틴을 첨가하면 EMT를 악화시켜 폐 섬유증 과정을 가속화하여 폐 섬유증이 더 일찍 나타날 수 있습니다. 이 모델은 인간의 만성 실리카 노출의 결과인 폐 섬유증에 대한 니코틴의 영향을 탐구하기 위해 고안되었습니다.
그림 1: 생쥐의 니코틴과 실리카에 대한 결합 노출의 실험 모델 설계. 1-40일 동안 니코틴을 지속적으로 주입하고 5-19일 동안 실리카를 지속적으로 비강 점안합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 니코틴은 실리카에 노출된 쥐의 폐에서 섬유아세포 덩어리 형성을 촉진합니다. (A) HE 염색은 폐의 병리학적 변화를 시각화하는 데 사용되었습니다. 이중 노출된 마우스는 심각한 염증성 세포 침윤과 섬유증을 보였다. 녹색 화살표는 염증성 세포 덩어리를 나타냅니다. 척도 막대 = 50 μm. (B) 폐의 콜라겐 섬유를 보여주기 위해 Masson 염색을 사용했습니다. 눈금 막대 = 50 μm. (C) 폐의 콜라겐 섬유 정량화. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 니코틴과 실리카를 이중으로 노출한 쥐의 폐에서 CD206 양성 세포와 TGF-β1 증가. (A) CD206의 IHC 염색을 사용하여 이중 노출 마우스에서 대식세포의 분포 및 발현을 관찰했습니다. CD206 양성 대식세포는 니코틴과 실리카에 노출된 후 쥐의 폐에서 증가했습니다. 짧은 화살표는 CD206 양성 세포를 나타냅니다. 척도 막대 = 50 μm. (B) 섬유증의 촉진제인 TGF-β1은 이중 노출된 마우스에서 상승되었습니다. 긴 화살표는 TGF-β1 양성 세포를 나타냅니다. 눈금 막대 = 50μm. (C,D) CD206 및 TGF-β1의 AOD. AOD = IOD(통합 광학 밀도)/면적. AOD는 단위 면적당 CD206 및 TGF-β1의 농도를 반영합니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 약어: TGF-β1 = 형질전환 성장 인자-베타; IHC = 면역조직화학; AOD = 평균 광학 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: EMT의 악화를 통한 실리카에 노출된 마우스의 니코틴에 의한 폐 섬유증 촉진. (A) 각 그룹에서의 비멘틴의 발현은 IHC 염색에 의해 관찰되었다. 비멘틴은 니코틴과 실리카에 노출된 쥐의 폐에서 강하게 발현되었습니다. 척도 막대 = 50μm.(B) 이중 노출된 마우스의 폐 조직에서 비멘틴이 증가한 각 노출 그룹에서 비멘틴 발현의 웨스턴 블롯. (C) 비멘틴의 AOD 값은 다른 그룹에 비해 이중 노출 그룹에서 유의하게 더 높았다. (D) GAPDH와 비교한 비멘틴의 상대적 단백질 발현 수준. 이중 노출 그룹의 비멘틴 발현은 니코틴 또는 실리카 노출 그룹보다 유의하게 높았습니다. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. 약어: EMT = 상피-중간엽 전이; AOD = 평균 광학 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이중 노출 동물 모델은 니코틴과 결정질 이산화규소에 대한 동시 노출의 역할과 잠재적 메커니즘을 조사하는 데 필요합니다. 이 모델은 니코틴의 피하 주사와 실리카의 비강 점적을 통해이 연구에서 달성되었습니다. 성공적인 니코틴 주입을 보장하려면 목 뒤의 피부를 잡는 것이 고통스러울 수 있으므로 작업자는 쥐를 잡는 데 익숙해져야 합니다. 따라서 쥐가 잡는 것에 점차적으로 적응하도록 하는 것이 중요합니다. 또한 생쥐의 실리카 노출에서 중요한 단계는 비강 점적입니다. 시술의 성공률과 생쥐의 생존율을 높이기 위해서는 사전에 비강 점액을 연습하는 것이 필수적입니다.
주사를 수행할 때 주사기를 쥐의 머리 위로 훑어내어 쥐가 주사기를 볼 때 강한 몸부림을 피해야 합니다. 오른손으로 쥐의 꼬리를 단단히 잡고 왼손으로 목 뒤의 귀 가장자리까지 피부를 조심스럽게 부드럽게 밀어 올려 피부를 꼬집어야 합니다. 오른손으로 쥐의 꼬리를 놓은 후 꼬리와 뒷다리는 왼손 엄지와 약지를 사용하여 안정시켜 물지 않도록 해야 합니다. 오른손에 1mL 주사기를 사용하여 바늘을 머리에서 꼬리 방향으로 30° 각도로 목 위의 느슨한 피부에 삽입해야 합니다. 저항이 사라진 후 바늘을 약간 빼야 하며 주사는 천천히 고르게 투여해야 합니다. 5-19일째에, 이중 노출된 그룹의 마우스는 니코틴과 실리카에 노출되었습니다. 니코틴은 오전 08:00에 주사한 후 오후 14:00에 이산화규소를 비강에 주사하고 오후 20:00에 니코틴을 다시 주사하는 것이 좋습니다. 두 개의 니코틴 주사는 쥐에 대한 반복적인 움켜쥐기의 효과를 피하기 위해 12시간 간격으로 주어져야 합니다.
피하 주사 및 점적 시술은 몇 가지 기술적인 문제를 안고 있습니다. 피하 주사의 경우 마우스를 적절한 힘으로 잡아야 합니다. 목 뒤쪽의 피부를 너무 꽉 조이면 쥐의 기도가 막혀 빠르게 질식합니다. 최적의 강도를 위해 안구가 약간 튀어나올 때까지 목 뒤쪽의 피부를 꼬집어야 합니다. 이때 쥐는 통증이 가장 적고 부드럽게 숨을 쉰다. 또한 공기를 비운 1mL 주사기를 사용하여 튜브에서 니코틴 주사를 뽑은 다음 0.1-0.2mL의 공기를 추가로 주입해야 합니다. 주입하기 전에 거품을 부드럽게 튕겨내야 합니다. 주사의 양이 적기 때문에 바늘 끝에 남아있는 니코틴은 투여량이 부족 할 수 있습니다. 주사의 핵심 부분은 바늘을 빠르게 삽입하고, 니코틴을 천천히 주입하고, 바늘을 부드럽게 제거하는 것입니다. 비강 점적의 경우, 이 연구에서는 쥐의 비강을 깊은 마취 하에 완전히 노출시킨 후 이산화규소 현탁액을 느리고 균일하게 주입했습니다. 실리카에 노출된 후 기침이나 질식을 피하기 위해 흉강을 부드럽게 누르는 것도 중요합니다.
이 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 실험에 사용된 1-5μm 실리카 입자는 환경에서 수집되지 않았으며 순수한 실리카 입자였습니다. 대조적으로, 실제 직업 환경에서 작업자는 세라믹 공장이나 탄광의 석탄과 실리카 먼지의 혼합물과 같은 실리카 입자뿐만 아니라 다양한 위험 물질에 노출될 수 있습니다. 비강 점안 실리카를 사용하여 저용량을 달성하고 반복적인 다중 노출을 통해 작업자의 만성 노출을 시뮬레이션했습니다. 이중 노출 마우스 모델에서 니코틴은 담배 연기 노출로 인해 나오지 않지만 주입된 니코틴은 혈류로 직접 들어가 규폐증 과정에서 니코틴의 역할과 담배 연기의 다른 성분의 영향을 피하는 데 보다 집중적으로 탐구할 수 있습니다.
규폐증에 대한 과학적 연구는 일반적으로 질병 발병에서 실리카의 역할을 평가하기 위해 실리카의 흡입 또는 기관지 관류를 통해 단일 요인 마우스 모델을 활용했습니다. 대안적인 접근법은 이산화규소의 비강 점안인데, 이는 간단하고 쉬우며 반복적이고 만성적인 실리카 노출 모델(13)을 확립할 수 있다. 잘 정립된 이산화규소 비강 점적 모델은 마우스에 최소한의 손상을 입히고 다른 요인과 결합하여 다중 요인 노출 동물 모델을 만들 수 있습니다. 또한, 마우스에서 니코틴에 노출되는 주요 방법으로는 식수 내 니코틴, 니코틴의 피하 주입, 삼투압 미니펌프 를 통한 니코틴 주입, 담배 연기 노출등이 있다 14. 이중 노출 모델에 사용된 피하 주사를 통해 니코틴의 투여량과 타이밍을 정확하게 설정할 수 있어 각 마우스에 동일한 용량이 투여되도록 할 수 있습니다.
요컨대, 실리카 노출과 결합된 니코틴의 동물 모델은 현실적인 만성 노출 패턴을 복제하며, 이 모델은 규폐증 발병에서 니코틴이 염증 및 섬유증에 미치는 영향에 대한 추가 조사에 활용될 수 있습니다. 또한 이 모델은 여러 용량과 시간 프레임으로 이중 노출 동물 모델을 형성하기 위한 기초 역할을 합니다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 안후이성 대학 시너지 혁신 프로그램(GXXT-2021-077)과 안후이 과학기술 대학 대학원 혁신 기금(2021CX2120)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
