Summary
Este estudo descreve um modelo murino para estudar o efeito sinérgico da nicotina na progressão da fibrose pulmonar em camundongos silicose experimentais. O modelo de camundongo de dupla exposição simula a progressão patológica no pulmão após exposição simultânea à nicotina e à sílica. Os métodos descritos são simples e altamente reprodutíveis.
Abstract
O tabagismo e a exposição à sílica são comuns entre os trabalhadores ocupacionais, e a sílica tem maior probabilidade de lesar os pulmões de fumantes do que de não fumantes. O papel da nicotina, o principal ingrediente aditivo do cigarro, no desenvolvimento da silicose não está claro. O modelo de camundongo empregado neste estudo foi simples e de fácil controle, simulando efetivamente os efeitos da ingestão crônica de nicotina e da exposição repetida à sílica sobre a fibrose pulmonar através da transição epitélio-mesenquimal em seres humanos. Além disso, esse modelo pode auxiliar no estudo direto dos efeitos da nicotina sobre a silicose, evitando os efeitos de outros componentes na fumaça do cigarro.
Após adaptação ambiental, camundongos foram injetados por via subcutânea com 0,25 mg/kg de solução de nicotina na pele frouxa do pescoço todas as manhãs e noites, em intervalos de 12 h durante 40 dias. Além disso, o pó de sílica cristalina (1-5 μm) foi suspenso em solução salina normal, diluído em uma suspensão de 20 mg/mL e dispersado uniformemente em banho-maria ultrassônico. Os camundongos anestesiados com isoflurano inalaram 50 μL dessa suspensão de poeira de sílica pelo nariz e foram acordados via massagem torácica. A exposição à sílica foi administrada diariamente nos dias 5-19.
O modelo de camundongo duplamente exposto foi exposto à nicotina e, em seguida, à sílica, o que coincide com o histórico de exposição dos trabalhadores expostos a ambos os fatores prejudiciais. Além disso, a nicotina promoveu fibrose pulmonar através da transformação epitélio-mesenquimal (EMT) em camundongos. Este modelo animal pode ser utilizado para estudar os efeitos de múltiplos fatores no desenvolvimento da silicose.
Introduction
A exposição à sílica em trabalhadores é inevitável em alguns ambientes ocupacionais e, uma vez expostos à sílica, a deterioração progride mesmo após a remoção do ambiente. Além disso, a maioria desses trabalhadores fuma, e os cigarros tradicionais contêm milhares de produtos químicos, sendo o principal componente viciante a nicotina1. Os cigarros eletrônicos estão se tornando cada vez mais populares nas faixas etárias mais jovens2; Esses cigarros eletrônicos atuam como um sistema de liberação de nicotina e aumentam o acesso à nicotina, aumentando a suscetibilidade pulmonar e a pneumonia3. A fumaça do cigarro também acelera a fibrose pulmonar em camundongos expostos à bleomicina4 e aumenta a toxicidade pulmonar e a fibrose em camundongos expostos à sílica 5,6. No entanto, ainda precisa ser investigado se a nicotina pode afetar o processo inflamatório e de fibrose pulmonar causado pela sílica.
O modelo de silicose em camundongos estabelecido pela inalação única de uma alta dose de sílica na traqueia é traumático para camundongos. Embora esse método forneça rapidamente um modelo de silicose, ele não corresponde à realidade de um ambiente onde os trabalhadores são repetidamente expostos à sílica. Portanto, estabelecemos um modelo de camundongo exposto à sílica dando repetidamente uma baixa dose de suspensões de sílica por gotejamento nasal; Esta dose pode causar inflamação e fibrose em ratinhos.
Para contornar os efeitos de outros componentes do cigarro, este modelo de camundongo foi injetado com nicotina por via subcutânea na pele frouxa do pescoço para determinar o efeito do componente aditivo, a nicotina, sobre a silicose. Através da administração de injeções subcutâneas, é possível obter uma dosagem precisa, tornando possível criar modelos de exposição à nicotina e observar as respostas dose-toxicidade, bem como a dependência. Um modelo de dependência de nicotina foi desenvolvido em camundongos machos, com uma dose de injeção de nicotina de 0,2-0,4 mg/kg 7,8. Nesse modelo, para atender às necessidades de busca de drogas dos camundongos viciados, duas injeções subcutâneas foram administradas em intervalos de 12 horas. Este modelo de dependência de nicotina em camundongos é útil para simular hábitos humanos de tabagismo e exposição à sílica.
Modelos animais de fator único têm limitações em estudos de doenças, enquanto o método descrito aqui envolve um modelo de camundongo de dois fatores de co-exposição à nicotina e à sílica. Antes da exposição à sílica, os camundongos foram pré-expostos à nicotina para replicar a exposição à nicotina em pessoas que fumam. Posteriormente, a exposição à sílica ocorreu do dia 5 ao dia 19 para imitar a exposição à sílica em um ambiente de trabalho para indivíduos com história de tabagismo.
Macrófagos alveolares são conhecidos por desempenhar um papel significativo na regulação da inflamação pulmonar e fibrose. Os macrófagos não conseguem quebrar a sílica após a inalação de sílica, levando à polarização ou apoptose dos macrófagos9 e à liberação de citocinas como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e o fator transformador de crescimento beta (TGF-β). Os macrófagos M1, identificados pela presença do marcador de superfície CD86, são os principais instigadores da resposta inflamatória na silicose, enquanto os macrófagos M2, marcados pelo CD206, são responsáveis pela fase fibrótica doquadro10. Em camundongos duplamente expostos, a nicotina induziu a polarização de macrófagos em direção ao fenótipo M2 em pulmões lesados por sílica, promovendo fibrose pulmonar. Além disso, o TGF-β1 é fundamental para a indução de fibrose e EMT11; o aumento da expressão de TGF-β1 acelerou a progressão da fibrose pulmonar através da EMT. Esse modelo analisou com sucesso os efeitos da nicotina sobre a silicose e destacou ainda mais a importância da cessação da nicotina.
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Protocol
Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes emitidas pelo National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (a 8ª edição do NRC) e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui.
1. Preparo dos animais
- Casa 32 camundongos C57/BL6 machos com 8 semanas de idade em laboratório com ciclo claro/escuro de 12 h. Certifique-se de que os ratos tenham livre acesso a comida e água.
- Após 2 semanas de aclimatação ao ambiente, quando os camundongos de 10 semanas pesam 23-26 g, utilizar números aleatórios gerados por computador para agrupar aleatoriamente os animais sem partição, resultando em quatro grupos de camundongos: grupo controle (Con), grupo nicotina (Nic), grupo sílica (SiO 2) e grupo nicotina combinada com sílica (Nic+ SiO2).
2. Preparação da nicotina
NOTA: A densidade de nicotina é de 1,01 g/mL.
- Dissolver a nicotina em etanol anidro e diluir 20x para preparar uma solução-estoque de nicotina de 50 mg/mL.
- Diluir a solução-mãe de nicotina 1.000x com soro fisiológico normal estéril para fazer uma solução de trabalho na concentração de 0,05 mg/mL.
NOTA: Guarde a nicotina longe da luz. A solução-mãe pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
3. Preparação de sílica
- Suspender a sílica cristalina estéril em solução salina para preparar uma suspensão de sílica de 20 mg/mL e oscilá-la em banho-maria de agitação ultrassônica por 25 min.
- Agitar a suspensão de sílica com um oscilador de vórtice por 3 minutos antes que os camundongos recebam o gotejamento nasal. Misture a suspensão de sílica pipetando para cima e para baixo 2x-3x com uma pipeta de 200 μL e, em seguida, tome 50 μL para o gotejamento nasal.
NOTA: A suspensão de dióxido de silício deve ser misturada e administrada por gotejamento nasal o mais rápido possível.
4. Captura de camundongos e exposição à nicotina
- Pese os ratos e registre os pesos diariamente antes da exposição.
- Nos dias 1-40, injetar nicotina por via subcutânea duas vezes ao dia (intervalo de 12 h) nos camundongos dos grupos Nic e Nic+ SiO2 . Utilizar dose de nicotina de 0,25 mg/kg; Por exemplo, certifique-se de que um rato com 25 g de nicotina receba 6,25 μg de nicotina. Para este camundongo, o volume de injeção seria o seguinte: 6,25/0,05 = 125 μL. Simultaneamente, injetar os camundongos do grupo Con com um volume igual de solução salina.
- Prepare as seringas de 1 mL necessárias para cada grupo e use-as para aspirar o volume de injeção de nicotina ou soro fisiológico. Antes de tomar a nicotina, primeiro retire 0,1-0,2 mL de ar para dentro da seringa e, em seguida, retire 125 μL de nicotina. Bata cuidadosamente na seringa para encher a agulha e a extremidade frontal da seringa com a nicotina. Coloque a seringa contendo nicotina numa bandeja protegida da luz.
NOTA: No momento da injeção, 0,1-0,2 mL de ar está situado atrás da nicotina, garantindo que todo o líquido seja administrado com sucesso ao camundongo. - Segure a cauda do rato com a mão direita e, quando o animal relaxar, use o polegar e o indicador esquerdos para pressionar a pele na parte de trás do pescoço da cauda até a cabeça até a borda da orelha, aplicando pressão moderada. Depois disso, solte a mão direita e use o polegar pequeno esquerdo e o dedo anelar para beliscar a cauda e os membros posteriores, momento em que o mouse será completamente imobilizado pela mão esquerda.
NOTA: Segure o mouse com a força apropriada. A força insuficiente facilita a mordida dos ratos, enquanto a força excessiva pode resultar na asfixia dos ratos. - Usando a mão direita para injetar, puncione a pele na parte de trás do pescoço perto da borda da orelha dos ratos em uma direção cabeça-cauda com a seringa e injete com nicotina em uma taxa uniforme. Procure uma protuberância de pele semicircular que indique uma injeção bem-sucedida.
NOTA: Quando a agulha perfurou a pele, haverá uma sensação de resistência; A resistência desaparece após a inserção da agulha. Neste ponto, a agulha precisa ser ligeiramente retirada para injetar lenta e uniformemente.
5. Exposição à sílica in vivo
- Nos dias 5-19, instilar a suspensão de dióxido de silício na cavidade nasal dos camundongos dos grupos SiO 2 e Nic+ SiO2. Anestesiar rapidamente cada camundongo com isoflurano a 2% em aparelho de anestesia na dose de 3,6 mL/h. Após a anestesia, coloque o mouse na palma de uma das mãos e exponha a cavidade nasal do camundongo. Instilar 50 μL de suspensão de sílica na cavidade nasal dentro de 4-8 s.
- Para permitir que a suspensão de sílica entre nos pulmões o mais rápido possível, após a instilação, pressione o coração do mouse suavemente com o dedo indicador por 3-5 s, 3x-5x por segundo, para promover sua frequência respiratória.
- Depois que a respiração do camundongo gradualmente se tornar uniforme, coloque o camundongo em uma gaiola para observar por 3 min.
- Para todos os ratos que recebem a suspensão de sílica, repita os passos 1-3. No grupo controle, instilar 50 μL de solução salina estéril na cavidade nasal nos dias 5-19.
6. Aquisição de tecidos pulmonares frescos e fixos
- No dia 41, usar 50 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar os camundongos por via intraperitoneal na dose de 0,1 mL/20 g de acordo com o peso corporal. Fixe os membros em uma placa de teste de espuma e borrife o pelo com álcool 75%.
- Realizar perfusão cardíaca para obter tecido pulmonar fresco, cortar a linha média do abdome para expor a cavidade torácica e fazer uma pequena abertura no ápice do coração direito. Em seguida, injete 20 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-resfriada lenta e uniformemente a partir do ápice do coração esquerdo, fazendo com que o sangue flua para fora da abertura criada no ápice do coração direito. Retire todo o lóbulo pulmonar, coloque-o em um tubo de centrífuga de 1,5 mL pré-resfriado e transfira para -80 °C para armazenamento enquanto aguarda a extração da proteína.
- Perfundir outros camundongos com 20 mL de PBS pré-resfriado seguido de 10 mL de paraformaldeído a 4% no mesmo local para fixar pulmões inteiros; preservar cada pulmão em 30 mL de AGP a 4%.
- Após 72 h, embutir os tecidos pulmonares fixados em parafina.
- Imergir o tecido pulmonar no fixador preparado em banho-maria ultrassônico a 40 °C por 30 min, seguido de um processo de desidratação em etanol 75%, etanol 95% e etanol anidro por 50 min cada.
- Lave 2x com xileno por 50 min cada.
- Colocar o tecido em cera de parafina derretida a 55-60 °C durante 2-3 h para que o xileno no tecido pulmonar seja gradualmente substituído por cera de parafina.
- Fixe o tecido pulmonar na estrutura de incorporação com parafina e aguarde o endurecimento do bloco de cera. Depois que o bloco de cera endurecer, use a máquina de secção em parafina para cortar o pulmão a 4-5 μm.
- Colocar os cortes pulmonares em água ultrapura a 45 °C. Uma vez derretida a parafina, carregue a seção pulmonar em uma lâmina de microscópio aderente.
7. Coloração pela hematoxilina e eosina (HE)
- Asse as lâminas a 60 °C por 2 h e coloque as lâminas em xileno para desencenar por 2 x 30 min. Em seguida, colocar as lâminas em etanol anidro, etanol 95%, etanol 85% e etanol 75% por 5 min cada. Finalmente, lave-os por 3 x 5 min com água ultrapura.
- Lançar 50 μL de solução corante de hematoxilina no tecido pulmonar com um pistolador de pipeta e corar por 5 min; Em seguida, lave as fatias com água corrente por 5 min.
- Adicionar 50 μL de ácido clorídrico a 2% em etanol sobre a secção e enxaguar com água destilada durante 30 s. Em seguida, adicione 50 μL de solução corante de eosina no tecido pulmonar para corar por 1 minuto.
- Desidrate, transparenteize e sele as seções de parafina.
- Adicionar 100-150 mL de etanol 75%, etanol 85%, etanol 95%, etanol anidro e xileno em um tanque de tingimento plástico combinado. Coloque as lâminas em etanol anidro 75%, 85%, 95% e anidro por 5 min cada para desidratar.
- Em seguida, coloque as lâminas em xileno por 5 min para transparente.
- Finalmente, solte 20 μL de goma neutra na seção pulmonar e coloque uma lamínula sobre a lâmina para selá-la.
NOTA: As etapas acima são realizadas à temperatura ambiente.
8. Coloração de Masson
- Desparafinar, hidratar e lavar as secções de parafina, conforme descrito no passo 7.1.
- Manchar os cortes com 50 μL de solução de coloração de hematoxilina de Weigert configurada por 7 min, seguido de 50 μL de solução de fracionamento de etanol ácido por 10 s, e lavar com água corrente para tornar os núcleos azuis.
- Manchar os cortes com 50 μL de solução tricrômico de Masson por 4 min e lavar com água.
- Lave as seções com água destilada por 1 min e, em seguida, core com ácido vermelho de Lichun magenta por 7 min.
- Lave as seções com uma solução de trabalho de ácido fraco (ácido clorídrico a 30%) por 1-2 min, solução de ácido fosfomolíbdico por 1-2 min e solução de trabalho de ácido fraco por 1-2 min.
- Manchar as secções em solução corante de azul de anilina durante 2 minutos e, em seguida, lavar com uma solução de trabalho de ácido fraco durante 1 minuto.
- Desidratar as seções com etanol 95% seguido de etanol anidro por 1 s, transparenteizar com xileno por 1 s e, finalmente, selar com resina neutra conforme descrito na etapa 7.4.
9. Imuno-histoquímica
- Asse as fatias a 60 °C por 6 h. Desparafinar, hidratar e lavar as secções de parafina, conforme descrito no passo 7.1.
- Recuperação de antígeno: coloque as fatias em uma caixa de corte de plástico resistente ao calor contendo solução de recuperação de antígeno citrato suficiente para submergir as fatias e ferva por 20-30 min.
- Resfriar até a temperatura ambiente, remover as seções e enxaguar com água deionizada. Em seguida, mergulhe por 2 x 5 min em PBS contendo 0,5% de Tween-20 (PBST).
- Desenhe um laço perto da seção pulmonar na lâmina com uma caneta hidrofóbica para formar um círculo hidrofóbico.
- Adicionar 50 μL de solução de peróxido de hidrogênio a 3% (3%H 2 O2) gota a gota aos cortes, e incubar por 15 min à temperatura ambiente protegida da luz para a inativação da peroxidase endógena.
- Deixe as fatias de molho em PBST por 3 x 5 min.
- Adicionar 50 μL de proteína de soro bovino (BSA)-PBST a 5% às fatias e bloquear por 1 h à temperatura ambiente.
- Eliminar a solução de bloqueio, adicionar 50 μL dos anticorpos primários diluídos CD206 (diluição: 1:1.500), TGF-β1 (diluição: 1:200) e vimentina (diluição: 1:2.000) gota a gota às fatias e incubar durante a noite a 4 °C.
NOTA: Neste trabalho, todos os anticorpos foram diluídos em BSA a 5%. - No dia seguinte, retornar as fatias à temperatura ambiente (40 min). Lavar as fatias conforme descrito no passo 9.6.
- Diluir o anticorpo secundário em BSA a 5%. Adicionar 50 μL de anticorpo secundário marcado com peroxidase de raiz forte (diluição: 1:500) gota a gota e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Lavar as fatias conforme descrito no passo 9.6.
- Lançar 50 μL da solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) correspondente ao anticorpo secundário marcado com enzima no tecido pulmonar e incubar por 5-10 min em uma caixa úmida imunoistoquímica preta. Observe ao microscópio até que a cor evolua para um marrom forte. Enxágue as fatias com água destilada para finalizar a reação.
NOTA: A coloração marrom é considerada positiva. - Corar com 50 μL de coloração de hematoxilina por 30 s, e lavar com água corrente. Em seguida, mergulhe as fatias em etanol anidro 75%, 85%, 95% e anidro por 3 min cada e depois em xileno por 2 x 10 min. Selar as lâminas conforme descrito na etapa 7.4.
10. Análise de Western blot
- Retire o tecido pulmonar do congelador e pese-o. Em seguida, adicionar 150 μL de tampão de lise RIPA contendo PMSF por 20 mg de tecido pulmonar. Lisar os pulmões de camundongos em gelo por 3-5 min usando um homogeneizador portátil, agitar suavemente por 2 h a 4 °C para permitir lise adequada do tecido pulmonar, centrifugar a 4 °C e 14.800 × g por 15 min e coletar o sobrenadante.
NOTA: Adicione 100 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilfluoreto (PMSF) alguns minutos antes de usar o tampão de lise RIPA. A concentração final de PMSF é de 1 mM (por exemplo, 10 μL de PMSF + 990 μL de RIPA). - Use um kit de concentração de proteína BCA para determinar a concentração de proteína da amostra seguindo as instruções do fabricante. Após a determinação, utilizando a menor concentração de lisado proteico como base, diluir o mesmo lote de lisado proteico com RIPA até à menor concentração para atingir a mesma massa e volume.
NOTA: A quantidade total de carga de tecido pulmonar é de 30 μg. - Adicionar 40 μL de tampão de carga 5x a 160 μL de lisado proteico e aquecer a 100 °C durante 10 min.
- Montar o gel preparado para eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio a 10% (SDS-PAGE) no sistema de eletroforese por western blotting, adicionar o tampão de eletroforese SDS-PAGE, retirar suavemente o pente de eletroforese e adicionar 20 μL de amostra de proteína por poço lenta e uniformemente. Ligue a alimentação e inicie a eletroforese a 80 V por 30 min. Depois que as proteínas atingirem a camada inferior de gel, mude para 100 V e continue a eletroforese por 60-70 min.
NOTA: A eletroforese necessita de novo tampão de eletroforese. - Transferir as proteínas para uma membrana de PVDF por transferência úmida. Ativar a membrana de PVDF com metanol antecipadamente (5-30 s). Retire a placa de gel de eletroforese, abra-a cuidadosamente, coloque o gel separador no tampão de transferência úmido, faça o sanduíche de transferência elétrica e monte o sistema de transferência úmida. Encha o tanque de eletroforese com tampão de transferência e transfira a 400 mA por 90 min.
NOTA: O buffer de transferência é resfriado com antecedência para evitar os efeitos de altas temperaturas durante a transferência úmida. - Lavar a membrana de PVDF com solução salina tamponada com Tris com Tween-20 a 0,5% (TBST) por 3 x 5 min. Bloquear a membrana de PVDF com 5% de leite desnatado diluído em TBST e incubar em um agitador à temperatura ambiente por 60 min; em seguida, lave com TBST por 2 min. Após a lavagem, incubar a membrana durante a noite a 4 °C com o anticorpo primário vimentina (1:5.000) e GAPDH (1:10.000) diluídos em BSA a 5%.
- Coloque a membrana à temperatura ambiente por 30 min e lave com TBST por 5 x 5 min. Após a lavagem, incubar a membrana com o anticorpo secundário (1:10.000) diluído em leite desnatado a 5% por 60 min à temperatura ambiente.
- Coloque a membrana, do lado da proteína para cima, solte a solução de trabalho preparada da ECL, incube por 1-2 minutos e observe os resultados com um imageador de gel. Use os valores de escala de cinza medidos pelo software no imageador de gel para avaliar os níveis de expressão de proteínas.
NOTA: Aqui, o GAPDH serviu como referência interna.
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Representative Results
Um modelo de camundongo para estudar nicotina combinada com exposição à sílica foi estabelecido para investigar o papel potencial da nicotina na progressão da silicose em camundongos. A Figura 1 mostra o procedimento experimental para o uso de um modelo de camundongo de dupla exposição, que emparelhou uma injeção de nicotina com a instilação nasal de uma suspensão de sílica. As alterações patológicas dos camundongos em cada grupo foram observadas pela coloração HE. Os camundongos expostos à nicotina combinada com sílica tiveram danos pulmonares significativamente mais graves do que aqueles expostos à nicotina ou à sílica isoladamente. Os linfócitos aumentaram perto dos vasos linfáticos nos pulmões dos camundongos expostos à nicotina, formando aglomerados de células inflamatórias. A coloração de Masson revelou um aumento significativo na deposição de fibras colágenas nos pulmões expostos à nicotina associada à sílica em comparação com os pulmões dos outros grupos, o que foi apoiado pela quantificação da coloração de Masson (Figura 2). A estrutura alveolar foi destruída nos camundongos expostos à sílica e o número de macrófagos aumentou. No entanto, após exposição à nicotina associada à sílica, houve infiltrado inflamatório significativo nas células, surgindo nódulos de fibroblastos. Além disso, macrófagos acumulados, especialmente macrófagos M2, presentes no grupo duplamente exposto. Os macrófagos M2 são essenciais para o estágio fibrótico avançado da silicose.
Além disso, um aumento significativo no fator pró-fibrótico TGF-β1 foi observado pela coloração imunoistoquímica (IHQ) nos pulmões de camundongos duplamente expostos, especialmente em células inflamatórias próximas aos vasos linfáticos (Figura 3). O TGF-β1 secretado por macrófagos promove a EMT de células epiteliais e fibrose pulmonar12. Em comparação com camundongos expostos apenas à sílica, os níveis de vimentina foram significativamente elevados nos pulmões de camundongos de dupla exposição. Tanto a coloração por IHQ quanto a quantificação de proteínas indicaram EMT grave em camundongos duplamente expostos (Figura 4). As evidências combinadas sugerem que a exposição crônica à sílica promove EMT após a suprarregulação do TGF-β1, levando a um aumento de fibroblastos e fibrose progressiva. Ao mesmo tempo, a adição de nicotina acelera o processo de fibrose pulmonar, agravando a EMT, permitindo que a fibrose pulmonar apareça mais cedo. Este modelo foi projetado para explorar o impacto da nicotina na fibrose pulmonar, que é uma consequência da exposição crônica à sílica em humanos.
Figura 1: Desenho de um modelo experimental de exposição combinada à nicotina e sílica em camundongos. Injeção contínua de nicotina por 1-40 dias e instilação nasal contínua de sílica por 5-19 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A nicotina promove a formação de massas fibroblásticas nos pulmões de camundongos expostos à sílica. (A) A coloração HE foi utilizada para visualizar alterações patológicas nos pulmões. Os camundongos duplamente expostos apresentaram infiltrado inflamatório e fibrose severa de células. As setas verdes indicam massas celulares inflamatórias. Barra de escala = 50 μm. (B) A coloração de Masson foi usada para mostrar fibras colágenas nos pulmões. Barra de escala = 50 μm. (C) Quantificação das fibras colágenas nos pulmões. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aumento de células CD206-positivas e TGF-β1 nos pulmões de camundongos com nicotina e sílica duplamente expostos. (A) A coloração IHQ de CD206 foi utilizada para observar a distribuição e expressão de macrófagos nos camundongos duplamente expostos. Macrófagos CD206-positivos aumentaram nos pulmões de camundongos após exposição combinada à nicotina e sílica. As setas curtas representam células CD206-positivas. Barra de escala = 50 μm. (B) O TGF-β1, um promotor de fibrose, estava elevado em camundongos duplamente expostos. As setas longas representam células positivas para TGF-β1. Barra de escala = 50 μm. (C,D) DAO de CD206 e TGF-β1. AOD = IOD (densidade óptica integrada)/área. A DAO reflete a concentração de CD206 e TGF-β1 por unidade de área. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abreviações: TGF-β1 = fator transformador de crescimento-beta; IHQ = imuno-histoquímica; AOD = densidade óptica média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Promoção da fibrose pulmonar pela nicotina em camundongos expostos à sílica através do agravamento da EMT. (A) A expressão de vimentina em cada grupo foi observada pela coloração IHQ. A vimentina foi fortemente expressa nos pulmões dos camundongos expostos à nicotina e à sílica. Barra de escala = 50 μm.(B) Western blot da expressão de vimentina em cada grupo de exposição, com aumento de vimentina nos tecidos pulmonares de camundongos duplamente expostos. (C) O valor de DAO da vimentina foi significativamente mais elevado no grupo duplamente exposto em comparação com os outros grupos. (D) O nível relativo de expressão proteica da vimentina em relação ao GAPDH. A expressão de vimentina no grupo de dupla exposição foi significativamente maior do que nos grupos de exposição à nicotina ou à sílica. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abreviações: EMT = transição epitélio-mesenquimal; AOD = densidade óptica média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um modelo animal de dupla exposição é necessário para investigar o papel e os mecanismos potenciais da exposição simultânea à nicotina e ao dióxido de silício cristalino. Este modelo foi alcançado neste trabalho através da injeção subcutânea de nicotina e do gotejamento nasal de sílica. Para garantir uma injeção de nicotina bem-sucedida, o operador tem que se familiarizar com agarrar os ratos, pois agarrar a pele na parte de trás do pescoço pode ser doloroso para eles. Portanto, permitir que os ratos se adaptem gradualmente à preensão é importante. Além disso, uma etapa crítica na exposição à sílica em camundongos é o gotejamento nasal. Para aumentar o sucesso do procedimento e a taxa de sobrevivência dos camundongos, é essencial praticar o gotejamento nasal previamente.
Ao realizar a injeção, a seringa deve ser passada sobre a cabeça do rato para evitar uma forte luta quando o rato vê a seringa. A cauda do rato deve ser firmemente agarrada com a mão direita, enquanto a mão esquerda deve ser usada para empurrar a pele até à margem da orelha na parte de trás do pescoço com cuidado e suavemente e para beliscar a pele lá. Depois de soltar a cauda do rato com a mão direita, a cauda e os membros posteriores devem ser estabilizados usando o polegar esquerdo e o dedo anelar para evitar a mordida. Usando uma seringa de 1 mL na mão direita, a agulha deve ser inserida na pele solta acima do pescoço em um ângulo de 30° na direção da cabeça para a cauda. A agulha deve ser retirada ligeiramente após a perda da resistência e a injeção deve ser administrada de forma lenta e uniforme. Nos dias 5-19, os camundongos do grupo duplamente exposto foram expostos à nicotina e à sílica. Recomenda-se que a nicotina seja injetada às 08:00 horas, seguida do gotejamento nasal de dióxido de silício às 14:00 horas e outra injeção de nicotina às 14:00 horas. As duas injeções de nicotina devem ser administradas com 12 h de intervalo para evitar os efeitos de agarramento repetido nos ratos.
A realização de injeções subcutâneas e gotejamento nasal apresenta vários desafios técnicos. Para injeções subcutâneas, os camundongos devem ser agarrados com força apropriada. Se a pele na parte de trás do pescoço for apertada com muita força, as vias aéreas do rato serão bloqueadas, levando rapidamente à sufocação. Para uma força ideal, a pele na parte de trás do pescoço deve ser pinçada até que os globos oculares se projetem ligeiramente. Neste momento, o rato sente a dor mais baixa e respira suavemente. Além disso, uma seringa de 1 mL esvaziada de ar deve ser usada para retirar a injeção de nicotina do tubo, seguida por mais 0,1-0,2 mL de ar. Antes de injetar, as bolhas devem ser suavemente agitadas para fora. Devido ao pequeno volume da injeção, a nicotina deixada na ponta da extremidade da agulha pode levar a uma dose insuficiente. As partes principais da injeção são inserir a agulha rapidamente, injetar a nicotina lentamente e remover a agulha suavemente. Para gotejamento nasal, neste estudo, a cavidade nasal dos camundongos foi totalmente exposta sob anestesia profunda, seguida da instilação lenta e uniforme de uma suspensão de dióxido de silício. Também é importante pressionar suavemente a cavidade torácica após a exposição à sílica para evitar tosse ou sufocamento.
Este modelo tem algumas limitações. As partículas de sílica de 1-5 μm utilizadas nos experimentos não foram coletadas do ambiente e eram partículas de sílica pura. Em contraste, em ambientes ocupacionais reais, os trabalhadores podem ser expostos a uma variedade de materiais perigosos, não apenas partículas de sílica, como uma mistura de carvão e poeira de sílica em uma fábrica de cerâmica ou uma mina de carvão. Utilizou-se sílica de instilação nasal para obtenção de baixas doses e repetidas exposições múltiplas para simular a exposição crônica dos trabalhadores. No modelo de camundongo de dupla exposição, embora a nicotina não seja proveniente da exposição à fumaça do cigarro, a nicotina injetada entra diretamente na corrente sanguínea, permitindo uma exploração mais focada do papel da nicotina no processo de silicose e evitando os efeitos de outros componentes da fumaça do cigarro.
A pesquisa científica sobre silicose tem tipicamente utilizado modelos de camundongos de fator único, seja por inalação ou perfusão brônquica de sílica, para avaliar o papel da sílica no desenvolvimento de doenças. Uma abordagem alternativa é a instilação nasal de dióxido de silício, que é simples e fácil e permite o estabelecimento de modelos repetidos e crônicos de exposição àsílica13. O modelo bem estabelecido de gotejamento nasal de dióxido de silício causa danos mínimos aos camundongos e poderia ser combinado com outros fatores para criar um modelo animal multifatorialmente exposto. Além disso, os principais métodos de exposição à nicotina em camundongos incluem nicotina em água potável, injeção subcutânea de nicotina, infusão de nicotina por minibombas osmóticas e exposição à fumaça do tabaco14. A injeção subcutânea usada no modelo de dupla exposição permite que a dosagem e o tempo de nicotina sejam ajustados com precisão, garantindo que cada camundongo receba a mesma dose.
Em suma, o modelo animal de nicotina em combinação com exposição à sílica replica um padrão de exposição crônica real, e este modelo pode ser utilizado para investigações adicionais sobre os impactos da nicotina na inflamação e fibrose no desenvolvimento da silicose. Além disso, este modelo serve como base para a formação de um modelo animal de dupla exposição com múltiplas doses e períodos de tempo.
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Disclosures
Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Programa de Inovação de Sinergia Universitária da Província de Anhui (GXXT-2021-077) e pelo Fundo de Inovação de Pós-Graduação da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
