Summary

Uso de Nicotina em Modelo de Camundongo Exposto à Sílica para Promover a Transição Epitélio-Mesenquimal Pulmonar

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

Este estudo descreve um modelo murino para estudar o efeito sinérgico da nicotina na progressão da fibrose pulmonar em camundongos silicose experimentais. O modelo de camundongo de dupla exposição simula a progressão patológica no pulmão após exposição simultânea à nicotina e à sílica. Os métodos descritos são simples e altamente reprodutíveis.

Abstract

O tabagismo e a exposição à sílica são comuns entre os trabalhadores ocupacionais, e a sílica tem maior probabilidade de lesar os pulmões de fumantes do que de não fumantes. O papel da nicotina, o principal ingrediente aditivo do cigarro, no desenvolvimento da silicose não está claro. O modelo de camundongo empregado neste estudo foi simples e de fácil controle, simulando efetivamente os efeitos da ingestão crônica de nicotina e da exposição repetida à sílica sobre a fibrose pulmonar através da transição epitélio-mesenquimal em seres humanos. Além disso, esse modelo pode auxiliar no estudo direto dos efeitos da nicotina sobre a silicose, evitando os efeitos de outros componentes na fumaça do cigarro.

Após adaptação ambiental, camundongos foram injetados por via subcutânea com 0,25 mg/kg de solução de nicotina na pele frouxa do pescoço todas as manhãs e noites, em intervalos de 12 h durante 40 dias. Além disso, o pó de sílica cristalina (1-5 μm) foi suspenso em solução salina normal, diluído em uma suspensão de 20 mg/mL e dispersado uniformemente em banho-maria ultrassônico. Os camundongos anestesiados com isoflurano inalaram 50 μL dessa suspensão de poeira de sílica pelo nariz e foram acordados via massagem torácica. A exposição à sílica foi administrada diariamente nos dias 5-19.

O modelo de camundongo duplamente exposto foi exposto à nicotina e, em seguida, à sílica, o que coincide com o histórico de exposição dos trabalhadores expostos a ambos os fatores prejudiciais. Além disso, a nicotina promoveu fibrose pulmonar através da transformação epitélio-mesenquimal (EMT) em camundongos. Este modelo animal pode ser utilizado para estudar os efeitos de múltiplos fatores no desenvolvimento da silicose.

Introduction

A exposição à sílica em trabalhadores é inevitável em alguns ambientes ocupacionais e, uma vez expostos à sílica, a deterioração progride mesmo após a remoção do ambiente. Além disso, a maioria desses trabalhadores fuma, e os cigarros tradicionais contêm milhares de produtos químicos, sendo o principal componente viciante a nicotina1. Os cigarros eletrônicos estão se tornando cada vez mais populares nas faixas etárias mais jovens2; Esses cigarros eletrônicos atuam como um sistema de liberação de nicotina e aumentam o acesso à nicotina, aumentando a suscetibilidade pulmonar e a pneumonia3. A fumaça do cigarro também acelera a fibrose pulmonar em camundongos expostos à bleomicina4 e aumenta a toxicidade pulmonar e a fibrose em camundongos expostos à sílica 5,6. No entanto, ainda precisa ser investigado se a nicotina pode afetar o processo inflamatório e de fibrose pulmonar causado pela sílica.

O modelo de silicose em camundongos estabelecido pela inalação única de uma alta dose de sílica na traqueia é traumático para camundongos. Embora esse método forneça rapidamente um modelo de silicose, ele não corresponde à realidade de um ambiente onde os trabalhadores são repetidamente expostos à sílica. Portanto, estabelecemos um modelo de camundongo exposto à sílica dando repetidamente uma baixa dose de suspensões de sílica por gotejamento nasal; Esta dose pode causar inflamação e fibrose em ratinhos.

Para contornar os efeitos de outros componentes do cigarro, este modelo de camundongo foi injetado com nicotina por via subcutânea na pele frouxa do pescoço para determinar o efeito do componente aditivo, a nicotina, sobre a silicose. Através da administração de injeções subcutâneas, é possível obter uma dosagem precisa, tornando possível criar modelos de exposição à nicotina e observar as respostas dose-toxicidade, bem como a dependência. Um modelo de dependência de nicotina foi desenvolvido em camundongos machos, com uma dose de injeção de nicotina de 0,2-0,4 mg/kg 7,8. Nesse modelo, para atender às necessidades de busca de drogas dos camundongos viciados, duas injeções subcutâneas foram administradas em intervalos de 12 horas. Este modelo de dependência de nicotina em camundongos é útil para simular hábitos humanos de tabagismo e exposição à sílica.

Modelos animais de fator único têm limitações em estudos de doenças, enquanto o método descrito aqui envolve um modelo de camundongo de dois fatores de co-exposição à nicotina e à sílica. Antes da exposição à sílica, os camundongos foram pré-expostos à nicotina para replicar a exposição à nicotina em pessoas que fumam. Posteriormente, a exposição à sílica ocorreu do dia 5 ao dia 19 para imitar a exposição à sílica em um ambiente de trabalho para indivíduos com história de tabagismo.

Macrófagos alveolares são conhecidos por desempenhar um papel significativo na regulação da inflamação pulmonar e fibrose. Os macrófagos não conseguem quebrar a sílica após a inalação de sílica, levando à polarização ou apoptose dos macrófagos9 e à liberação de citocinas como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e o fator transformador de crescimento beta (TGF-β). Os macrófagos M1, identificados pela presença do marcador de superfície CD86, são os principais instigadores da resposta inflamatória na silicose, enquanto os macrófagos M2, marcados pelo CD206, são responsáveis pela fase fibrótica doquadro10. Em camundongos duplamente expostos, a nicotina induziu a polarização de macrófagos em direção ao fenótipo M2 em pulmões lesados por sílica, promovendo fibrose pulmonar. Além disso, o TGF-β1 é fundamental para a indução de fibrose e EMT11; o aumento da expressão de TGF-β1 acelerou a progressão da fibrose pulmonar através da EMT. Esse modelo analisou com sucesso os efeitos da nicotina sobre a silicose e destacou ainda mais a importância da cessação da nicotina.

Protocol

Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes emitidas pelo National Institutes of Health’s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (a 8ª edição do NRC) e foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui. 1. Preparo dos animais Casa 32 camundongos C57/BL6 machos com 8 semanas de idade em laboratório com ciclo claro/escuro de 12 h. Certifique-se de que os ratos tenham livre acesso a comi…

Representative Results

Um modelo de camundongo para estudar nicotina combinada com exposição à sílica foi estabelecido para investigar o papel potencial da nicotina na progressão da silicose em camundongos. A Figura 1 mostra o procedimento experimental para o uso de um modelo de camundongo de dupla exposição, que emparelhou uma injeção de nicotina com a instilação nasal de uma suspensão de sílica. As alterações patológicas dos camundongos em cada grupo foram observadas pela coloração HE. Os camun…

Discussion

Um modelo animal de dupla exposição é necessário para investigar o papel e os mecanismos potenciais da exposição simultânea à nicotina e ao dióxido de silício cristalino. Este modelo foi alcançado neste trabalho através da injeção subcutânea de nicotina e do gotejamento nasal de sílica. Para garantir uma injeção de nicotina bem-sucedida, o operador tem que se familiarizar com agarrar os ratos, pois agarrar a pele na parte de trás do pescoço pode ser doloroso para eles. Portanto, permitir que os ratos …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pelo Programa de Inovação de Sinergia Universitária da Província de Anhui (GXXT-2021-077) e pelo Fundo de Inovação de Pós-Graduação da Universidade de Ciência e Tecnologia de Anhui (2021CX2120).

Materials

10% formalin neutral fixative Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.
alcohol disinfectant Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.
BSA, Fraction V Beyotime Biotechnology ST023-200g
CD206 Monoclonal antibody Proteintech 60143-1-IG
Citrate Antigen Retrieval Solution biosharp life science BL619A
dimethyl benzene West Asia Chemical Technology (Shandong) Co
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime Biotechnology P0009
GAPDH Polyclonal antibody Proteintech 10494-1-AP
Hematoxylin and Eosin (H&E) Beyotime Biotechnology C0105S
HRP substrate Millipore Corporation P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Proteintech SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Proteintech SA00001-2
ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate Vector Laboratories SK-4103-100
Masson's Trichrome Stain Kit Solarbio G1340
Methanol Macklin
Nicotine Sigma N-3876
phosphate buffered saline (PBS)  Biosharp BL601A
Physiological saline  The First People's Hospital of Huainan City
PMSF Beyotime Biotechnological ST505
Positive fluorescence microscope OlympusCorporation BX53+DP74
Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder Beyotime Biotechnology P0071
PVDF membranes Millipore 3010040001
RIPA Lysis Buffer Beyotime Biotechnology P0013B
SDS-PAGE gel preparation kit Beyotime Biotechnology P0012A
Silicon dioxide Sigma #BCBV6865
TGF-β Bioss bs-0086R
Vimentin Polyclonal antibody Proteintech 10366-1-AP
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
0.5 mL Tube Biosharp BS-05-M
Oscillatory thermostatic metal bath Abson
Paraffin Embedding Machine Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. PBM-A
Paraffin Slicer Jinhua Kratai Instruments Co.
Pipettes Eppendorf
Polarized light microscope Olympus BX51
Precision Balance Acculab ALC-110.4
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system RSJ RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker Scilogex
Small animal anesthesia machine Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. ZL-04A
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1011
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1212
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1313
Vortex Mixers  VWR
Name of Material/ Equipment
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0

References

  1. Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
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Cite This Article
Chen, H., Li, B., Cao, H., Zhao, Y., Zou, Y., Wang, W., Mu, M., Tao, X. Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (193), e65127, doi:10.3791/65127 (2023).

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