Summary
Denna studie beskriver en musmodell för att studera den synergistiska effekten av nikotin på progressionen av lungfibros i experimentella silikosmöss. Musmodellen med dubbel exponering simulerar det patologiska förloppet i lungan efter samtidig exponering för nikotin och kiseldioxid. De beskrivna metoderna är enkla och mycket reproducerbara.
Abstract
Rökning och exponering för kiseldioxid är vanligt bland yrkesarbetare, och kiseldioxid är mer sannolikt att skada lungorna hos rökare än hos icke-rökare. Nikotinets roll, den primära beroendeframkallande ingrediensen i cigaretter, i utvecklingen av silikos är oklar. Musmodellen som användes i denna studie var enkel och lätt att kontrollera, och den simulerade effektivt effekterna av kroniskt nikotinintag och upprepad exponering för kiseldioxid på lungfibros genom epitelial-mesenkymal övergång hos människor. Dessutom kan denna modell hjälpa till med den direkta studien av nikotinets effekter på silikos samtidigt som man undviker effekterna av andra komponenter i cigarettrök.
Efter miljöanpassning injicerades möss subkutant med 0,25 mg/kg nikotinlösning i den lösa huden över halsen varje morgon och kväll med 12 timmars mellanrum under 40 dagar. Dessutom suspenderades kristallint kiseldioxidpulver (1-5 μm) i normal koksaltlösning, späddes till en suspension på 20 mg/ml och dispergerades jämnt med hjälp av ett ultraljudsvattenbad. De isofluransövda mössen andades in 50 μL av denna kvartsdammsuspension genom näsan och väcktes via bröstmassage. Exponering för kiseldioxid administrerades dagligen dag 5-19.
Den dubbelexponerade musmodellen exponerades för nikotin och sedan kiseldioxid, vilket stämmer överens med exponeringshistoriken för arbetare som exponeras för båda skadliga faktorerna. Dessutom främjade nikotin lungfibros genom epitel-mesenkymal transformation (EMT) hos möss. Denna djurmodell kan användas för att studera effekterna av flera faktorer på utvecklingen av silikos.
Introduction
Exponering för kvarts hos arbetstagare är oundviklig i vissa arbetsmiljöer, och när de väl har exponerats för kiseldioxid fortskrider försämringen även efter avlägsnandet från miljön. Dessutom röker de flesta av dessa arbetare, och traditionella cigaretter innehåller tusentals kemikalier, där den viktigaste beroendeframkallande komponenten är nikotin1. E-cigaretter blir allt populärare i yngre åldersgrupper2; Dessa e-cigaretter fungerar som ett nikotinleveranssystem och ökar tillgången till nikotin, vilket ökar lungkänsligheten ochlunginflammationen 3. Cigarettrök påskyndar också lungfibros hos bleomycinexponerade möss4 och ökar lungtoxicitet och fibros hos kiseldioxidexponerade möss 5,6. Huruvida nikotin kan påverka den inflammatoriska och lungfibrosprocess som orsakas av kiseldioxid återstår dock att undersöka.
Silikosmusmodellen som etablerades genom engångsinandning av en hög dos kiseldioxid i luftstrupen är traumatisk för möss. Även om denna metod snabbt ger en silikosmodell, stämmer den inte överens med verkligheten i en miljö där arbetare upprepade gånger utsätts för kiseldioxid. Därför etablerade vi en kiseldioxidexponerad musmodell genom att upprepade gånger ge en låg dos av kiseldioxidsuspensioner via ett näsdropp; Denna dos kan orsaka inflammation och fibros hos möss.
För att kringgå effekterna av andra cigarettkomponenter injicerades denna musmodell subkutant med nikotin i den lösa huden på halsen för att bestämma effekten av den beroendeframkallande komponenten, nikotin, på silikos. Genom att administrera subkutana injektioner kan noggrann dosering uppnås, vilket gör det möjligt att skapa modeller för nikotinexponering och observera dos-toxicitetsresponser samt beroende. En modell för nikotinberoende har utvecklats i hanmöss, med en nikotininjektionsdos på 0,2-0,4 mg/kg 7,8. I den modellen, för att tillgodose de drogsökande behoven hos de beroende mössen, administrerades två subkutana injektioner med 12 timmars mellanrum. Denna modell för nikotinberoende hos möss är användbar för att simulera mänskliga rökvanor och exponering för kiseldioxid.
Enfaktordjursmodeller har begränsningar i sjukdomsstudier, medan den metod som beskrivs här involverar en tvåfaktorsmusmodell av samexponering av nikotin och kiseldioxid. Före exponeringen för kiseldioxid var mössen förexponerade för nikotin för att replikera nikotinexponering hos personer som röker. Därefter ägde kiseldioxidexponering rum från dag 5 till dag 19 för att imitera kiseldioxidexponering i en arbetsmiljö för individer med en historia av rökning.
Alveolära makrofager är kända för att spela en viktig roll i regleringen av lunginflammation och fibros. Makrofager kan inte bryta ner kiseldioxid vid inandning av kiseldioxid, vilket leder till makrofagpolarisering eller apoptos9 och frisättning av cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) och transformerande tillväxtfaktor beta (TGF-β). M1-makrofager, som identifieras genom närvaron av ytmarkören CD86, är de primära anstiftarna av det inflammatoriska svaret vid silikos, medan M2-makrofager, som är markerade med CD206, är ansvariga för den fibrotiska fasen av tillståndet10. Hos dubbelexponerade möss inducerade nikotin polariseringen av makrofager mot M2-fenotypen i kiseldioxidskadade lungor, vilket främjade lungfibros. Dessutom är TGF-β1 nyckeln till induktion av fibros och EMT11; det ökade uttrycket av TGF-β1 påskyndade progressionen av lungfibros genom EMT. Denna modell analyserade framgångsrikt effekterna av nikotin på silikos och belyste ytterligare vikten av nikotinavvänjning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes i enlighet med de riktlinjer som utfärdats av National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (den 8:e upplagan av NRC) och godkändes av Anhui University of Science and Technology Animal Ethics Committee.
1. Beredning av djur
- Hus 32 C57/BL6-hanmöss i åldern 8 veckor i ett laboratorium med en 12 timmars ljus/mörker-cykel. Se till att mössen har fri tillgång till mat och vatten.
- Efter 2 veckors acklimatisering till miljön, när de 10 veckor gamla mössen väger 23-26 g, använd slumpmässiga tal som genereras av en dator för att slumpmässigt gruppera djuren utan uppdelning, vilket resulterar i fyra grupper av möss: kontrollgruppen (Con), nikotingruppen (Nic), kiseldioxidgruppen (SiO 2) och nikotinet kombinerat med kiseldioxidgruppen (Nic + SiO2).
2. Preparat av nikotin
OBS: Nikotindensiteten är 1,01 g/ml.
- Lös upp nikotinet i vattenfri etanol och späd 20 gånger för att bereda en nikotinstamlösning på 50 mg/ml.
- Späd nikotinlösningen 1 000 gånger med steril normal koksaltlösning för att göra en arbetslösning med en koncentration på 0,05 mg/ml.
OBS: Förvara nikotin borta från ljus. Stamlösningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 1 vecka.
3. Beredning av kiseldioxid
- Suspendera steril kristallin kvarts i koksaltlösning för att bereda en 20 mg/ml kiseldioxidsuspension och oscillera den i ett ultraljudsskakande vattenbad i 25 minuter.
- Skaka kiseldioxidsuspensionen med en virveloscillator i 3 minuter innan mössen får näsdropp. Blanda kiseldioxidsuspensionen genom att pipettera upp och ner 2x-3x med en 200 μL pipett och ta sedan upp 50 μL för näsdroppet.
OBS: Kiseldioxidsuspensionen ska blandas och administreras via näsdropp så snart som möjligt.
4. Musfångst och nikotinexponering
- Väg mössen och registrera vikterna dagligen före exponering.
- På dag 1-40, injicera subkutant nikotin två gånger dagligen (med 12 timmars mellanrum) i mössen i Nic- och Nic+ SiO2-grupperna . Använd en nikotindos på 0,25 mg/kg; Se till exempel till att en mus som väger 25 g får 6,25 μg nikotin. För den här musen skulle injektionsvolymen vara följande: 6,25/0,05 = 125 μL. Injicera samtidigt mössen i Con-gruppen med en lika stor volym saltlösning.
- Förbered de nödvändiga 1 ml sprutorna för varje grupp och använd dem för att aspirera injektionsvolymen av nikotin eller koksaltlösning. Innan du tar upp nikotinet, dra först in 0,1-0,2 ml luft i sprutan och dra sedan upp 125 μL nikotin. Knacka försiktigt på sprutan för att fylla nålen och sprutans främre ände med nikotin. Placera sprutan som innehåller nikotin i en ljusskyddad bricka.
OBS: Vid injektionstillfället finns 0,1-0,2 ml luft bakom nikotinet, vilket garanterar att all vätska administreras framgångsrikt till musen. - Ta tag i musens svans med höger hand, och när djuret slappnar av, använd vänster tumme och pekfinger för att trycka på huden på baksidan av nacken från svansen till huvudet upp till örats kant, med måttligt tryck. Efter det, släpp höger hand och använd vänster liten tumme och ringfinger för att nypa svansen och bakbenen, varvid musen kommer att vara helt immobiliserad av vänster hand.
OBS: Ta tag i musen med lämplig kraft. Otillräcklig styrka gör det lätt för möss att bita, medan överdriven styrka kan leda till kvävning av mössen. - Använd höger hand för att injicera, punktera huden på nacken nära mössens öronkant i riktning från huvud till svans med sprutan och injicera med nikotin i jämn takt. Leta efter en halvcirkelformad hudutbuktning som indikerar en lyckad injektion.
OBS: När nålen har punkterats i huden kommer det att finnas en känsla av motstånd; Motståndet försvinner efter att nålen har förts in. Vid denna tidpunkt måste nålen dras ut något för att injicera långsamt och jämnt.
5. Exponering för kiseldioxid in vivo
- På dag 5-19, ingjut kiseldioxidsuspensionen i näshålan hos mössen i SiO 2 och Nic + SiO2 grupper. Bedöva snabbt varje mus med 2 % isofluran i en anestesimaskin i en dos på 3,6 ml/h. Efter bedövning placerar du musen på ena handflatan och exponerar musens näshåla. Injicera 50 μL kiseldioxidsuspension i näshålan inom 4-8 s.
- För att kiseldioxidsuspensionen ska komma in i lungorna så snart som möjligt, efter instillation, tryck försiktigt på musens hjärta med pekfingret i 3-5 s, 3x-5x per sekund, för att främja andningsfrekvensen.
- När musens andning gradvis blir enhetlig, placera musen i en bur för att observera i 3 minuter.
- För alla möss som får kiseldioxidsuspensionen, upprepa steg 1-3. I kontrollgruppen, tillför 50 μL steril koksaltlösning i näshålan dag 5-19.
6. Förvärv av färsk och fixerad lungvävnad
- På dag 41 används 50 mg/kg natriumpentobarbital för att bedöva mössen intraperitonealt i en dos på 0,1 ml/20 g beroende på deras kroppsvikt. Fäst lemmarna på en skumtestplatta och spraya pälsen med 75 % alkohol.
- Utför hjärtperfusion för att få färsk lungvävnad, skär av bukens mittlinje för att exponera brösthålan och gör en liten öppning vid toppen av höger hjärta. Injicera sedan 20 ml förkyld fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) långsamt och jämnt från toppen av det vänstra hjärtat, vilket gör att blodet rinner ut från öppningen som skapats vid toppen av det högra hjärtat. Ta ut hela lungloben, placera den i ett förkylt 1,5 ml centrifugrör och överför till −80 °C för förvaring i väntan på proteinextraktion.
- Spruta andra möss med 20 ml förkyld PBS följt av 10 ml 4 % paraformaldehyd på samma plats för att fixera hela lungorna; bevara varje lunga i 30 ml 4 % PFA.
- Efter 72 timmar bäddar du in de fixerade lungvävnaderna i paraffin.
- Sänk ner lungvävnaden i det beredda fixeringsmedlet i ett ultraljudsvattenbad vid 40 °C i 30 minuter, följt av en dehydreringsprocess i 75 % etanol, 95 % etanol och vattenfri etanol i 50 minuter vardera.
- Tvätta 2 gånger med xylen i 50 min vardera.
- Placera vävnaden i smält paraffinvax vid 55-60 °C i 2-3 timmar så att xylenet i lungvävnaden gradvis ersätts av paraffinvax.
- Fixera lungvävnaden i inbäddningsramen med paraffin och vänta tills vaxblocket härdar. Efter att vaxblocket har härdat, använd paraffinsnittsmaskinen för att skära lungan vid 4-5 μm.
- Placera lungsektionerna i ultrarent vatten vid 45 °C. När paraffinet har smält, ladda lungsektionen på ett vidhäftande mikroskopglas.
7. Färgning av hematoxylin och eosin (HE)
- Grädda glasen i 60 °C i 2 timmar och lägg dem i xylen för att vaxa dem i 2 x 30 minuter. Placera sedan objektglasen i vattenfri etanol, 95 % etanol, 85 % etanol och 75 % etanol i 5 minuter vardera. Tvätta dem slutligen i 3 x 5 minuter med ultrarent vatten.
- Droppa 50 μL hematoxylinfärgningslösning på lungvävnaden med en pipettpistol och fläcka i 5 minuter; Tvätta sedan skivorna under rinnande vatten i 5 minuter.
- Tillsätt 50 μL 2 % saltsyra i etanol på sektionen och skölj med destillerat vatten i 30 s. Tillsätt sedan 50 μL eosinfärgningslösning på lungvävnaden för att färga i 1 min.
- Torka, genomskinliga och försegla paraffinsektionerna.
- Tillsätt 100-150 ml 75 % etanol, 85 % etanol, 95 % etanol, vattenfri etanol och xylen i en kombinerad plastfärgningstank. Placera objektglasen i 75 %, 85 %, 95 % och vattenfri etanol i 5 minuter vardera för att torka.
- Placera sedan objektglasen i xylen i 5 minuter för att genomskinliga.
- Släpp slutligen 20 μL neutralt tuggummi på lungsektionen och placera ett täckglas över objektglaset för att försegla det.
OBS: Ovanstående steg utförs vid rumstemperatur.
8. Masson färgning
- Avvaxa, återfukta och tvätta paraffinsektionerna enligt beskrivningen i steg 7.1.
- Färga sektionerna med 50 μL konfigurerad Weigerts hematoxylinfärgningslösning i 7 minuter, följt av 50 μL sur etanolfraktioneringslösning i 10 s, och tvätta med rinnande vatten för att göra kärnorna blå.
- Fläcka sektionerna med 50 μL Masson trichrome-lösning i 4 minuter och tvätta med vatten.
- Skölj sektionerna med destillerat vatten i 1 min och färga sedan med Lichun röd syra magenta i 7 min.
- Tvätta sektionerna med en svag syraarbetslösning (30% saltsyra) i 1-2 min, fosfomolybdensyralösning i 1-2 min och svag syraarbetslösning i 1-2 min.
- Färga sektionerna i anilinblå färgningslösning i 2 minuter och tvätta sedan med en svag syraarbetslösning i 1 min.
- Torka sektionerna med 95 % etanol följt av vattenfri etanol i 1 s, transparentisera med xylen i 1 s och försegla slutligen med neutralt harts enligt beskrivningen i steg 7.4.
9. Immunhistokemi
- Grädda skivorna i 60 °C i 6 timmar. Avvaxa, återfukta och tvätta paraffinsektionerna enligt beskrivningen i steg 7.1.
- Antigenretrieal: placera skivorna i en värmebeständig plastskärlåda som innehåller tillräckligt med citratantigenlösning för att sänka skivorna och koka i 20-30 minuter.
- Kyl till rumstemperatur, ta bort sektionerna och skölj med avjoniserat vatten. Blötlägg sedan i 2 x 5 minuter i PBS som innehåller 0,5 % Tween-20 (PBST).
- Rita en ögla nära lungsektionen på objektglaset med en hydrofob penna för att bilda en hydrofob cirkel.
- Tillsätt 50 μl 3 % väteperoxidlösning (3 % H 2 O2)droppvis till skivorna och inkubera i 15 minuter i rumstemperatur skyddad från ljus för inaktivering av endogent peroxidas.
- Blötlägg skivorna i PBST i 3 x 5 min.
- Tillsätt 50 μl 5 % bovint serumprotein (BSA)-PBST droppvis till skivorna och blocka i 1 timme i rumstemperatur.
- Kassera den blockerande lösningen, tillsätt 50 μl av de utspädda primära antikropparna CD206 (spädning: 1:1 500), TGF-β1 (spädning: 1:200) och vimentin (spädning: 1:2 000) droppvis till skivorna och inkubera över natten vid 4 °C.
OBS: I detta arbete späddes alla antikroppar i 5% BSA. - Nästa dag återställer du skivorna till rumstemperatur (40 min). Tvätta skivorna enligt beskrivningen i steg 9.6.
- Späd den sekundära antikroppen med 5 % BSA. Tillsätt 50 μL pepparrotsperoxidasmärkt sekundär antikropp (spädning: 1:500) droppvis och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta skivorna enligt beskrivningen i steg 9.6.
- Droppa 50 μl 3,3'-diaminobenzidinlösning (DAB) motsvarande den enzymmärkta sekundära antikroppen på lungvävnaden och inkubera i 5–10 minuter i en svart immunhistokemisk våtbox. Observera under mikroskopet tills färgen utvecklas till en stark brun. Skölj skivorna med destillerat vatten för att avsluta reaktionen.
OBS: Brun färgning anses vara positiv färgning. - Fläcka med 50 μL hematoxylinfläck i 30 s och tvätta med rinnande vatten. Blötlägg sedan skivorna i 75 %, 85 %, 95 % och vattenfri etanol i 3 minuter vardera och sedan i xylen i 2 x 10 minuter. Försegla objektglasen enligt beskrivningen i steg 7.4.
10. Western blot-analys
- Ta ut lungvävnaden ur frysen och väg den. Tillsätt sedan 150 μl RIPA-lysbuffert innehållande PMSF per 20 mg lungvävnad. Spola muslungorna på is i 3-5 minuter med hjälp av en handhållen homogenisator, skaka försiktigt i 2 timmar vid 4 °C för att möjliggöra adekvat lys av lungvävnaden, centrifugera vid 4 °C och 14 800 × g i 15 minuter och samla upp supernatanten.
OBS: Tillsätt 100 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) några minuter innan du använder RIPA-lysbufferten. Den slutliga koncentrationen av PMSF är 1 mM (t.ex. 10 μl PMSF + 990 μl RIPA). - Använd ett BCA-proteinkoncentrationskit för att bestämma proteinkoncentrationen i provet genom att följa tillverkarens instruktioner. Efter bestämning späds samma sats proteinlysat med RIPA till den minsta koncentrationen med RIPA med den minsta koncentrationen för att uppnå samma massa och volym.
OBS: Den totala mängden lungvävnadsbelastning är 30 μg. - Tillsätt 40 μl 5x laddningsbuffert till 160 μl proteinlysat och värm den vid 100 °C i 10 minuter.
- Montera den beredda 10 % natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforesgelen (SDS-PAGE) i Western blotting-elektroforessystemet, tillsätt SDS-PAGE-elektroforesbufferten, dra försiktigt ut elektroforeskammen och tillsätt 20 μL proteinprov per brunn långsamt och jämnt. Slå på strömmen och starta elektroforesen på 80 V i 30 minuter. När proteinerna har nått det nedre gelskiktet, byt till 100 V och fortsätt elektroforesen i 60-70 minuter.
OBS: Elektrofores behöver ny elektroforesbuffert. - Överför proteinerna till ett PVDF-membran genom våtöverföring. Aktivera PVDF-membranet med metanol i förväg (5-30 s). Ta ut elektroforesgelplattan, bänd försiktigt upp den, placera separatorgelen i den våta överföringsbufferten, gör den elektriska överföringssandwichen och montera våtöverföringssystemet. Fyll elektroforestanken med överföringsbuffert och överför vid 400 mA i 90 minuter.
OBS: Överföringsbufferten kyls i förväg för att undvika effekterna av höga temperaturer under våtöverföringen. - Tvätta PVDF-membranet med Tris-buffrad koksaltlösning med 0,5 % Tween-20 (TBST) i 3 x 5 minuter. Blockera PVDF-membranet med 5 % skummjölk utspädd i TBST och inkubera på en shaker i rumstemperatur i 60 minuter. Tvätta sedan med TBST i 2 min. Efter tvätt inkuberas membranet över natten vid 4 °C med det primära antikroppsvimentin (1:5 000) och GAPDH (1:10 000) utspätt i 5 % BSA.
- Placera membranet i rumstemperatur i 30 minuter och tvätta med TBST i 5 x 5 minuter. Efter tvättning inkuberas membranet med den sekundära antikroppen (1:10 000) utspädd i 5 % skummjölk i 60 minuter vid rumstemperatur.
- Placera membranet med proteinsidan uppåt, släpp den beredda ECL-arbetslösningen, inkubera i 1-2 minuter och observera resultaten med en gelkamera. Använd gråskalevärdena som mäts av programvaran i gelkameran för att utvärdera proteinuttrycksnivåerna.
OBS: Här fungerade GAPDH som en intern referens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En musmodell för att studera nikotin i kombination med exponering för kiseldioxid etablerades för att undersöka nikotinets potentiella roll i utvecklingen av silikos hos möss. Figur 1 visar den experimentella proceduren för att använda en musmodell med dubbel exponering, som parade ihop en nikotininjektion med nasal instillation av en kiseldioxidsuspension. De patologiska förändringarna hos mössen i varje grupp observerades med HE-färgning. De möss som exponerades för nikotin i kombination med kiseldioxid hade signifikant allvarligare lungskador än de som exponerades för enbart nikotin eller kiseldioxid. Lymfocyterna ökade nära lymfkärlen i lungorna hos de nikotinexponerade mössen och bildade inflammatoriska cellkluster. Masson-färgning avslöjade en signifikant ökning av kollagenfiberavlagringen i lungorna som exponerades för nikotin i kombination med kiseldioxid jämfört med lungorna i de andra grupperna, och detta stöddes av Masson-färgningskvantifieringen (Figur 2). Den alveolära strukturen förstördes i de kiseldioxidexponerade mössen och antalet makrofager ökade. Men efter exponering för nikotin i kombination med kiseldioxid skedde en betydande inflammatorisk cellinfiltration och fibroblastknölar uppstod. Dessutom finns ackumulerade makrofager, särskilt M2-makrofager, i den dubbelexponerade gruppen. M2-makrofager är viktiga för det avancerade fibrotiska stadiet av silikos.
Dessutom observerades en signifikant ökning av den pro-fibrotiska faktorn TGF-β1 genom immunhistokemisk (IHC) färgning i lungorna hos dubbelexponerade möss, särskilt i inflammatoriska celler nära lymfkärl (Figur 3). TGF-β1 som utsöndras av makrofager främjar EMT av epitelceller och lungfibros12. Jämfört med möss som exponerades för enbart kiseldioxid var vimentinnivåerna signifikant förhöjda i lungorna hos möss med dubbel exponering. Både IHC-färgning och proteinkvantifiering indikerade allvarlig EMT hos dubbelexponerade möss (Figur 4). De kombinerade bevisen tyder på att kronisk kiseldioxidexponering främjar EMT efter uppregleringen av TGF-β1, vilket leder till en ökning av fibroblaster och progressiv fibros. Samtidigt påskyndar tillsatsen av nikotin lungfibrosprocessen genom att förvärra EMT, vilket gör att lungfibros kan uppträda tidigare. Denna modell är utformad för att utforska nikotinets inverkan på lungfibros, vilket är en konsekvens av kronisk kiseldioxidexponering hos människor.
Figur 1: Design av en experimentell modell av kombinerad exponering för nikotin och kiseldioxid hos möss. Kontinuerlig injektion av nikotin i 1-40 dagar och kontinuerlig nasal instillation av kiseldioxid i 5-19 dagar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Nikotin främjar bildandet av fibroblastiska massor i lungorna hos möss som exponerats för kiseldioxid. (A) HE-färgning användes för att visualisera patologiska förändringar i lungorna. De dubbelexponerade mössen hade svår inflammatorisk cellinfiltration och fibros. De gröna pilarna indikerar inflammatoriska cellmassor. Skalstreck = 50 μm. (B) Massonfärgning användes för att visa kollagenfibrer i lungorna. Skalstreck = 50 μm. (C) Kvantifiering av kollagenfibrer i lungorna. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ökat antal CD206-positiva celler och TGF-β1 i lungorna hos möss som exponerats för nikotin och kiseldioxid. (A) IHC-färgning av CD206 användes för att observera fördelningen och uttrycket av makrofager i de dubbelexponerade mössen. CD206-positiva makrofager ökade i lungorna hos möss efter kombinerad exponering för nikotin och kiseldioxid. De korta pilarna representerar CD206-positiva celler. Skalstapel = 50 μm. (B) TGF-β1, en promotor för fibros, var förhöjd hos dubbelexponerade möss. De långa pilarna representerar TGF-β1-positiva celler. Skalstapel = 50 μm. (C,D) AOD för CD206 och TGF-β1. AOD = IOD (integrerad optisk densitet)/area. AOD återspeglar koncentrationen av CD206 och TGF-β1 per ytenhet. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Förkortningar: TGF-β1 = transformerande tillväxtfaktor-beta; IHC = immunhistokemi; AOD = genomsnittlig optisk densitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Främjande av lungfibros med nikotin hos kiseldioxidexponerade möss genom försämring av EMT. (A) Uttrycket av vimentin i varje grupp observerades genom IHC-färgning. Vimentin uttrycktes starkt i lungorna hos möss som exponerats för nikotin och kiseldioxid. Skalstapel = 50 μm.(B) Västlig blotta förekomst av vimentinuttryck i varje exponeringsgrupp, med en ökning av vimentin i lungvävnaden hos dubbelexponerade möss. (C) AOD-värdet för vimentin var signifikant mer förhöjt i den dubbelexponerade gruppen jämfört med de andra grupperna. (D) Den relativa proteinuttrycksnivån för vimentin jämfört med GAPDH. Vimentinuttrycket i gruppen som exponerades för dubbelexponering var signifikant högre än i gruppen som exponerades för nikotin eller kiseldioxid. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Förkortningar: EMT = epitel-mesenkymal övergång; AOD = genomsnittlig optisk densitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En djurmodell med dubbel exponering är nödvändig för att undersöka rollen och de potentiella mekanismerna för samtidig exponering för nikotin och kristallin kiseldioxid. Denna modell uppnåddes i detta arbete genom subkutan injektion av nikotin och näsdropp av kiseldioxid. För att säkerställa en lyckad nikotininjektion måste operatören vänja sig vid att greppa mössen, eftersom det kan vara smärtsamt för dem att ta tag i huden på baksidan av nacken. Därför är det viktigt att låta mössen gradvis anpassa sig till greppet. Dessutom är näsdroppet ett kritiskt steg i exponeringen för kiseldioxid hos möss. För att öka framgången för ingreppet och mössens överlevnadsgrad är det viktigt att öva på näsdropp i förväg.
När injektionen utförs ska sprutan dras över mushuvudet för att undvika en kraftig kamp när musen ser sprutan. Musens svans ska greppas ordentligt med höger hand, medan vänster hand ska användas för att försiktigt och försiktigt trycka upp huden till öronkanten på baksidan av nacken och för att nypa huden där. Efter att ha släppt musens svans med höger hand ska svansen och bakbenen stabiliseras med vänster tumme och ringfinger för att förhindra bitning. Använd en 1 ml spruta i höger hand och nålen ska föras in i den lösa huden ovanför halsen i 30° vinkel från huvud till svans. Nålen ska dras ut något efter att motståndet har försvunnit och injektionen ska administreras långsamt och jämnt. Dag 5-19 exponerades möss i den dubbelexponerade gruppen för nikotin och kiseldioxid. Det rekommenderas att nikotinet injiceras kl. 08.00, följt av näsdropp med kiseldioxid kl. 14.00 och ytterligare en injektion av nikotin kl. 20.00. De två nikotininjektionerna måste ges med 12 timmars mellanrum för att undvika effekterna av upprepat grepp på mössen.
Att utföra subkutana injektioner och näsdropp innebär flera tekniska utmaningar. Vid subkutana injektioner ska mössen greppas med lämplig kraft. Om huden på baksidan av nacken kläms åt för hårt kommer musens luftvägar att blockeras, vilket snabbt leder till kvävning. För optimal styrka bör huden på baksidan av nacken nypas tills ögongloberna sticker ut något. Vid denna tidpunkt känner musen den lägsta smärtan och andas smidigt. Dessutom ska en 1 ml spruta som är tömd på luft användas för att dra ut nikotininjektionen från tuben, följt av ytterligare 0,1-0,2 ml luft. Innan injektion ska bubblorna försiktigt snärtas ut. På grund av den lilla volymen av injektionen kan nikotinet som finns kvar på nålspetsen leda till en otillräcklig dos. De viktigaste delarna av injektionen är att föra in nålen snabbt, injicera nikotinet långsamt och ta bort nålen försiktigt. För näsdropp, i denna studie, var mössens näshåla helt exponerad under djup anestesi, följt av långsam och enhetlig tillförsel av en kiseldioxidsuspension. Det är också viktigt att försiktigt trycka på brösthålan efter exponering för kiseldioxid för att undvika hosta eller kvävning.
Denna modell har vissa begränsningar. De 1-5 μm kiseldioxidpartiklar som användes i experimenten samlades inte in från miljön och var rena kiseldioxidpartiklar. I faktiska arbetsmiljöer kan arbetstagare däremot exponeras för en mängd olika farliga material, inte bara kiseldioxidpartiklar, såsom en blandning av kol och kvartsdamm i en keramikfabrik eller en kolgruva. Vi använde nasal instillation kiseldioxid för att uppnå låga doser och upprepade multipla exponeringar för att simulera den kroniska exponeringen av arbetare. I musmodellen med dubbel exponering, även om nikotinet inte kommer från exponering för cigarettrök, kommer det injicerade nikotinet direkt in i blodomloppet, vilket möjliggör en mer fokuserad utforskning av nikotinets roll i silikosprocessen och undvikande av effekterna av andra komponenter i cigarettrök.
Vetenskaplig forskning om silikos har vanligtvis använt enfaktormusmodeller, antingen genom inandning eller bronkial perfusion av kiseldioxid, för att bedöma kiseldioxidens roll i utvecklingen av sjukdom. Ett alternativt tillvägagångssätt är nasal instillation av kiseldioxid, vilket är enkelt och lätt och gör det möjligt att upprätta modeller för upprepad och kronisk exponering för kiseldioxid13. Den väletablerade nasala droppmodellen med kiseldioxid orsakar minimal skada på mössen och skulle kunna kombineras med andra faktorer för att skapa en multifaktoriellt exponerad djurmodell. Dessutom inkluderar de viktigaste metoderna för nikotinexponering hos möss nikotin i dricksvatten, subkutan injektion av nikotin, nikotininfusion via osmotiska minipumpar och exponering för tobaksrök14. Den subkutana injektionen som används i modellen med dubbel exponering gör det möjligt att exakt ställa in dosering och tidpunkt för nikotin, vilket säkerställer att varje mus får samma dos.
Kort sagt, djurmodellen av nikotin i kombination med kiseldioxidexponering replikerar ett realistiskt kroniskt exponeringsmönster, och denna modell kan användas för ytterligare undersökningar av nikotinets effekter på inflammation och fibros vid utveckling av silikos. Dessutom fungerar denna modell som en grund för att bilda en djurmodell med dubbel exponering med flera doser och tidsramar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Samtliga författare uppger att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av University Synergy Innovation Program i Anhui-provinsen (GXXT-2021-077) och Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
