Summary
Denne studien beskriver en musemodell for å studere den synergistiske effekten av nikotin på utviklingen av lungefibrose i eksperimentelle silikosemus. Musemodellen med dobbel eksponering simulerer den patologiske progresjonen i lungen etter samtidig eksponering for nikotin og silika. Metodene som beskrives er enkle og svært reproduserbare.
Abstract
Røyking og eksponering for silika er vanlig blant yrkesarbeidere, og silika er mer sannsynlig å skade lungene til røykere enn ikke-røykere. Nikotinens rolle, den primære vanedannende ingrediensen i sigaretter, i silikoseutvikling er uklar. Musemodellen som ble brukt i denne studien var enkel og lett kontrollert, og den simulerte effektivt effekten av kronisk nikotininntak og gjentatt eksponering for silika på lungefibrose gjennom epithelial-mesenkymal overgang hos mennesker. I tillegg kan denne modellen bidra til direkte studie av effekten av nikotin på silikose, samtidig som man unngår effekten av andre komponenter i sigarettrøyk.
Etter miljøtilpasning ble mus injisert subkutant med 0,25 mg/kg nikotinoppløsning i løs hud over halsen hver morgen og kveld med 12 timers mellomrom over 40 dager. I tillegg ble krystallinsk silikapulver (1-5 μm) suspendert i vanlig saltvann, fortynnet til en suspensjon på 20 mg / ml og dispergert jevnt ved hjelp av et ultralydvannbad. De isofluranbedøvede musene inhalerte 50 μL av denne silikastøvsuspensjonen gjennom nesen og ble vekket via brystmassasje. Eksponering av silika ble administrert daglig på dag 5-19.
Den dobbelteksponerte musemodellen ble utsatt for nikotin og deretter silika, som samsvarer med eksponeringshistorien til arbeidstakere som er utsatt for begge skadelige faktorer. I tillegg fremmet nikotin lungefibrose gjennom epitel-mesenkymal transformasjon (EMT) hos mus. Denne dyremodellen kan brukes til å studere effekten av flere faktorer på utviklingen av silikose.
Introduction
Silikaeksponering hos arbeidstakere er uunngåelig i enkelte yrkesinnstillinger, og når den er utsatt for silika, utvikler forverringen selv etter fjerning fra miljøet. I tillegg røyker de fleste av disse arbeiderne, og tradisjonelle sigaretter inneholder tusenvis av kjemikalier, med den viktigste vanedannende komponenten som nikotin1. E-sigaretter blir stadig mer populært i yngre aldersgrupper2; Disse e-sigarettene fungerer som et nikotinleveringssystem og øker nikotintilgangen, og øker dermed lungefølsomheten og lungebetennelsen3. Sigarettrøyk akselererer også lungefibrose hos bleomycineksponerte mus4 og øker lungetoksisitet og fibrose hos kiseleksponerte mus 5,6. Men om nikotin kan påvirke inflammatorisk og lungefibrose prosessen forårsaket av silika gjenstår å bli undersøkt.
Silikosemusemodellen etablert ved engangsinnånding av en høy dose silika i luftrøret er traumatisk for mus. Selv om denne metoden raskt gir en silikosemodell, samsvarer den ikke med virkeligheten i et miljø der arbeidstakere gjentatte ganger blir utsatt for silika. Derfor etablerte vi en silikaeksponert musemodell ved gjentatte ganger å gi en lav dose silikasuspensjoner via et nesedrypp; Denne dosen kan forårsake betennelse og fibrose hos mus.
For å omgå effekten av andre sigarettkomponenter ble denne musemodellen subkutant injisert med nikotin i den løse huden i nakken for å bestemme effekten av den vanedannende komponenten, nikotin, på silikose. Ved å administrere subkutane injeksjoner kan nøyaktig dosering oppnås, noe som gjør det mulig å lage nikotineksponeringsmodeller og observere dosetoksisitetsresponser, samt avhengighet. En nikotinavhengighetsmodell er utviklet hos hannmus, med en nikotininjeksjonsdose på 0,2-0,4 mg/kg 7,8. I den modellen, for å møte de narkotikasøkende behovene til de avhengige musene, ble to subkutane injeksjoner administrert i intervaller på 12 timer. Denne musens nikotinavhengighetsmodell er nyttig for å simulere menneskers røykevaner og eksponering for silika.
Enfaktor dyremodeller har begrensninger i sykdomsstudier, mens metoden beskrevet her innebærer en tofaktor musemodell av nikotin og silika co-eksponering. Før silikaeksponeringen ble musene forhåndseksponert for nikotin for å replikere nikotineksponering hos personer som røyker. Deretter fant silikaeksponering sted fra dag 5 til dag 19 for å etterligne silikaeksponering i et arbeidsmiljø for personer med en historie med røyking.
Alveolære makrofager er kjent for å spille en betydelig rolle i reguleringen av lungebetennelse og fibrose. Makrofager kan ikke bryte silika ned ved innånding av silika, noe som fører til makrofagpolarisering eller apoptose9 og frigjøring av cytokiner som tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) og transformerende vekstfaktor beta (TGF-β). M1-makrofager, som er identifisert ved tilstedeværelsen av overflatemarkøren CD86, er de primære initiativtakerne til den inflammatoriske responsen i silikose, mens M2-makrofager, som er merket med CD206, er ansvarlige for den fibrotiske fasen av tilstanden10. I dobbelteksponerte mus induserte nikotin polariseringen av makrofager mot M2-fenotypen i kiselskadede lunger, og fremmet dermed lungefibrose. Videre er TGF-β1 nøkkelen til induksjon av fibrose og EMT11; det økte uttrykket av TGF-β1 akselererte utviklingen av lungefibrose gjennom EMT. Denne modellen analyserte vellykket effekten av nikotin på silikose og fremhevet videre betydningen av nikotinavbrudd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene utstedt av National Institutes of Health's Guide for Care and Use of Laboratory Animals (den 8. utgaven av NRC) og ble godkjent av Anhui University of Science and Technology Animal Ethics Committee.
1. Dyr forberedelse
- Hus 32 mannlige C57 / BL6 mus i alderen 8 uker i et laboratorium med en 12 timers lys / mørk syklus. Sørg for at musene har fri tilgang til mat og vann.
- Etter 2 ukers akklimatisering til miljøet, når de 10 uker gamle musene veier 23-26 g, bruk tilfeldige tall generert av en datamaskin for å tilfeldig gruppere dyrene uten partisjonering, noe som resulterer i fire grupper av mus: kontrollgruppen (Con), nikotingruppen (Nic), silikagruppen (SiO 2) og nikotinen kombinert med silikagruppen (Nic + SiO2).
2. Nikotinpreparat
MERK: Nikotintettheten er 1,01 g / ml.
- Løs opp nikotinet i vannfri etanol, og fortynn 20x for å fremstille en nikotinstamløsning på 50 mg/ml.
- Fortynn nikotinoppløsningen 1000x med sterilt normalt saltvann for å lage en arbeidsløsning i en konsentrasjon på 0,05 mg/ml.
MERK: Oppbevar nikotin vekk fra lys. Stamløsningen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
3. Silica forberedelse
- Suspender steril krystallinsk silika i saltoppløsning for å forberede en 20 mg / ml silikasuspensjon, og sving den i et ultralyd ristende vannbad i 25 minutter.
- Rist silikasuspensjonen med en virveloscillator i 3 minutter før musene får nesedryppet. Bland silikasuspensjonen ved å pipettere opp og ned 2x-3x med en 200 μL pipette, og ta deretter opp 50 μL for nesedryppet.
MERK: Silisiumdioksidsuspensjonen skal blandes og administreres via nesedrypp så snart som mulig.
4. Musefangst og nikotineksponering
- Vei musene, og registrer vektene daglig før eksponering.
- På dag 1-40 injiserer du nikotin subkutant to ganger daglig (med 12 timers mellomrom) i musene i Nic- og Nic+ SiO2-gruppene . Bruk en nikotindose på 0,25 mg/kg; For eksempel, sørg for at en mus som veier 25 g mottar 6,25 μg nikotin. For denne musen vil injeksjonsvolumet være som følger: 6,25/0,05 = 125 μL. Samtidig injiser musene i Con-gruppen med et like stort volum saltvann.
- Klargjør de nødvendige 1 ml sprøytene for hver gruppe, og bruk dem til å suge injeksjonsvolumet av nikotin eller saltvann. Før du tar opp nikotinet, trekk først 0,1-0,2 ml luft inn i sprøyten, og trekk deretter opp 125 μL nikotin. Bank forsiktig på sprøyten for å fylle nålen og forenden av sprøyten med nikotinet. Plasser den nikotinholdige sprøyten i et brett beskyttet mot lys.
MERK: På injeksjonstidspunktet ligger 0,1-0,2 ml luft bak nikotinet, noe som garanterer at all væsken administreres til musen. - Ta tak i musens hale med høyre hånd, og når dyret slapper av, bruk venstre tommel og pekefinger til å trykke huden på baksiden av nakken fra halen til hodet opp til kanten av øret, og bruk moderat trykk. Deretter slipper du høyre hånd, og bruker venstre lille tommel og ringfinger til å klemme halen og bakre lemmer, på hvilket tidspunkt musen blir fullstendig immobilisert av venstre hånd.
MERK: Ta tak i musen med passende kraft. Utilstrekkelig styrke gjør det enkelt for mus å bite, mens overdreven styrke kan føre til kvelning av musene. - Bruk høyre hånd til å injisere, punkter huden på baksiden av nakken nær ørekanten av musene i hode-til-hale-retning med sprøyten, og injiser med nikotin i jevn hastighet. Se etter en halvcirkelformet hudbule som indikerer en vellykket injeksjon.
MERK: Når nålen har punktert inn i huden, vil det være en følelse av motstand; Motstanden forsvinner etter at nålen er satt inn. På dette tidspunktet må nålen trekkes litt ut for å injiseres sakte og jevnt.
5. Eksponering av silika in vivo
- På dag 5-19, innpode silisiumdioksidsuspensjonen i nesehulen til musene i SiO 2 og Nic+ SiO2 gruppene. Bedøv hver mus raskt med 2 % isofluran i en anestesimaskin i en dose på 3,6 ml/time. Etter anestesi, plasser musen på håndflaten på den ene hånden, og utsett musens nesehule. Still inn 50 μL silikasuspensjon i nesehulen innen 4-8 s.
- For å la silikasuspensjonen komme inn i lungene så snart som mulig, etter innånding, trykk musens hjerte forsiktig med pekefingeren i 3-5 s, 3x-5x per sekund, for å fremme respirasjonsfrekvensen.
- Etter at respirasjonen av musen gradvis blir jevn, plasser musen i et bur for å observere i 3 minutter.
- For alle mus som får silikasuspensjonen, gjenta trinn 1-3. I kontrollgruppen, injiser 50 μL steril saltoppløsning i nesehulen på dagene 5-19.
6. Oppkjøp av friske og faste lungevev
- På dag 41, bruk 50 mg / kg natriumpentobarbital for å anestesere musene intraperitonealt i en dose på 0,1 ml / 20 g i henhold til kroppsvekten. Fest lemmer på en skumtestplate, og spray pelsen med 75% alkohol.
- Utfør hjerteperfusjon for å oppnå friskt lungevev, kutt midtlinjen i magen for å avsløre brysthulen, og lag en liten åpning ved toppen av høyre hjerte. Deretter injiserer du 20 ml forkjølt fosfatbufret saltvann (PBS) sakte og jevnt fra toppen av venstre hjerte, noe som får blodet til å strømme ut fra åpningen som er opprettet på toppen av høyre hjerte. Ta ut hele lungelappen, legg den i et forkjølt 1,5 ml sentrifugerør, og overfør til -80 °C for lagring i påvente av proteinekstraksjon.
- Perfus andre mus med 20 ml forkjølt PBS etterfulgt av 10 ml 4% paraformaldehyd på samme sted for å fikse hele lunger; bevare hver lunge i 30 ml med 4% PFA.
- Etter 72 timer, legg inn det faste lungevevet i parafin.
- Dypp lungevevvet i det tilberedte fiksativet i et ultralydsvannbad ved 40 ° C i 30 minutter, etterfulgt av en dehydreringsprosess i 75% etanol, 95% etanol og vannfri etanol i 50 minutter hver.
- Vask 2x med xylen i 50 min hver.
- Legg vevet i smeltet parafinvoks ved 55-60 °C i 2-3 timer slik at xylenet i lungevevet gradvis erstattes av parafinvoks.
- Fest lungevevet i innebyggingsrammen med parafin, og vent til voksblokken stivner. Etter at voksblokken har herdet, bruk parafinsnittmaskinen til å skjære lungen på 4-5 μm.
- Lungeseksjonene legges i ultrarent vann ved 45 °C. Når parafinen har smeltet, legg lungeseksjonen på et vedheftende mikroskoplysbilde.
7. Hematoksylin og eosin (HE) farging
- Stek lysbildene ved 60 °C i 2 timer, og legg lysbildene i xylen for å devoks i 2 x 30 min. Deretter plasserer du lysbildene i vannfri etanol, 95% etanol, 85% etanol og 75% etanol i 5 minutter hver. Vask dem til slutt i 3 x 5 min med ultrarent vann.
- Slipp 50 μL hematoksylinfargeoppløsning på lungevevvet med en pipettepistol og flekk i 5 minutter; Vask deretter skivene med rennende vann i 5 minutter.
- Tilsett 50 μL 2% saltsyre i etanol på seksjonen, og skyll med destillert vann i 30 s. Deretter tilsettes 50 μL eosinfargeløsning på lungevevvet for å flekke i 1 min.
- Dehydrer, transparentiser og forsegl parafinseksjonene.
- Tilsett 100-150 ml 75% etanol, 85% etanol, 95% etanol, vannfri etanol og xylen i en kombinert plastfargetank. Plasser lysbildene i 75%, 85%, 95% og vannfri etanol i 5 minutter hver for å dehydrere.
- Plasser deretter lysbildene i xylen i 5 minutter for å gjennomsiktiggjøre.
- Til slutt, slipp 20 μL nøytral tannkjøtt på lungeseksjonen, og legg en deksel over lysbildet for å forsegle det.
NOTAT: Trinnene ovenfor utføres ved romtemperatur.
8. Masson farging
- Avvoks, fukt og vask parafinseksjonene som beskrevet i trinn 7.1.
- Farg seksjonene med 50 μL konfigurert Weigerts hematoksylinfargeløsning i 7 minutter, etterfulgt av 50 μL sur etanolfraksjoneringsløsning i 10 s, og vask med rennende vann for å gjøre kjernene blå.
- Beis seksjonene med 50 μL Masson trichrome løsning i 4 minutter, og vask med vann.
- Skyll seksjonene med destillert vann i 1 min, og flekk deretter med Lichun rød syre magenta i 7 min.
- Vask seksjonene med en svak syrearbeidsløsning (30% saltsyre) i 1-2 minutter, fosfomolybdisk syreoppløsning i 1-2 minutter og svak syrearbeidsløsning i 1-2 minutter.
- Flekk seksjonene i anilinblå fargeløsning i 2 minutter, og vask deretter med en svak syrearbeidsløsning i 1 min.
- Dehydrer seksjonene med 95% etanol etterfulgt av vannfri etanol i 1 s, transparentiser med xylen i 1 s, og forsegl til slutt med nøytral harpiks som beskrevet i trinn 7.4.
9. Immunhistokjemi
- Stek skivene ved 60 °C i 6 timer. Avvoks, fukt og vask parafinseksjonene som beskrevet i trinn 7.1.
- Antigenuthenting: Legg skivene i en varmebestandig plastskiveboks som inneholder nok sitratantigenløsning til å senke skivene, og kok i 20-30 min.
- Avkjøl til romtemperatur, fjern seksjonene og skyll med avionisert vann. Bløtlegg deretter i 2 x 5 min i PBS inneholdende 0,5% Tween-20 (PBST).
- Tegn en sløyfe nær lungeseksjonen på lysbildet med en hydrofob penn for å danne en hydrofob sirkel.
- Tilsett 50 μL 3% hydrogenperoksidoppløsning (3%H2O2) dråpevis til skivene, og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys for inaktivering av endogen peroksidase.
- Bløtlegg skivene i PBST i 3 x 5 min.
- Tilsett 50 μL 5% bovint serumprotein (BSA)-PBST dråpevis til skivene, og blokker i 1 time ved romtemperatur.
- Kast sperreoppløsningen, tilsett 50 μl av de fortynnede primærantistoffene CD206 (fortynning: 1:1 500), TGF-β1 (fortynning: 1:200) og vimentin (fortynning: 1:2 000) dråpevis til skivene, og inkuber over natten ved 4 °C.
MERK: I dette arbeidet ble alle antistoffene fortynnet i 5% BSA. - Neste dag, returner skivene til romtemperatur (40 min). Vask skivene som beskrevet i trinn 9.6.
- Fortynn det sekundære antistoffet i 5% BSA. Tilsett 50 μL pepperrotperoksidase-merket sekundært antistoff (fortynning: 1:500) dråpevis, og inkuber i 1 time ved romtemperatur. Vask skivene som beskrevet i trinn 9.6.
- Slipp 50 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) oppløsning tilsvarende det enzymmerkede sekundære antistoffet på lungevevvet, og inkuber i 5-10 minutter i en svart immunhistokjemisk våtboks. Vær oppmerksom under mikroskopet til fargen utvikler seg til en sterk brun. Skyll skivene med destillert vann for å avslutte reaksjonen.
MERK: Brun farging regnes som positiv farging. - Beis med 50 μL hematoksylinflekk i 30 s, og vask med rennende vann. Bløtlegg deretter skivene i 75%, 85%, 95% og vannfri etanol i 3 minutter hver og deretter i xylen i 2 x 10 minutter. Forsegle lysbildene som beskrevet i trinn 7.4.
10. Western blot analyse
- Ta lungevevet ut av fryseren, og vei det. Deretter tilsettes 150 μL RIPA lysisbuffer inneholdende PMSF per 20 mg lungevev. Lys musens lunger på is i 3-5 min ved hjelp av en håndholdt homogenisator, rist forsiktig i 2 timer ved 4 ° C for å tillate tilstrekkelig lyse av lungevevet, sentrifuge ved 4 ° C og 14 800 × g i 15 minutter, og samle supernatanten.
MERK: Tilsett 100 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) noen minutter før du bruker RIPA lysisbuffer. Den endelige konsentrasjonen av PMSF er 1 mM (f.eks. 10 μL PMSF + 990 μL RIPA). - Bruk et BCA-proteinkonsentrasjonssett for å bestemme proteinkonsentrasjonen av prøven ved å følge produsentens instruksjoner. Etter bestemmelse, ved bruk av den minste konsentrasjonen av proteinlysat som base, fortynn den samme batchen proteinlysat med RIPA til den minste konsentrasjonen for å oppnå samme masse og volum.
MERK: Den totale mengden lungevevsbelastning er 30 μg. - Tilsett 40 μL 5x lastebuffer til 160 μL proteinlysat, og varm det opp ved 100 °C i 10 minutter.
- Monter den fremstilte 10% natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel i det vestlige blottingelektroforesesystemet, tilsett SDS-PAGE-elektroforesebufferen, trekk forsiktig ut elektroforesekammen og tilsett 20 μL proteinprøve per brønn sakte og jevnt. Slå på strømmen, og start elektroforesen ved 80 V i 30 minutter. Etter at proteinene har nådd det nedre gellaget, bytt til 100 V, og fortsett elektroforesen i 60-70 minutter.
MERK: Elektroforese trenger frisk elektroforesebuffer. - Overfør proteinene til en PVDF-membran ved våt overføring. Aktiver PVDF-membranen med metanol på forhånd (5-30 s). Ta elektroforesegelplaten ut, lirk den forsiktig opp, plasser separatorgelen i den våte overføringsbufferen, lag den elektriske overføringssandwichen og monter våtoverføringssystemet. Fyll elektroforesetanken med overføringsbuffer, og overfør ved 400 mA i 90 minutter.
MERK: Overføringsbufferen avkjøles på forhånd for å unngå effekten av høye temperaturer under våttransporten. - Vask PVDF-membranen med Tris-bufret saltvann med 0,5% Tween-20 (TBST) i 3 x 5 min. Blokker PVDF-membranen med 5% skummet melk fortynnet i TBST, og inkuber på en shaker ved romtemperatur i 60 minutter; vask deretter med TBST i 2 min. Etter vask inkuberes membranen over natten ved 4 °C med det primære antistoffet vimentin (1:5 000) og GAPDH (1:10 000) fortynnet i 5 % BSA.
- Plasser membranen i romtemperatur i 30 min, og vask med TBST i 5 x 5 min. Etter vask, inkuber membranen med det sekundære antistoffet (1:10 000) fortynnet i 5% skummet melk i 60 minutter ved romtemperatur.
- Plasser membranen, med proteinsiden opp, slipp den klargjorte ECL-arbeidsløsningen, inkuber i 1–2 minutter og observer resultatene med et gelbildeapparat. Bruk gråtoneverdiene som måles av programvaren i gelavbildningen til å evaluere proteinuttrykksnivåene.
MERK: Her fungerte GAPDH som en intern referanse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En musemodell for å studere nikotin kombinert med silikaeksponering ble etablert for å undersøke nikotinens potensielle rolle i utviklingen av silikose hos mus. Figur 1 viser den eksperimentelle prosedyren for bruk av en musemodell med dobbel eksponering, som parret en nikotininjeksjon med nasal instillasjon av en silikasuspensjon. De patologiske endringene hos musene i hver gruppe ble observert ved bruk av HE-farging. Musene utsatt for nikotin kombinert med silika hadde betydelig mer alvorlig lungeskade enn de som ble utsatt for nikotin eller silika alene. Lymfocytter økte nær lymfekarene i lungene til de nikotineksponerte musene, og dannet inflammatoriske celleklynger. Massonfarging viste en signifikant økning i kollagenfiberavleiring i lungene eksponert for nikotin kombinert med silika sammenlignet med lungene i de andre gruppene, og dette ble støttet av massonfargingskvantifiseringen (figur 2). Den alveolære strukturen ble ødelagt i de silikaeksponerte musene, og antall makrofager økte. Etter eksponering for nikotin kombinert med silisiumdioksyd var det imidlertid betydelig inflammatorisk celleinfiltrasjon, og fibroblastknuter dukket opp. I tillegg er akkumulerte makrofager, spesielt M2-makrofager, tilstede i den dobbelteksponerte gruppen. M2 makrofager er essensielle for det avanserte fibrotiske stadiet av silikose.
I tillegg ble en signifikant økning i profibrotisk faktor TGF-β1 observert ved immunhistokjemisk (IHC) farging i lungene hos dobbelteksponerte mus, spesielt i inflammatoriske celler nær lymfekar (figur 3). TGF-β1 utskilt av makrofager fremmer EMT av epitelceller og lungefibrose12. Sammenlignet med mus utsatt for silika alene, var vimentinnivåene signifikant forhøyet i lungene hos mus med dobbel eksponering. Både IHC-farging og proteinkvantifisering indikerte alvorlig EMT hos dobbelteksponerte mus (figur 4). Det kombinerte beviset tyder på at kronisk silikaeksponering fremmer EMT etter oppregulering av TGF-β1, noe som fører til en økning i fibroblaster og progressiv fibrose. Samtidig akselererer tilsetningen av nikotin prosessen med lungefibrose ved å forverre EMT, slik at lungefibrose kan vises tidligere. Denne modellen er designet for å undersøke virkningen av nikotin på lungefibrose, som er en konsekvens av kronisk silikaeksponering hos mennesker.
Figur 1: Design av en eksperimentell modell for kombinert eksponering for nikotin og silika hos mus. Kontinuerlig injeksjon av nikotin i 1-40 dager og kontinuerlig nasal instillasjon av silika i 5-19 dager. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nikotin fremmer dannelsen av fibroblastiske masser i lungene hos kiseleksponerte mus. (A) HE-farging ble brukt til å visualisere patologiske forandringer i lungene. De dobbelteksponerte musene hadde alvorlig inflammatorisk celleinfiltrasjon og fibrose. De grønne pilene indikerer betennelsescellemasser. Skalastang = 50 μm. (B) Massonfarging ble brukt til å vise kollagenfibre i lungene. Skala bar = 50 μm. (C) Kvantifisering av kollagenfibre i lungene. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Økte CD206-positive celler og TGF-β1 i lungene hos nikotin- og silika-dobbelteksponerte mus. (A) IHC-farging av CD206 ble brukt til å observere fordelingen og uttrykket av makrofager i de dobbelteksponerte musene. CD206-positive makrofager økte i lungene hos mus etter kombinert eksponering for nikotin og silika. De korte pilene representerer CD206-positive celler. Skala bar = 50 μm. (B) TGF-β1, en promotor av fibrose, var forhøyet i dobbelteksponerte mus. De lange pilene representerer TGF-β1-positive celler. Skala bar = 50 μm. (C,D) AOD av CD206 og TGF-β1. AOD = IOD (integrert optisk tetthet)/område. AOD gjenspeiler konsentrasjonen av CD206 og TGF-β1 per arealenhet. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: TGF-β1 = transformerende vekstfaktor-beta; IHC = immunhistokjemi; AOD = gjennomsnittlig optisk tetthet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fremme av lungefibrose ved nikotin hos kiseleksponerte mus gjennom forverring av EMT. (A) Uttrykket av vimentin i hver gruppe ble observert ved IHC-farging. Vimentin ble sterkt uttrykt i lungene til musene utsatt for nikotin og silika. Skala bar = 50 μm.(B) Vestlig blot av vimentinuttrykk i hver eksponeringsgruppe, med en økning i vimentin i lungevevet hos dobbelteksponerte mus. (C) AOD-verdien av vimentin var signifikant mer forhøyet i den dobbelteksponerte gruppen sammenlignet med de andre gruppene. (D) Det relative proteinuttrykksnivået for vimentin sammenlignet med GAPDH. Vimentinuttrykket i dobbelteksponeringsgruppen var signifikant høyere enn i nikotin- eller silikaeksponeringsgruppene. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: EMT = epithelial-mesenkymal overgang; AOD = gjennomsnittlig optisk tetthet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En dyremodell med dobbel eksponering er nødvendig for å undersøke rollen og de potensielle mekanismene for samtidig eksponering for nikotin og krystallinsk silisiumdioksid. Denne modellen ble oppnådd i dette arbeidet gjennom subkutan injeksjon av nikotin og nesedrypp av silika. For å sikre en vellykket nikotininjeksjon, må operatøren bli kjent med å gripe musene, da det kan være smertefullt for dem å ta tak i huden på baksiden av nakken. Derfor er det viktig å la musene gradvis tilpasse seg grepet. I tillegg er et kritisk trinn i silikaeksponering hos mus nesedryppet. For å øke suksessen til prosedyren og overlevelsesgraden til musene, er det viktig å øve nesedryppet på forhånd.
Når injeksjonen utføres, skal sprøyten skummes over musens hode for å unngå sterk kamp når musen ser sprøyten. Musens hale skal gripes godt med høyre hånd, mens venstre hånd skal brukes til å skyve huden opp til ørekanten på baksiden av nakken forsiktig og forsiktig og å klemme huden der. Etter å ha sluppet musens hale med høyre hånd, bør halen og bakre lemmer stabiliseres ved hjelp av venstre tommel og ringfinger for å forhindre biting. Ved hjelp av en 1 ml sprøyte i høyre hånd skal nålen føres inn i den løse huden over halsen i en 30° vinkel i hode-til-hale-retning. Nålen skal trekkes litt opp etter at motstanden er tapt, og injeksjonen skal administreres langsomt og jevnt. På dag 5-19 ble mus i den dobbelteksponerte gruppen utsatt for nikotin og silika. Det anbefales at nikotinen injiseres kl. 08.00, etterfulgt av nesedrypp av silisiumdioksid kl. 14.00 og en ny injeksjon av nikotin kl. 20.00. De to nikotininjeksjonene må gis med 12 timers mellomrom for å unngå effekten av gjentatt griping på musene.
Å utføre subkutane injeksjoner og nesedrypp byr på flere tekniske utfordringer. For subkutane injeksjoner skal musene gripes med passende kraft. Hvis huden på baksiden av nakken klemmes for tett, vil musens luftveier bli blokkert, noe som raskt fører til kvelning. For optimal styrke, bør huden på baksiden av nakken klemmes til øyebollene stikker litt ut. På denne tiden føles musen den laveste smerten og puster jevnt. I tillegg skal en 1 ml sprøyte som tømmes for luft brukes til å trekke nikotininjeksjonen ut av slangen, etterfulgt av ytterligere 0,1-0,2 ml luft. Før injisering skal boblene forsiktig vippes ut. På grunn av det lille volumet av injeksjonen, kan nikotinet som er igjen på spissen av nålenden føre til utilstrekkelig dose. De viktigste delene av injeksjonen er å sette nålen raskt, injisere nikotinet sakte og fjerne nålen forsiktig. For nesedrypp, i denne studien, ble nesehulen til musene fullt eksponert under dyp anestesi, etterfulgt av langsom og jevn instillasjon av en silisiumdioksydsuspensjon. Det er også viktig å trykke forsiktig på brysthulen etter silikaeksponering for å unngå hoste eller kvelning.
Denne modellen har visse begrensninger. De 1-5 μm silikapartiklene som ble brukt i forsøkene ble ikke samlet inn fra miljøet og var rene silikapartikler. I motsetning til dette, i faktiske yrkesinnstillinger, kan arbeidstakere bli utsatt for en rekke farlige materialer, ikke bare silikapartikler, for eksempel en blanding av kull og kiselstøv i en keramisk fabrikk eller en kullgruve. Vi brukte nasal instillasjonssilika for å oppnå lave doser og gjentatte eksponeringer for å simulere kronisk eksponering av arbeidstakere. I musemodellen med dobbel eksponering, selv om nikotinen ikke kommer fra eksponering for sigarettrøyk, kommer den injiserte nikotinen direkte inn i blodet, noe som muliggjør en mer fokusert utforskning av nikotinens rolle i silikoseprosessen og unngåelse av effekten av andre komponenter i sigarettrøyk.
Vitenskapelig forskning på silikose har vanligvis benyttet enkeltfaktormusemodeller, enten ved innånding eller bronkial perfusjon av silika, for å vurdere silikas rolle i utviklingen av sykdom. En alternativ tilnærming er nasal instillasjon av silisiumdioksid, som er enkel og enkel og muliggjør etablering av gjentatte og kroniske silikaeksponeringsmodeller13. Den veletablerte silisiumdioksid nesedryppmodellen forårsaker minimal skade på musene og kan kombineres med andre faktorer for å skape en multifaktoriell eksponert dyremodell. I tillegg inkluderer de viktigste metodene for nikotineksponering hos mus nikotin i drikkevann, subkutan injeksjon av nikotin, nikotininfusjon via osmotiske minipumper og eksponering for tobakkrøyk14. Den subkutane injeksjonen som brukes i dobbelteksponeringsmodellen gjør at dosering og tidspunkt for nikotin kan stilles nøyaktig, slik at hver mus administreres samme dose.
Kort sagt, dyremodellen av nikotin i kombinasjon med silikaeksponering replikerer et realistisk kronisk eksponeringsmønster, og denne modellen kan brukes til videre undersøkelser av virkningen av nikotin på betennelse og fibrose i utviklingen av silikose. I tillegg tjener denne modellen som grunnlag for å danne en dyremodell med dobbel eksponering med flere doser og tidsrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av University Synergy Innovation Program of Anhui Province (GXXT-2021-077) og Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
