Summary
Deze studie beschrijft een muismodel om het synergetische effect van nicotine op de progressie van longfibrose bij experimentele silicosemuizen te bestuderen. Het muismodel met dubbele blootstelling simuleert de pathologische progressie in de long na gelijktijdige blootstelling aan nicotine en silica. De beschreven methoden zijn eenvoudig en zeer reproduceerbaar.
Abstract
Roken en blootstelling aan silica komen vaak voor bij beroepswerkers, en silica heeft meer kans om de longen van rokers te beschadigen dan niet-rokers. De rol van nicotine, het belangrijkste verslavende ingrediënt in sigaretten, bij de ontwikkeling van silicose is onduidelijk. Het muismodel dat in deze studie werd gebruikt, was eenvoudig en gemakkelijk te controleren, en simuleerde effectief de effecten van chronische nicotine-inname en herhaalde blootstelling aan silica op longfibrose door epitheliale-mesenchymale overgang bij mensen. Bovendien kan dit model helpen bij de directe studie van de effecten van nicotine op silicose, terwijl de effecten van andere componenten in sigarettenrook worden vermeden.
Na aanpassing aan de omgeving werden muizen subcutaan geïnjecteerd met 0,25 mg/kg nicotine-oplossing in de losse huid boven de nek, elke ochtend en avond met tussenpozen van 12 uur gedurende 40 dagen. Bovendien werd kristallijn silicapoeder (1-5 μm) gesuspendeerd in normale zoutoplossing, verdund tot een suspensie van 20 mg/ml en gelijkmatig gedispergeerd met behulp van een ultrasoon waterbad. De met isofluraan verdoofde muizen inhaleerden 50 μL van deze silicastofsuspensie via de neus en werden gewekt via borstmassage. Blootstelling aan silica werd dagelijks toegediend op dag 5-19.
Het dubbel blootgestelde muismodel werd blootgesteld aan nicotine en vervolgens aan silica, wat overeenkomt met de blootstellingsgeschiedenis van werknemers die aan beide schadelijke factoren zijn blootgesteld. Bovendien bevorderde nicotine longfibrose door epitheliale-mesenchymale transformatie (EMT) bij muizen. Dit diermodel kan worden gebruikt om de effecten van meerdere factoren op de ontwikkeling van silicose te bestuderen.
Introduction
Blootstelling aan silica bij werknemers is onvermijdelijk in sommige beroepsomgevingen, en eenmaal blootgesteld aan silica vordert de verslechtering, zelfs na verwijdering uit het milieu. Bovendien roken de meeste van deze werknemers en bevatten traditionele sigaretten duizenden chemicaliën, met als belangrijkste verslavende bestanddeel nicotine1. E-sigaretten worden steeds populairder in jongere leeftijdsgroepen2; Deze e-sigaretten fungeren als een nicotineafgiftesysteem en vergroten de toegang tot nicotine, waardoor de longgevoeligheid en longontsteking toenemen3. Sigarettenrook versnelt ook longfibrose bij aan bleomycine blootgestelde muizen4 en verhoogt de longtoxiciteit en fibrose bij aan silica blootgestelde muizen 5,6. Of nicotine het ontstekings- en longfibroseproces veroorzaakt door silica kan beïnvloeden, moet echter nog worden onderzocht.
Het silicose-muismodel dat tot stand komt door de eenmalige inademing van een hoge dosis silica in de luchtpijp is traumatisch voor muizen. Hoewel deze methode snel een silicosemodel oplevert, komt het niet overeen met de realiteit van een omgeving waar werknemers herhaaldelijk worden blootgesteld aan silica. Daarom hebben we een aan silica blootgesteld muismodel opgesteld door herhaaldelijk een lage dosis silicasuspensies te geven via een neusinfuus; Deze dosis kan ontstekingen en fibrose bij muizen veroorzaken.
Om de effecten van andere sigarettencomponenten te omzeilen, werd dit muismodel subcutaan met nicotine in de losse huid van de nek geïnjecteerd om het effect van de verslavende component, nicotine, op silicose te bepalen. Door subcutane injecties toe te dienen, kan een nauwkeurige dosering worden bereikt, waardoor het mogelijk wordt om nicotineblootstellingsmodellen te maken en dosistoxiciteitsreacties en verslaving te observeren. Bij mannelijke muizen is een nicotineverslavingsmodel ontwikkeld, met een nicotine-injectiedosis van 0,2-0,4 mg/kg 7,8. In dat model werden, om te voldoen aan de drugsbehoeften van de verslaafde muizen, twee subcutane injecties toegediend met tussenpozen van 12 uur. Dit nicotineverslavingsmodel bij muizen is nuttig voor het simuleren van menselijke rookgewoonten en blootstelling aan silica.
Enkelvoudige diermodellen hebben beperkingen in ziektestudies, terwijl de hier beschreven methode een tweefactormuismodel van gelijktijdige blootstelling aan nicotine en silica omvat. Voorafgaand aan de blootstelling aan silica werden de muizen vooraf blootgesteld aan nicotine om de blootstelling aan nicotine bij mensen die roken na te bootsen. Vervolgens vond van dag 5 tot dag 19 blootstelling aan silica plaats om blootstelling aan silica na te bootsen in een werkomgeving voor personen met een voorgeschiedenis van roken.
Van alveolaire macrofagen is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij de regulatie van longontsteking en fibrose. Macrofagen kunnen silica niet afbreken bij het inademen van silica, wat leidt tot macrofaagpolarisatie of apoptose9 en het vrijkomen van cytokines zoals tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en transformerende groeifactor bèta (TGF-β). M1-macrofagen, die worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van de oppervlaktemarker CD86, zijn de primaire aanstichters van de ontstekingsreactie bij silicose, terwijl M2-macrofagen, die worden gemarkeerd door CD206, verantwoordelijk zijn voor de fibrotische fase van de aandoening10. Bij dubbel blootgestelde muizen induceerde nicotine de polarisatie van macrofagen in de richting van het M2-fenotype in door silica beschadigde longen, waardoor longfibrose werd bevorderd. Bovendien is TGF-β1 de sleutel tot de inductie van fibrose en EMT11; de verhoogde expressie van TGF-β1 versnelde de progressie van longfibrose door EMT. Dit model analyseerde met succes de effecten van nicotine op silicose en benadrukte verder het belang van stoppen met nicotine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (de 8e editie van de NRC) en werden goedgekeurd door de Anhui University of Science and Technology Animal Ethics Committee.
1. Voorbereiding van dieren
- Huisvest 32 mannelijke C57/BL6 muizen van 8 weken oud in een laboratorium met een licht/donkercyclus van 12 uur. Zorg ervoor dat de muizen vrije toegang hebben tot voedsel en water.
- Na 2 weken gewenning aan de omgeving, wanneer de 10 weken oude muizen 23-26 g wegen, gebruikt u willekeurige getallen die door een computer zijn gegenereerd om de dieren willekeurig te groeperen zonder te partitioneren, wat resulteert in vier groepen muizen: de controlegroep (Con), de nicotinegroep (Nic), de silicagroep (SiO 2) en de nicotinegroep gecombineerd met silicagroep (Nic+ SiO2).
2. Nicotine preparaat
OPMERKING: De nicotinedichtheid is 1.01 g/ml.
- Los de nicotine op in watervrije ethanol en verdun 20x om een nicotinevoorraadoplossing van 50 mg/ml te bereiden.
- Verdun de nicotinevoorraadoplossing 1.000x met steriele normale zoutoplossing om een werkoplossing te maken met een concentratie van 0,05 mg/ml.
NOTITIE: Bewaar nicotine uit de buurt van licht. De stockoplossing kan maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
3. Silica bereiding
- Suspendeer steriel kristallijn silica in zoutoplossing om een silicasuspensie van 20 mg/ml te bereiden en oscilleer het gedurende 25 minuten in een ultrasoon schudwaterbad.
- Schud de silicasuspensie met een vortex-oscillator gedurende 3 minuten voordat de muizen het neusinfuus krijgen. Meng de silicasuspensie door 2x-3x op en neer te pipetteren met een pipet van 200 μL en neem vervolgens 50 μL op voor het neusinfuus.
OPMERKING: De siliciumdioxide-suspensie moet zo snel mogelijk worden gemengd en toegediend via een neusinfuus.
4. Muizenvangst en blootstelling aan nicotine
- Weeg de muizen en noteer de gewichten dagelijks voor blootstelling.
- Injecteer op dag 1-40 tweemaal daags subcutaan nicotine (met een tussenpoos van 12 uur) in de muizen in de Nic- en Nic+ SiO2-groepen . Gebruik een nicotinedosis van 0,25 mg/kg; Zorg er bijvoorbeeld voor dat een muis van 25 g 6,25 μg nicotine binnenkrijgt. Voor deze muis zou het injectievolume als volgt zijn: 6,25/0,05 = 125 μL. Injecteer tegelijkertijd de muizen in de Con-groep met een gelijk volume zoutoplossing.
- Bereid de vereiste spuiten van 1 ml voor elke groep voor en gebruik ze om het injectievolume van nicotine of zoutoplossing op te zuigen. Voordat u de nicotine opneemt, zuigt u eerst 0,1-0,2 ml lucht in de spuit en zuigt u vervolgens 125 μL nicotine op. Tik voorzichtig op de spuit om de naald en het voorste uiteinde van de spuit met de nicotine te vullen. Plaats de nicotinehoudende spuit in een bakje dat beschermd is tegen licht.
OPMERKING: Op het moment van injectie bevindt zich 0,1-0,2 ml lucht achter de nicotine, wat garandeert dat alle vloeistof met succes aan de muis wordt toegediend. - Pak de staart van de muis vast met de rechterhand en wanneer het dier ontspant, gebruik dan de linkerduim en wijsvinger om de huid op de achterkant van de nek van de staart naar het hoofd tot aan de rand van het oor te drukken, waarbij u matige druk uitoefent. Laat daarna de rechterhand los en gebruik de linker kleine duim en ringvinger om de staart en achterpoten te knijpen, waarna de muis volledig wordt geïmmobiliseerd door de linkerhand.
NOTITIE: Pak de muis met de juiste kracht vast. Onvoldoende kracht maakt het gemakkelijk voor muizen om te bijten, terwijl overmatige kracht kan leiden tot verstikking van de muizen. - Gebruik de rechterhand om te injecteren, doorboor de huid aan de achterkant van de nek bij de oorrand van de muizen in een kop-tot-staartrichting met de spuit en injecteer met nicotine met een uniforme snelheid. Zoek naar een halfronde huiduitstulping die wijst op een succesvolle injectie.
OPMERKING: Wanneer de naald in de huid is geprikt, zal er een gevoel van weerstand zijn; De weerstand verdwijnt nadat de naald is ingebracht. Op dit punt moet de naald iets worden teruggetrokken om langzaam en gelijkmatig te injecteren.
5. Blootstelling aan silica in vivo
- Breng op dag 5-19 de siliciumdioxidesuspensie in de neusholte van de muizen in de SiO 2- en Nic+ SiO2-groepen. Verdoof elke muis snel met 2% isofluraan in een anesthesieapparaat in een dosis van 3,6 ml/uur. Plaats de muis na anesthesie op de palm van één hand en leg de neusholte van de muis bloot. Druppel 50 μL silicasuspensie in de neusholte binnen 4-8 s.
- Om de silicasuspensie zo snel mogelijk in de longen te laten komen, drukt u na indruppeling zachtjes met de wijsvinger op het hart van de muis gedurende 3-5 s, 3x-5x per seconde, om de ademhalingsfrequentie te bevorderen.
- Nadat de ademhaling van de muis geleidelijk uniform is geworden, plaatst u de muis in een kooi om gedurende 3 minuten te observeren.
- Herhaal stap 1-3 voor alle muizen die de silicasuspensie krijgen. Druppel in de controlegroep 50 μL steriele zoutoplossing in de neusholte op dag 5-19.
6. Verwerving van vers en gefixeerd longweefsel
- Gebruik op dag 41 50 mg/kg natriumpentobarbital om de muizen intraperitoneaal te verdoven in een dosis van 0,1 ml/20 g op basis van hun lichaamsgewicht. Bevestig de ledematen op een schuimrubberen testplaat en spuit de vacht in met 75% alcohol.
- Voer hartperfusie uit om vers longweefsel te verkrijgen, snijd de middellijn van de buik door om de borstholte bloot te leggen en maak een kleine opening aan de top van het rechterhart. Injecteer vervolgens langzaam en gelijkmatig 20 ml voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) vanaf de top van het linkerhart, waardoor het bloed uit de opening stroomt die aan de top van het rechterhart is gemaakt. Haal de hele longkwab eruit, plaats deze in een voorgekoelde centrifugebuis van 1,5 ml en breng over naar -80 °C voor opslag in afwachting van eiwitextractie.
- Doordrenk andere muizen met 20 ml voorgekoelde PBS gevolgd door 10 ml 4% paraformaldehyde op dezelfde locatie om de hele longen te fixeren; bewaar elke long in 30 ml 4% PFA.
- Na 72 uur het vaste longweefsel inbedden in paraffine.
- Dompel het longweefsel onder in het bereide fixeermiddel in een ultrasoon waterbad bij 40 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door een dehydratatieproces in 75% ethanol, 95% ethanol en watervrije ethanol gedurende elk 50 minuten.
- Was 2x met xyleen gedurende 50 min elk.
- Plaats het weefsel gedurende 2-3 uur in gesmolten paraffinewas bij 55-60 °C, zodat het xyleen in het longweefsel geleidelijk wordt vervangen door paraffinewas.
- Fixeer het longweefsel in het inbeddingsframe met paraffine en wacht tot het wasblok is uitgehard. Nadat het wasblok is uitgehard, gebruikt u de paraffinesnijmachine om de long op 4-5 μm te snijden.
- Plaats de longsecties in ultrapuur water van 45 °C. Zodra de paraffine is gesmolten, laadt u het longgedeelte op een aanhangend microscoopglaasje.
7. Hematoxyline en eosine (HE) kleuring
- Bak de glaasjes 2 uur op 60 °C en leg de glaasjes 2 x 30 min in xyleen om te ontwaxen. Plaats vervolgens de objectglaasjes elk gedurende 5 minuten in watervrije ethanol, 95% ethanol, 85% ethanol en 75% ethanol. Was ze tot slot 3 x 5 min met ultrapuur water.
- Druppel 50 μL hematoxylinekleuringsoplossing op het longweefsel met een pipetpistool en kleuring gedurende 5 minuten; Was de plakjes vervolgens 5 minuten onder stromend water.
- Voeg 50 μL 2% zoutzuur in ethanol toe aan de sectie en spoel gedurende 30 s af met gedestilleerd water. Voeg vervolgens 50 μL eosinekleuringsoplossing toe aan het longweefsel om gedurende 1 minuut te kleuren.
- Dehydrateer, transparantiseer en sluit de paraffinesecties af.
- Voeg 100-150 ml 75% ethanol, 85% ethanol, 95% ethanol, watervrije ethanol en xyleen toe aan een gecombineerde plastic verftank. Leg de glaasjes in 75%, 85%, 95% en watervrije ethanol gedurende elk 5 minuten om uit te drogen.
- Plaats de objectglaasjes vervolgens 5 minuten in xyleen om te transparanteren.
- Laat ten slotte 20 μL neutrale kauwgom op het longgedeelte vallen en plaats een dekglaasje over het glaasje om het af te dichten.
NOTITIE: De bovenstaande stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
8. Masson-kleuring
- Ontwax, hydrateer en was de paraffinesecties zoals beschreven in stap 7.1.
- Kleur de secties met 50 μL geconfigureerde Weigert's hematoxylinekleuringsoplossing gedurende 7 minuten, gevolgd door 50 μL zure ethanolfractioneringsoplossing gedurende 10 s, en was met stromend water om de kernen blauw te kleuren.
- Kleur de secties gedurende 4 minuten met 50 μL Masson trichroomoplossing en was ze met water.
- Spoel de secties gedurende 1 minuut af met gedestilleerd water en beits ze vervolgens gedurende 7 minuten met Lichun red acid magenta.
- Was de secties gedurende 1-2 minuten met een zwakke zure werkoplossing (30% zoutzuur), gedurende 1-2 minuten met fosfomolybdinezuur en gedurende 1-2 minuten met een zwakke zure werkoplossing.
- Kleur de secties gedurende 2 minuten in anilineblauwe kleuroplossing en was ze vervolgens gedurende 1 minuut met een zwak zure werkoplossing.
- Dehydrateer de secties gedurende 1 s met 95% ethanol, gevolgd door watervrije ethanol, transparant met xyleen gedurende 1 s en sluit ten slotte af met neutrale hars zoals beschreven in stap 7.4.
9. Immunohistochemie
- Bak de plakken 6 uur op 60 °C. Ontwax, hydrateer en was de paraffinesecties zoals beschreven in stap 7.1.
- Antigeenretje: plaats de plakjes in een hittebestendige plastic snijdoos met voldoende citraatantigeenoplossing om de plakjes onder te dompelen en kook gedurende 20-30 minuten.
- Koel af tot kamertemperatuur, verwijder de secties en spoel af met gedeïoniseerd water. Laat vervolgens 2 x 5 minuten weken in PBS met 0,5% Tween-20 (PBST).
- Teken met een hydrofobe pen een lus in de buurt van het longgedeelte op het objectglaasje om een hydrofobe cirkel te vormen.
- Voeg 50 μL 3% waterstofperoxide-oplossing (3% H2Ø2) druppelsgewijs toe aan de plakjes en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht voor de inactivering van endogeen peroxidase.
- Week de plakjes 3 x 5 minuten in PBST.
- Voeg druppelsgewijs 50 μL 5% runderserumeiwit (BSA)-PBST toe aan de plakjes en laat 1 uur bij kamertemperatuur staan.
- Gooi de blokkerende oplossing weg, voeg 50 μl van de verdunde primaire antilichamen CD206 (verdunning: 1:1.500), TGF-β1 (verdunning: 1:200) en vimentine (verdunning: 1:2.000) druppelsgewijs toe aan de plakjes en incubeer een nacht bij 4 °C.
OPMERKING: In dit werk werden alle antilichamen verdund in 5% BSA. - Zet de plakjes de volgende dag terug op kamertemperatuur (40 min). Was de plakjes zoals beschreven in stap 9.6.
- Verdun het secundaire antilichaam in 5% BSA. Voeg druppelsgewijs 50 μl mierikswortelperoxidase-gelabeld secundair antilichaam (verdunning: 1:500) toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de plakjes zoals beschreven in stap 9.6.
- Druppel 50 μL 3,3'-diaminobenzidine (DAB)-oplossing overeenkomend met het enzymgelabelde secundaire antilichaam op het longweefsel en incubeer gedurende 5-10 minuten in een zwarte immunohistochemische natte doos. Observeer onder de microscoop totdat de kleur zich ontwikkelt tot een sterk bruin. Spoel de plakjes af met gedestilleerd water om de reactie te beëindigen.
OPMERKING: Bruine verkleuring wordt beschouwd als positieve kleuring. - Vlek met 50 μL hematoxylinevlek gedurende 30 s en was met stromend water. Week vervolgens de plakjes in 75%, 85%, 95% en watervrije ethanol gedurende elk 3 minuten en vervolgens in xyleen gedurende 2 x 10 minuten. Sluit de glaasjes af zoals beschreven in stap 7.4.
10. Analyse van de western blot
- Haal het longweefsel uit de vriezer en weeg het. Voeg vervolgens 150 μL RIPA lysisbuffer met PMSF per 20 mg longweefsel toe. Lyseer de longen van de muis gedurende 3-5 minuten op ijs met behulp van een handhomogenisator, schud zachtjes gedurende 2 uur bij 4 °C om voldoende lysis van het longweefsel mogelijk te maken, centrifugeer bij 4 °C en 14.800 × g gedurende 15 minuten en vang het supernatant op.
OPMERKING: Voeg een paar minuten voor gebruik van de RIPA lysisbuffer 100 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) toe. De uiteindelijke concentratie PMSF is 1 mM (bijv. 10 μL PMSF + 990 μL RIPA). - Gebruik een BCA-eiwitconcentratiekit om de eiwitconcentratie van het monster te bepalen door de instructies van de fabrikant te volgen. Verdun na bepaling, met de kleinste concentratie eiwitlysaat als basis, dezelfde partij eiwitlysaat met RIPA tot de kleinste concentratie om dezelfde massa en hetzelfde volume te bereiken.
OPMERKING: De totale hoeveelheid longweefsel die wordt belast, is 30 μg. - Voeg 40 μL 5x laadbuffer toe aan 160 μL eiwitlysaat en verwarm dit gedurende 10 minuten op 100 °C.
- Monteer de voorbereide 10% natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)-gel in het western blotting-elektroforesesysteem, voeg de SDS-PAGE-elektroforesebuffer toe, trek voorzichtig de elektroforesekam eruit en voeg langzaam en gelijkmatig 20 μL eiwitmonster per putje toe. Schakel de stroom in en start de elektroforese op 80 V gedurende 30 minuten. Nadat de eiwitten de onderste gellaag hebben bereikt, schakelt u over naar 100 V en gaat u door met de elektroforese gedurende 60-70 minuten.
OPMERKING: Elektroforese heeft een nieuwe elektroforesebuffer nodig. - Breng de eiwitten over naar een PVDF-membraan door middel van natte overdracht. Activeer het PVDF-membraan vooraf met methanol (5-30 s). Haal de elektroforese-gelplaat eruit, wrik deze voorzichtig open, plaats de separatorgel in de natte transferbuffer, maak de elektrische transfersandwich en monteer het natte transfersysteem. Vul de elektroforesetank met overdrachtsbuffer en breng gedurende 90 minuten over op 400 mA.
OPMERKING: De transferbuffer wordt van tevoren gekoeld om de effecten van hoge temperaturen tijdens de natte transfer te voorkomen. - Was het PVDF-membraan met Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,5% Tween-20 (TBST) gedurende 3 x 5 min. Blokkeer het PVDF-membraan met 5% magere melk verdund in TBST en incubeer op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten; Was vervolgens met TBST gedurende 2 min. Na het wassen het membraan een nacht bij 4 °C incuberen met het primaire antilichaam vimentine (1:5.000) en GAPDH (1:10.000) verdund in 5% BSA.
- Plaats het membraan 30 minuten op kamertemperatuur en was het 5 x 5 minuten met TBST. Incubeer na het wassen het membraan met het secundaire antilichaam (1:10.000) verdund in 5% magere melk gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats het membraan met de eiwitkant naar boven, laat de bereide ECL-werkoplossing vallen, incubeer gedurende 1-2 minuten en observeer de resultaten met een gelimager. Gebruik de grijswaardenwaarden die door de software in de gelimager worden gemeten om de eiwitexpressieniveaus te evalueren.
OPMERKING: Hier diende GAPDH als interne referentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een muismodel om nicotine in combinatie met blootstelling aan silica te bestuderen, werd opgesteld om de mogelijke rol van nicotine in de progressie van silicose bij muizen te onderzoeken. Figuur 1 toont de experimentele procedure voor het gebruik van een muismodel met dubbele belichting, waarbij een nicotine-injectie werd gecombineerd met de nasale instillatie van een silicasuspensie. De pathologische veranderingen van de muizen in elke groep werden waargenomen met behulp van HE-kleuring. De muizen die werden blootgesteld aan nicotine in combinatie met silica hadden significant ernstigere longschade dan degenen die alleen aan nicotine of silica waren blootgesteld. Lymfocyten namen toe in de buurt van de lymfevaten in de longen van de aan nicotine blootgestelde muizen en vormden inflammatoire celclusters. Masson-kleuring onthulde een significante toename van de afzetting van collageenvezels in de longen die werden blootgesteld aan nicotine in combinatie met silica in vergelijking met de longen in de andere groepen, en dit werd ondersteund door de kwantificering van Masson-kleuring (Figuur 2). De alveolaire structuur werd vernietigd in de aan silica blootgestelde muizen en het aantal macrofagen nam toe. Na blootstelling aan nicotine in combinatie met silica was er echter sprake van aanzienlijke infiltratie van ontstekingscellen en verschenen fibroblastknobbeltjes. Bovendien zijn geaccumuleerde macrofagen, vooral M2-macrofagen, aanwezig in de dubbel blootgestelde groep. M2-macrofagen zijn essentieel voor het gevorderde fibrotische stadium van silicose.
Bovendien werd een significante toename van de pro-fibrotische factor TGF-β1 waargenomen door immunohistochemische (IHC) kleuring in de longen van dubbel blootgestelde muizen, vooral in ontstekingscellen in de buurt van lymfevaten (Figuur 3). TGF-β1 uitgescheiden door macrofagen bevordert de EMT van epitheelcellen en longfibrose12. Vergeleken met muizen die alleen aan silica werden blootgesteld, waren de vimentinespiegels significant verhoogd in de longen van muizen met dubbele blootstelling. Zowel IHC-kleuring als eiwitkwantificering duidden op ernstige EMT bij muizen met dubbele blootstelling (Figuur 4). Het gecombineerde bewijs suggereert dat chronische blootstelling aan silica EMT bevordert na de opregulatie van TGF-β1, wat leidt tot een toename van fibroblasten en progressieve fibrose. Tegelijkertijd versnelt de toevoeging van nicotine het proces van longfibrose door EMT te verergeren, waardoor longfibrose eerder kan optreden. Dit model is ontworpen om de impact van nicotine op longfibrose te onderzoeken, wat een gevolg is van chronische blootstelling aan silica bij mensen.
Figuur 1: Ontwerp van een experimenteel model van gecombineerde blootstelling aan nicotine en silica bij muizen. Continue injectie van nicotine gedurende 1-40 dagen en continue nasale instillatie van silica gedurende 5-19 dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Nicotine bevordert de vorming van fibroblastische massa's in de longen van aan silica blootgestelde muizen. (A) HE-kleuring werd gebruikt om pathologische veranderingen in de longen te visualiseren. De dubbel blootgestelde muizen hadden ernstige inflammatoire celinfiltratie en fibrose. De groene pijlen geven ontstekingscelmassa's aan. Schaalbalk = 50 μm. (B) Masson-kleuring werd gebruikt om collageenvezels in de longen aan te tonen. Schaalbalk = 50 μm. (C) Kwantificering van collageenvezels in de longen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Verhoogde CD206-positieve cellen en TGF-β1 in de longen van nicotine- en silicamuizen die dubbel zijn blootgesteld. (A) IHC-kleuring van CD206 werd gebruikt om de verdeling en expressie van macrofagen in de dubbel blootgestelde muizen te observeren. CD206-positieve macrofagen namen toe in de longen van muizen na gecombineerde blootstelling aan nicotine en silica. De korte pijlen vertegenwoordigen CD206-positieve cellen. Schaalbalk = 50 μm. (B) TGF-β1, een promotor van fibrose, was verhoogd bij muizen met dubbele blootstelling. De lange pijlen vertegenwoordigen TGF-β1-positieve cellen. Schaalbalk = 50 μm. (C,D) AOD van CD206 en TGF-β1. AOD = IOD (geïntegreerde optische dichtheid)/oppervlakte. De AOD geeft de concentratie van CD206 en TGF-β1 per oppervlakte-eenheid weer. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Afkortingen: TGF-β1 = transformerende groeifactor-bèta; IHC = immunohistochemie; AOD = gemiddelde optische dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Bevordering van longfibrose door nicotine bij aan silica blootgestelde muizen door de verergering van EMT. (A) De expressie van vimentine in elke groep werd waargenomen door IHC-kleuring. Vimentine kwam sterk tot expressie in de longen van de muizen die werden blootgesteld aan nicotine en silica. Schaalbalk = 50 μm.(B) Western blot van vimentine-expressie in elke blootstellingsgroep, met een toename van vimentine in de longweefsels van dubbel blootgestelde muizen. (C) De AOD-waarde van vimentine was significant hoger in de dubbel blootgestelde groep in vergelijking met de andere groepen. (D) Het relatieve eiwitexpressieniveau van vimentine in vergelijking met GAPDH. De vimentine-expressie in de groep met dubbele blootstelling was significant hoger dan in de groepen met blootstelling aan nicotine of silica. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Afkortingen: EMT = epitheliale-mesenchymale overgang; AOD = gemiddelde optische dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een diermodel met dubbele blootstelling is nodig om de rol en de mogelijke mechanismen van gelijktijdige blootstelling aan nicotine en kristallijn siliciumdioxide te onderzoeken. Dit model werd in dit werk bereikt door de subcutane injectie van nicotine en het neusinfuus van silica. Om een succesvolle nicotine-injectie te garanderen, moet de operator vertrouwd raken met het vastpakken van de muizen, omdat het vastpakken van de huid aan de achterkant van de nek pijnlijk voor hen kan zijn. Daarom is het belangrijk om de muizen geleidelijk te laten wennen aan het grijpen. Bovendien is een cruciale stap in de blootstelling aan silica bij muizen het neusinfuus. Om het succes van de procedure en de overlevingskans van de muizen te vergroten, is het essentieel om de neusdruppel vooraf te oefenen.
Bij het uitvoeren van de injectie moet de spuit over het hoofd van de muis worden geveegd om een sterke worsteling te voorkomen wanneer de muis de spuit ziet. De staart van de muis moet stevig worden vastgepakt met de rechterhand, terwijl de linkerhand moet worden gebruikt om de huid voorzichtig en voorzichtig tot aan de oorrand aan de achterkant van de nek te duwen en daar in de huid te knijpen. Nadat de staart van de muis met de rechterhand is losgelaten, moeten de staart en achterpoten worden gestabiliseerd met de linkerduim en ringvinger om bijten te voorkomen. Met behulp van een spuit van 1 ml in de rechterhand moet de naald in een hoek van 30° in de losse huid boven de nek worden gestoken in een hoek van kop tot staart. De naald moet iets worden teruggetrokken nadat de weerstand verloren is gegaan en de injectie moet langzaam en gelijkmatig worden toegediend. Op dag 5-19 werden muizen in de dubbel blootgestelde groep blootgesteld aan nicotine en silica. Het wordt aanbevolen om de nicotine om 08:00 uur te injecteren, gevolgd door het neusinfuus met siliciumdioxide om 14:00 uur en nog een injectie met nicotine om 20:00 uur. De twee nicotine-injecties moeten met een tussenpoos van 12 uur worden gegeven om de effecten van herhaaldelijk grijpen op de muizen te voorkomen.
Het uitvoeren van subcutane injecties en neusinfuus brengt verschillende technische uitdagingen met zich mee. Voor subcutane injecties moeten de muizen met de juiste kracht worden vastgepakt. Als de huid aan de achterkant van de nek te strak wordt geknepen, wordt de luchtweg van de muis geblokkeerd, wat snel tot verstikking leidt. Voor optimale sterkte moet de huid aan de achterkant van de nek worden samengeknepen totdat de oogbollen iets uitsteken. Op dit moment voelt de muis de minste pijn en ademt hij soepel. Bovendien moet een spuit van 1 ml worden gebruikt die wordt geleegd om de nicotine-injectie uit de buis te zuigen, gevolgd door nog eens 0,1-0,2 ml lucht. Alvorens te injecteren, moeten de belletjes voorzichtig worden weggevaagd. Vanwege het kleine volume van de injectie kan de nicotine die aan de punt van het uiteinde van de naald achterblijft, leiden tot een onvoldoende dosis. De belangrijkste onderdelen van de injectie zijn het snel inbrengen van de naald, het langzaam injecteren van de nicotine en het voorzichtig verwijderen van de naald. Voor neusinfuus werd in deze studie de neusholte van de muizen volledig blootgelegd onder diepe anesthesie, gevolgd door de langzame en uniforme instillatie van een siliciumdioxidesuspensie. Het is ook belangrijk om zachtjes op de borstholte te drukken na blootstelling aan silica om hoesten of verstikking te voorkomen.
Dit model heeft bepaalde beperkingen. De silicadeeltjes van 1-5 μm die in de experimenten werden gebruikt, werden niet uit de omgeving verzameld en waren pure silicadeeltjes. In de praktijk daarentegen kunnen werknemers worden blootgesteld aan een verscheidenheid aan gevaarlijke materialen, niet alleen aan silicadeeltjes, zoals een mengsel van steenkool en silicastof in een keramische fabriek of een kolenmijn. We gebruikten nasale instillatie silica om lage doses en herhaalde meervoudige blootstellingen te bereiken om de chronische blootstelling van werknemers te simuleren. In het muismodel met dubbele blootstelling, hoewel de nicotine niet afkomstig is van blootstelling aan sigarettenrook, komt de geïnjecteerde nicotine rechtstreeks in de bloedbaan terecht, waardoor een meer gerichte verkenning van de rol van nicotine in het silicoseproces en het vermijden van de effecten van andere componenten van sigarettenrook mogelijk is.
Wetenschappelijk onderzoek naar silicose heeft doorgaans gebruik gemaakt van muismodellen met één factor, hetzij door inhalatie of bronchiale perfusie van silica, om de rol van silica bij de ontwikkeling van ziekten te beoordelen. Een alternatieve benadering is de nasale instillatie van siliciumdioxide, die eenvoudig en gemakkelijk is en het mogelijk maakt om modellen voor herhaalde en chronische blootstelling aan silica op te stellen13. Het gevestigde siliciumdioxide-neusdruppelmodel veroorzaakt minimale schade aan de muizen en kan worden gecombineerd met andere factoren om een multifactorieel blootgesteld diermodel te creëren. Bovendien zijn de belangrijkste methoden voor blootstelling aan nicotine bij muizen nicotine in drinkwater, subcutane injectie van nicotine, nicotine-infusie via osmotische minipompen en blootstelling aan tabaksrook14. De subcutane injectie die in het model met dubbele blootstelling wordt gebruikt, maakt het mogelijk om de dosering en timing van nicotine nauwkeurig in te stellen, zodat elke muis dezelfde dosis krijgt toegediend.
Kortom, het diermodel van nicotine in combinatie met blootstelling aan silica repliceert een realistisch chronisch blootstellingspatroon, en dit model kan worden gebruikt voor verder onderzoek naar de effecten van nicotine op ontstekingen en fibrose bij de ontwikkeling van silicose. Bovendien dient dit model als basis voor het vormen van een diermodel met dubbele blootstelling met meerdere doses en tijdsbestekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het University Synergy Innovation Program van de provincie Anhui (GXXT-2021-077) en het Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
