Nicotine gebruiken in een aan silica blootgesteld muismodel om de overgang van longepitheel naar mesenchym te bevorderen
Summary
Deze studie beschrijft een muismodel om het synergetische effect van nicotine op de progressie van longfibrose bij experimentele silicosemuizen te bestuderen. Het muismodel met dubbele blootstelling simuleert de pathologische progressie in de long na gelijktijdige blootstelling aan nicotine en silica. De beschreven methoden zijn eenvoudig en zeer reproduceerbaar.
Abstract
Roken en blootstelling aan silica komen vaak voor bij beroepswerkers, en silica heeft meer kans om de longen van rokers te beschadigen dan niet-rokers. De rol van nicotine, het belangrijkste verslavende ingrediënt in sigaretten, bij de ontwikkeling van silicose is onduidelijk. Het muismodel dat in deze studie werd gebruikt, was eenvoudig en gemakkelijk te controleren, en simuleerde effectief de effecten van chronische nicotine-inname en herhaalde blootstelling aan silica op longfibrose door epitheliale-mesenchymale overgang bij mensen. Bovendien kan dit model helpen bij de directe studie van de effecten van nicotine op silicose, terwijl de effecten van andere componenten in sigarettenrook worden vermeden.
Na aanpassing aan de omgeving werden muizen subcutaan geïnjecteerd met 0,25 mg/kg nicotine-oplossing in de losse huid boven de nek, elke ochtend en avond met tussenpozen van 12 uur gedurende 40 dagen. Bovendien werd kristallijn silicapoeder (1-5 μm) gesuspendeerd in normale zoutoplossing, verdund tot een suspensie van 20 mg/ml en gelijkmatig gedispergeerd met behulp van een ultrasoon waterbad. De met isofluraan verdoofde muizen inhaleerden 50 μL van deze silicastofsuspensie via de neus en werden gewekt via borstmassage. Blootstelling aan silica werd dagelijks toegediend op dag 5-19.
Het dubbel blootgestelde muismodel werd blootgesteld aan nicotine en vervolgens aan silica, wat overeenkomt met de blootstellingsgeschiedenis van werknemers die aan beide schadelijke factoren zijn blootgesteld. Bovendien bevorderde nicotine longfibrose door epitheliale-mesenchymale transformatie (EMT) bij muizen. Dit diermodel kan worden gebruikt om de effecten van meerdere factoren op de ontwikkeling van silicose te bestuderen.
Introduction
Blootstelling aan silica bij werknemers is onvermijdelijk in sommige beroepsomgevingen, en eenmaal blootgesteld aan silica vordert de verslechtering, zelfs na verwijdering uit het milieu. Bovendien roken de meeste van deze werknemers en bevatten traditionele sigaretten duizenden chemicaliën, met als belangrijkste verslavende bestanddeel nicotine1. E-sigaretten worden steeds populairder in jongere leeftijdsgroepen2; Deze e-sigaretten fungeren als een nicotineafgiftesysteem en vergroten de toegang tot nicotine, waardoor de longgevoeligheid en longontsteking toenemen3. Sigarettenrook versnelt ook longfibrose bij aan bleomycine blootgestelde muizen4 en verhoogt de longtoxiciteit en fibrose bij aan silica blootgestelde muizen 5,6. Of nicotine het ontstekings- en longfibroseproces veroorzaakt door silica kan beïnvloeden, moet echter nog worden onderzocht.
Het silicose-muismodel dat tot stand komt door de eenmalige inademing van een hoge dosis silica in de luchtpijp is traumatisch voor muizen. Hoewel deze methode snel een silicosemodel oplevert, komt het niet overeen met de realiteit van een omgeving waar werknemers herhaaldelijk worden blootgesteld aan silica. Daarom hebben we een aan silica blootgesteld muismodel opgesteld door herhaaldelijk een lage dosis silicasuspensies te geven via een neusinfuus; Deze dosis kan ontstekingen en fibrose bij muizen veroorzaken.
Om de effecten van andere sigarettencomponenten te omzeilen, werd dit muismodel subcutaan met nicotine in de losse huid van de nek geïnjecteerd om het effect van de verslavende component, nicotine, op silicose te bepalen. Door subcutane injecties toe te dienen, kan een nauwkeurige dosering worden bereikt, waardoor het mogelijk wordt om nicotineblootstellingsmodellen te maken en dosistoxiciteitsreacties en verslaving te observeren. Bij mannelijke muizen is een nicotineverslavingsmodel ontwikkeld, met een nicotine-injectiedosis van 0,2-0,4 mg/kg 7,8. In dat model werden, om te voldoen aan de drugsbehoeften van de verslaafde muizen, twee subcutane injecties toegediend met tussenpozen van 12 uur. Dit nicotineverslavingsmodel bij muizen is nuttig voor het simuleren van menselijke rookgewoonten en blootstelling aan silica.
Enkelvoudige diermodellen hebben beperkingen in ziektestudies, terwijl de hier beschreven methode een tweefactormuismodel van gelijktijdige blootstelling aan nicotine en silica omvat. Voorafgaand aan de blootstelling aan silica werden de muizen vooraf blootgesteld aan nicotine om de blootstelling aan nicotine bij mensen die roken na te bootsen. Vervolgens vond van dag 5 tot dag 19 blootstelling aan silica plaats om blootstelling aan silica na te bootsen in een werkomgeving voor personen met een voorgeschiedenis van roken.
Van alveolaire macrofagen is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij de regulatie van longontsteking en fibrose. Macrofagen kunnen silica niet afbreken bij het inademen van silica, wat leidt tot macrofaagpolarisatie of apoptose9 en het vrijkomen van cytokines zoals tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en transformerende groeifactor bèta (TGF-β). M1-macrofagen, die worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van de oppervlaktemarker CD86, zijn de primaire aanstichters van de ontstekingsreactie bij silicose, terwijl M2-macrofagen, die worden gemarkeerd door CD206, verantwoordelijk zijn voor de fibrotische fase van de aandoening10. Bij dubbel blootgestelde muizen induceerde nicotine de polarisatie van macrofagen in de richting van het M2-fenotype in door silica beschadigde longen, waardoor longfibrose werd bevorderd. Bovendien is TGF-β1 de sleutel tot de inductie van fibrose en EMT11; de verhoogde expressie van TGF-β1 versnelde de progressie van longfibrose door EMT. Dit model analyseerde met succes de effecten van nicotine op silicose en benadrukte verder het belang van stoppen met nicotine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een diermodel met dubbele blootstelling is nodig om de rol en de mogelijke mechanismen van gelijktijdige blootstelling aan nicotine en kristallijn siliciumdioxide te onderzoeken. Dit model werd in dit werk bereikt door de subcutane injectie van nicotine en het neusinfuus van silica. Om een succesvolle nicotine-injectie te garanderen, moet de operator vertrouwd raken met het vastpakken van de muizen, omdat het vastpakken van de huid aan de achterkant van de nek pijnlijk voor hen kan zijn. Daarom is het belangrijk om de mu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het University Synergy Innovation Program van de provincie Anhui (GXXT-2021-077) en het Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
