Summary
Este estudio describe un modelo de ratón para estudiar el efecto sinérgico de la nicotina en la progresión de la fibrosis pulmonar en ratones experimentales de silicosis. El modelo de ratón de doble exposición simula la progresión patológica en el pulmón después de la exposición simultánea a la nicotina y la sílice. Los métodos descritos son simples y altamente reproducibles.
Abstract
El tabaquismo y la exposición a la sílice son comunes entre los trabajadores ocupacionales, y es más probable que la sílice dañe los pulmones de los fumadores que de los no fumadores. El papel de la nicotina, el principal ingrediente adictivo de los cigarrillos, en el desarrollo de la silicosis no está claro. El modelo de ratón empleado en este estudio fue simple y fácil de controlar, y simuló eficazmente los efectos de la ingestión crónica de nicotina y la exposición repetida a la sílice sobre la fibrosis pulmonar a través de la transición epitelio-mesénquima en seres humanos. Además, este modelo puede ayudar en el estudio directo de los efectos de la nicotina sobre la silicosis y evitar los efectos de otros componentes en el humo del cigarrillo.
Después de la adaptación ambiental, los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 0,25 mg/kg de solución de nicotina en la piel suelta sobre el cuello todas las mañanas y noches a intervalos de 12 h durante 40 días. Además, el polvo de sílice cristalina (1-5 μm) se suspendió en solución salina normal, se diluyó hasta obtener una suspensión de 20 mg/ml y se dispersó uniformemente mediante un baño de agua ultrasónico. Los ratones anestesiados con isoflurano inhalaron 50 μL de esta suspensión de polvo de sílice a través de la nariz y fueron despertados mediante un masaje torácico. La exposición a sílice se administró diariamente en los días 5-19.
El modelo de ratón de doble exposición fue expuesto a nicotina y luego a sílice, lo que coincide con el historial de exposición de los trabajadores que están expuestos a ambos factores nocivos. Además, la nicotina promovió la fibrosis pulmonar a través de la transformación epitelio-mesenquimal (EMT) en ratones. Este modelo animal se puede utilizar para estudiar los efectos de múltiples factores en el desarrollo de la silicosis.
Introduction
La exposición a la sílice en los trabajadores es inevitable en algunos entornos ocupacionales, y una vez expuestos a la sílice, el deterioro progresa incluso después de la eliminación del medio ambiente. Además, la mayoría de estos trabajadores fuman, y los cigarrillos tradicionales contienen miles de sustancias químicas, siendo el principal componente adictivo la nicotina. Los cigarrillos electrónicos se están volviendo cada vez más populares en los grupos de edad más jóvenes2; Estos cigarrillos electrónicos actúan como un sistema de administración de nicotina y aumentan el acceso a la nicotina, lo que aumenta la susceptibilidad pulmonary la neumonía. El humo del cigarrillo también acelera la fibrosis pulmonar en ratones expuestos a bleomicina4 y aumenta la toxicidad pulmonar y la fibrosis en ratones expuestos a sílice 5,6. Sin embargo, aún no se ha investigado si la nicotina puede afectar el proceso inflamatorio y de fibrosis pulmonar causado por la sílice.
El modelo de ratón de silicosis establecido por la inhalación única de una dosis alta de sílice en la tráquea es traumático para los ratones. Aunque este método proporciona rápidamente un modelo de silicosis, no coincide con la realidad de un entorno en el que los trabajadores están expuestos repetidamente a la sílice. Por lo tanto, establecimos un modelo de ratón expuesto a sílice administrando repetidamente una dosis baja de suspensiones de sílice a través de un goteo nasal; Esta dosis puede causar inflamación y fibrosis en ratones.
Para eludir los efectos de otros componentes del cigarrillo, este modelo de ratón se inyectó subcutáneamente con nicotina en la piel suelta del cuello para determinar el efecto del componente adictivo, la nicotina, sobre la silicosis. Mediante la administración de inyecciones subcutáneas, se puede lograr una dosificación precisa, lo que permite crear modelos de exposición a la nicotina y observar las respuestas de toxicidad por dosis, así como la adicción. Se ha desarrollado un modelo de adicción a la nicotina en ratones macho, con una dosis de inyección de nicotina de 0,2-0,4 mg/kg 7,8. En ese modelo, para satisfacer las necesidades de búsqueda de drogas de los ratones adictos, se administraron dos inyecciones subcutáneas a intervalos de 12 h. Este modelo de adicción a la nicotina en ratones es útil para simular los hábitos humanos de fumar y la exposición a la sílice.
Los modelos animales de un solo factor tienen limitaciones en los estudios de enfermedades, mientras que el método descrito aquí implica un modelo de ratón de dos factores de coexposición a la nicotina y la sílice. Antes de la exposición a la sílice, los ratones fueron preexpuestos a la nicotina para replicar la exposición a la nicotina en personas que fuman. Posteriormente, la exposición a sílice tuvo lugar desde el día 5 hasta el día 19 para imitar la exposición a sílice en un entorno de trabajo para individuos con antecedentes de tabaquismo.
Se sabe que los macrófagos alveolares desempeñan un papel importante en la regulación de la inflamación y la fibrosis pulmonar. Los macrófagos no pueden descomponer la sílice al inhalarla, lo que conduce a la polarización o apoptosis de los macrófagos 9 y a la liberación de citoquinas como el factorde necrosis tumoral alfa (TNF-α) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). Los macrófagos M1, que se identifican por la presencia del marcador de superficie CD86, son los principales instigadores de la respuesta inflamatoria en la silicosis, mientras que los macrófagos M2, que están marcados por CD206, son responsables de la fase fibrótica de la afección10. En ratones de doble exposición, la nicotina indujo la polarización de los macrófagos hacia el fenotipo M2 en los pulmones lesionados por sílice, promoviendo así la fibrosis pulmonar. Además, el TGF-β1 es clave para la inducción de fibrosis y EMT11; el aumento de la expresión de TGF-β1 aceleró la progresión de la fibrosis pulmonar a través de la EMT. Este modelo analizó con éxito los efectos de la nicotina en la silicosis y destacó aún más la importancia de dejar de fumar la nicotina.
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Protocol
Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas emitidas por la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (la 8ª edición del NRC) y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui.
1. Preparación animal
- Aloja 32 ratones machos C57/BL6 de 8 semanas de edad en un laboratorio con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Asegúrese de que los ratones tengan libre acceso a comida y agua.
- Después de 2 semanas de aclimatación al medio ambiente, cuando los ratones de 10 semanas de edad pesan entre 23 y 26 g, utilice números aleatorios generados por una computadora para agrupar aleatoriamente a los animales sin particionar, lo que da como resultado cuatro grupos de ratones: el grupo control (Con), el grupo nicotina (Nic), el grupo sílice (SiO 2) y la nicotina combinada con grupo sílice (Nic+ SiO2).
2. Preparación de nicotina
NOTA: La densidad de la nicotina es de 1,01 g/mL.
- Disuelva la nicotina en etanol anhidro y diluya 20 veces para preparar una solución madre de nicotina de 50 mg/ml.
- Diluir la solución madre de nicotina 1.000 veces con solución salina normal estéril para hacer una solución de trabajo a una concentración de 0,05 mg/ml.
NOTA: Guarde la nicotina lejos de la luz. La solución madre puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana.
3. Preparación de sílice
- Suspenda sílice cristalina estéril en solución salina para preparar una suspensión de sílice de 20 mg/ml y oscile en un baño de agua agitado ultrasónico durante 25 min.
- Agite la suspensión de sílice con un oscilador de vórtice durante 3 minutos antes de que los ratones reciban el goteo nasal. Mezcle la suspensión de sílice pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2x-3x con una pipeta de 200 μL, y luego tome 50 μL para el goteo nasal.
NOTA: La suspensión de dióxido de silicio debe mezclarse y administrarse por goteo nasal lo antes posible.
4. Captura del ratón y exposición a la nicotina
- Pesa a los ratones y registra los pesos diariamente antes de la exposición.
- En los días 1-40, inyecte nicotina por vía subcutánea dos veces al día (con un intervalo de 12 horas) en los ratones de los grupos Nic y Nic+ SiO2 . Utilizar una dosis de nicotina de 0,25 mg/kg; Por ejemplo, asegúrese de que un ratón que pesa 25 g recibe 6,25 μg de nicotina. Para este ratón, el volumen de inyección sería el siguiente: 6,25/0,05 = 125 μL. Simultáneamente, inyecte a los ratones del grupo Con un volumen igual de solución salina.
- Prepare las jeringas de 1 ml requeridas para cada grupo y utilícelas para aspirar el volumen de inyección de nicotina o solución salina. Antes de tomar la nicotina, primero extraiga 0,1-0,2 ml de aire en la jeringa y luego extraiga 125 μl de nicotina. Golpee con cuidado la jeringa para llenar la aguja y el extremo frontal de la jeringa con la nicotina. Coloque la jeringa que contiene nicotina en una bandeja protegida de la luz.
NOTA: En el momento de la inyección, se sitúan 0,1-0,2 ml de aire detrás de la nicotina, lo que garantiza que todo el líquido se administre con éxito al ratón. - Agarre la cola del ratón con la mano derecha y, cuando el animal se relaje, use el pulgar y el índice izquierdos para presionar la piel en la parte posterior del cuello desde la cola hasta la cabeza hasta el borde de la oreja, aplicando una presión moderada. Después de eso, suelte la mano derecha y use el pulgar pequeño y el anular izquierdos para pellizcar la cola y las extremidades traseras, momento en el que el ratón quedará completamente inmovilizado por la mano izquierda.
NOTA: Sujete el ratón con la fuerza adecuada. La fuerza insuficiente facilita la mordedura de los ratones, mientras que la fuerza excesiva puede provocar la asfixia de los ratones. - Usando la mano derecha para inyectar, perfore la piel de la parte posterior del cuello cerca del borde de la oreja de los ratones en dirección de la cabeza a la cola con la jeringa e inyecte nicotina a una velocidad uniforme. Busque una protuberancia semicircular en la piel que indique una inyección exitosa.
NOTA: Cuando la aguja se haya perforado en la piel, habrá una sensación de resistencia; La resistencia desaparece después de que se ha insertado la aguja. En este punto, la aguja debe retirarse ligeramente para inyectar lenta y uniformemente.
5. Exposición a sílice in vivo
- En los días 5-19, instilar la suspensión de dióxido de silicio en la cavidad nasal de los ratones de los grupos SiO 2 y Nic+ SiO2. Anestesiar rápidamente a cada ratón con isoflurano al 2% en una máquina de anestesia a una dosis de 3,6 mL/h. Después de la anestesia, coloque el ratón en la palma de una mano y exponga la cavidad nasal del ratón. Instilar 50 μL de suspensión de sílice en la cavidad nasal en un plazo de 4-8 s.
- Para permitir que la suspensión de sílice ingrese a los pulmones lo antes posible, después de la instilación, presione suavemente el corazón del ratón con el dedo índice durante 3-5 segundos, 3x-5x por segundo, para promover su frecuencia respiratoria.
- Después de que la respiración del ratón se vuelva uniforme gradualmente, colóquelo en una jaula para observar durante 3 minutos.
- Para todos los ratones que reciban la suspensión de sílice, repita los pasos 1 a 3. En el grupo control, instilar 50 μL de solución salina estéril en la cavidad nasal los días 5-19.
6. Adquisición de tejidos pulmonares frescos y fijos
- En el día 41, utilizar 50 mg/kg de pentobarbital sódico para anestesiar a los ratones por vía intraperitoneal a una dosis de 0,1 mL/20 g según su peso corporal. Fije las extremidades en una placa de prueba de espuma y rocíe el pelaje con alcohol al 75%.
- Realizar perfusión cardíaca para obtener tejido pulmonar fresco, cortar la línea media del abdomen para exponer la cavidad torácica y hacer una pequeña abertura en el vértice del corazón derecho. Luego, inyecte 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) preenfriada lenta y uniformemente desde el ápice del corazón izquierdo, haciendo que la sangre fluya hacia afuera por la abertura creada en el ápice del corazón derecho. Extraiga todo el lóbulo pulmonar, colóquelo en un tubo de centrífuga preenfriado de 1,5 ml y transfiéralo a -80 °C para almacenarlo hasta la extracción de proteínas.
- Perfundir a otros ratones con 20 ml de PBS preenfriado seguido de 10 ml de paraformaldehído al 4% en el mismo lugar para fijar los pulmones completos; preservar cada pulmón en 30 mL de PFA al 4%.
- Después de 72 h, incrustar los tejidos pulmonares fijos en parafina.
- Sumerja el tejido pulmonar en el fijador preparado en un baño de agua ultrasónico a 40 °C durante 30 min, seguido de un proceso de deshidratación en etanol al 75%, etanol al 95% y etanol anhidro durante 50 min cada uno.
- Lavar 2 veces con xileno durante 50 minutos cada una.
- Colocar el tejido en cera de parafina derretida a 55-60 °C durante 2-3 h para que el xileno del tejido pulmonar sea reemplazado gradualmente por cera de parafina.
- Fije el tejido pulmonar en el marco de inclusión con parafina y espere a que el bloque de cera se endurezca. Después de que el bloque de cera se haya endurecido, use la máquina seccionadora de parafina para cortar el pulmón a 4-5 μm.
- Coloque las secciones pulmonares en agua ultrapura a 45 °C. Una vez que la parafina se haya derretido, cargue la sección pulmonar en un portaobjetos de microscopio adherente.
7. Tinción de hematoxilina y eosina (HE)
- Hornee los portaobjetos a 60 °C durante 2 h y colóquelos en xileno para desparafinar durante 2 x 30 min. Posteriormente, coloque los portaobjetos en etanol anhidro, etanol al 95%, etanol al 85% y etanol al 75% durante 5 minutos cada uno. Por último, lávalos durante 3 x 5 min con agua ultrapura.
- Dejar caer 50 μL de solución de tinción de hematoxilina sobre el tejido pulmonar con una pistola de pipetas y teñir durante 5 min; Luego, lava las rodajas con agua corriente durante 5 min.
- Añadir 50 μL de ácido clorhídrico al 2% en etanol sobre la sección y enjuagar con agua destilada durante 30 s. A continuación, añadir 50 μL de solución de tinción de eosina sobre el tejido pulmonar para teñir durante 1 min.
- Deshidratar, transparentar y sellar las secciones de parafina.
- Agregue 100-150 ml de etanol al 75%, etanol al 85%, etanol al 95%, etanol anhidro y xileno en un tanque de teñido de plástico combinado. Coloque los portaobjetos en etanol anhidro al 75%, 85%, 95% y durante 5 minutos cada uno para deshidratar.
- Luego, coloque los portaobjetos en xileno durante 5 minutos para que se transparenten.
- Por último, deje caer 20 μL de goma neutra sobre la sección del pulmón y coloque un cubreobjetos sobre el portaobjetos para sellarlo.
NOTA: Los pasos anteriores se llevan a cabo a temperatura ambiente.
8. Tinción de Masson
- Desparafinar, hidratar y lavar las secciones de parafina como se describe en el paso 7.1.
- Tiñir las secciones con 50 μL de solución de tinción de hematoxilina de Weigert configurada durante 7 min, seguido de 50 μL de solución de fraccionamiento de etanol ácido durante 10 s, y lavar con agua corriente para que los núcleos se vuelvan azules.
- Teñir las secciones con 50 μL de solución tricrómica de Masson durante 4 minutos y lavar con agua.
- Enjuague las secciones con agua destilada durante 1 minuto y luego tiña con magenta ácido rojo Lichun durante 7 minutos.
- Lave las secciones con una solución de trabajo de ácido débil (ácido clorhídrico al 30%) durante 1-2 minutos, una solución de ácido fosfomolíbdico durante 1-2 minutos y una solución de trabajo de ácido débil durante 1-2 minutos.
- Tiñe las secciones con una solución de tinción de azul de anilina durante 2 minutos y luego lávalas con una solución de trabajo de ácido débil durante 1 minuto.
- Deshidratar las secciones con etanol al 95% seguido de etanol anhidro durante 1 s, transparentar con xileno durante 1 s y finalmente sellar con resina neutra como se describe en el paso 7.4.
9. Inmunohistoquímica
- Hornea las rodajas a 60 °C durante 6 h. Desparafinar, hidratar y lavar las secciones de parafina como se describe en el paso 7.1.
- Recuperación de antígenos: coloque las rodajas en una caja de plástico resistente al calor que contenga suficiente solución de recuperación de antígenos de citrato para sumergir las rodajas y hierva durante 20-30 min.
- Deje enfriar a temperatura ambiente, retire las secciones y enjuague con agua desionizada. Posteriormente, remojar durante 2 x 5 min en PBS que contenga 0,5% de Tween-20 (PBST).
- Dibuja un bucle cerca de la sección del pulmón en el portaobjetos con un bolígrafo hidrofóbico para formar un círculo hidrofóbico.
- Añadir 50 μL de solución de peróxido de hidrógeno al 3% (3%H2O2) gota a gota a las rodajas, e incubar durante 15 min a temperatura ambiente protegido de la luz para la inactivación de la peroxidasa endógena.
- Remoja las rodajas en PBST durante 3 x 5 min.
- Añadir 50 μL de proteína sérica bovina (BSA)-PBST al 5% gota a gota a loncha, y bloquear durante 1 h a temperatura ambiente.
- Deseche la solución de bloqueo, añada gota a gota 50 μL de los anticuerpos primarios diluidos CD206 (dilución: 1:1.500), TGF-β1 (dilución: 1:200) y vimentina (dilución: 1:2.000) a las rodajas e incube durante la noche a 4 °C.
NOTA: En este trabajo, todos los anticuerpos se diluyeron en BSA al 5%. - Al día siguiente, devuelva las rodajas a temperatura ambiente (40 min). Lave las rodajas como se describe en el paso 9.6.
- Diluir el anticuerpo secundario en BSA al 5%. Añadir 50 μL de anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante (dilución: 1:500) gota a gota, e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Lave las rodajas como se describe en el paso 9.6.
- Dejar caer 50 μL de solución de 3,3'-diaminobencidina (DAB) correspondiente al anticuerpo secundario marcado con enzimas en el tejido pulmonar e incubar durante 5-10 min en una caja húmeda inmunohistoquímica negra. Observe bajo el microscopio hasta que el color se convierta en un marrón fuerte. Enjuague las rodajas con agua destilada para terminar la reacción.
NOTA: La tinción marrón se considera tinción positiva. - Tinte con 50 μL de tinte de hematoxilina durante 30 s y lávate con agua corriente. A continuación, remoje las rodajas en etanol anhidro al 75%, 85%, 95% y durante 3 minutos cada una y luego en xileno durante 2 x 10 minutos. Selle los portaobjetos como se describe en el paso 7.4.
10. Análisis de Western blot
- Saque el tejido pulmonar del congelador y péselo. A continuación, añadir 150 μL de tampón de lisis RIPA que contenga PMSF por cada 20 mg de tejido pulmonar. Lisar los pulmones de ratón en hielo durante 3-5 min con un homogeneizador de mano, agitar suavemente durante 2 h a 4 °C para permitir una lisis adecuada del tejido pulmonar, centrifugar a 4 °C y 14.800 × g durante 15 min, y recoger el sobrenadante.
NOTA: Agregue 100 mM de fenilmetanosulfonilo (PMSF) unos minutos antes de usar el tampón de lisis RIPA. La concentración final de PMSF es de 1 mM (por ejemplo, 10 μL de PMSF + 990 μL de RIPA). - Utilice un kit de concentración de proteína BCA para determinar la concentración de proteína de la muestra siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la determinación, utilizando la concentración más pequeña de lisado de proteína como base, diluir el mismo lote de lisado de proteína con RIPA a la concentración más pequeña para lograr la misma masa y volumen.
NOTA: La cantidad total de carga de tejido pulmonar es de 30 μg. - Añadir 40 μL de tampón de carga 5x a 160 μL de lisado de proteína, y calentar a 100 °C durante 10 min.
- Ensamble el gel de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 10% preparado (SDS-PAGE) en el sistema de electroforesis Western blot, agregue el tampón de electroforesis SDS-PAGE, saque suavemente el peine de electroforesis y agregue 20 μL de muestra de proteína por pocillo lenta y uniformemente. Encienda la alimentación e inicie la electroforesis a 80 V durante 30 min. Una vez que las proteínas hayan alcanzado la capa inferior de gel, cambie a 100 V y continúe la electroforesis durante 60-70 minutos.
NOTA: La electroforesis necesita un tampón de electroforesis nuevo. - Transfiera las proteínas a una membrana de PVDF mediante transferencia húmeda. Activar la membrana de PVDF con metanol previamente (5-30 s). Saque la placa de gel de electroforesis, ábrala con cuidado, coloque el gel separador en el tampón de transferencia húmeda, haga el sándwich de transferencia eléctrica y ensamble el sistema de transferencia húmeda. Llene el tanque de electroforesis con tampón de transferencia y transfiéralo a 400 mA durante 90 min.
NOTA: El tampón de transferencia se enfría con anticipación para evitar los efectos de las altas temperaturas durante la transferencia húmeda. - Lave la membrana de PVDF con solución salina tamponada con Tris con 0,5% de Tween-20 (TBST) durante 3 x 5 min. Bloquear la membrana de PVDF con leche desnatada al 5% diluida en TBST e incubar en un agitador a temperatura ambiente durante 60 min; luego, lavar con TBST durante 2 min. Después del lavado, incubar la membrana durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario vimentina (1:5.000) y GAPDH (1:10.000) diluido en BSA al 5%.
- Coloque la membrana a temperatura ambiente durante 30 minutos y lave con TBST durante 5 x 5 minutos. Después del lavado, incubar la membrana con el anticuerpo secundario (1:10.000) diluido en leche desnatada al 5% durante 60 min a temperatura ambiente.
- Coloque la membrana, con la proteína hacia arriba, deje caer la solución de trabajo ECL preparada, incube durante 1-2 minutos y observe los resultados con un generador de imágenes en gel. Utilice los valores de escala de grises medidos por el software en el generador de imágenes en gel para evaluar los niveles de expresión de proteínas.
NOTA: Aquí, GAPDH sirvió como referencia interna.
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Representative Results
Se estableció un modelo de ratón para estudiar la nicotina combinada con la exposición a la sílice para investigar el papel potencial de la nicotina en la progresión de la silicosis en ratones. La Figura 1 muestra el procedimiento experimental para utilizar un modelo de ratón de doble exposición, que combinó una inyección de nicotina con la instilación nasal de una suspensión de sílice. Los cambios patológicos de los ratones de cada grupo se observaron mediante tinción HE. Los ratones expuestos a la nicotina combinada con sílice tuvieron un daño pulmonar significativamente más grave que los expuestos a la nicotina o la sílice sola. Los linfocitos aumentaron cerca de los vasos linfáticos en los pulmones de los ratones expuestos a la nicotina, formando grupos de células inflamatorias. La tinción de Masson reveló un aumento significativo en la deposición de fibras de colágeno en los pulmones expuestos a la nicotina combinada con sílice en comparación con los pulmones de los otros grupos, y esto fue respaldado por la cuantificación de la tinción de Masson (Figura 2). La estructura alveolar fue destruida en los ratones expuestos a sílice y el número de macrófagos aumentó. Sin embargo, después de la exposición a la nicotina combinada con sílice, hubo una infiltración celular inflamatoria significativa y aparecieron nódulos de fibroblastos. Además, los macrófagos acumulados, especialmente los macrófagos M2, están presentes en el grupo de doble exposición. Los macrófagos M2 son esenciales para la etapa fibrótica avanzada de la silicosis.
Además, se observó un aumento significativo en el factor profibrótico TGF-β1 mediante tinción inmunohistoquímica (IHQ) en los pulmones de ratones de doble exposición, especialmente en células inflamatorias cercanas a los vasos linfáticos (Figura 3). El TGF-β1 secretado por los macrófagos promueve la EMT de las células epiteliales y la fibrosis pulmonar12. En comparación con los ratones expuestos solo a la sílice, los niveles de vimentina se elevaron significativamente en los pulmones de los ratones de doble exposición. Tanto la tinción IHQ como la cuantificación de proteínas indicaron EMT grave en ratones de doble exposición (Figura 4). La evidencia combinada sugiere que la exposición crónica a la sílice promueve la EMT después de la regulación positiva de TGF-β1, lo que conduce a un aumento de los fibroblastos y fibrosis progresiva. Al mismo tiempo, la adición de nicotina acelera el proceso de fibrosis pulmonar al agravar la EMT, lo que permite que la fibrosis pulmonar aparezca antes. Este modelo está diseñado para explorar el impacto de la nicotina en la fibrosis pulmonar, que es una consecuencia de la exposición crónica a la sílice en humanos.
Figura 1: Diseño de un modelo experimental de exposición combinada a nicotina y sílice en ratones. Inyección continua de nicotina durante 1-40 días e instilación nasal continua de sílice durante 5-19 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La nicotina promueve la formación de masas fibroblásticas en los pulmones de ratones expuestos a sílice. (A) La tinción HE se utilizó para visualizar cambios patológicos en los pulmones. Los ratones de doble exposición tenían una infiltración celular inflamatoria severa y fibrosis. Las flechas verdes indican masas celulares inflamatorias. Barra de escala = 50 μm. (B) Se utilizó tinción de Masson para mostrar fibras de colágeno en los pulmones. Barra de escala = 50 μm. (C) Cuantificación de fibras de colágeno en los pulmones. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aumento de las células positivas para CD206 y TGF-β1 en los pulmones de ratones de doble exposición a la nicotina y la sílice. (A) Se utilizó la tinción IHQ de CD206 para observar la distribución y expresión de macrófagos en los ratones de doble exposición. Los macrófagos CD206 positivos aumentaron en los pulmones de los ratones después de la exposición combinada a la nicotina y la sílice. Las flechas cortas representan células CD206 positivas. Barra de escala = 50 μm. (B) El TGF-β1, un promotor de la fibrosis, se elevó en ratones de doble exposición. Las flechas largas representan células positivas para TGF-β1. Barra de escala = 50 μm. (C,D) AOD de CD206 y TGF-β1. AOD = IOD (densidad óptica integrada)/área. La AOD refleja la concentración de CD206 y TGF-β1 por unidad de área. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abreviaturas: TGF-β1 = factor de crecimiento transformante-beta; IHQ = inmunohistoquímica; AOD = densidad óptica media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Promoción de la fibrosis pulmonar por nicotina en ratones expuestos a sílice a través del agravamiento de la EMT. (A) La expresión de vimentina en cada grupo se observó mediante tinción IHQ. La vimentina se expresó fuertemente en los pulmones de los ratones expuestos a la nicotina y la sílice. Barra de escala = 50 μm.(B) Western blot de expresión de vimentina en cada grupo de exposición, con un aumento de vimentina en los tejidos pulmonares de ratones doblemente expuestos. (C) El valor de AOD de la vimentina fue significativamente más elevado en el grupo de doble exposición en comparación con los otros grupos. (D) El nivel relativo de expresión proteica de la vimentina en comparación con el GAPDH. La expresión de vimentina en el grupo de doble exposición fue significativamente mayor que en los grupos de exposición a la nicotina o a la sílice. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abreviaturas: EMT = transición epitelio-mesenquimatosa; AOD = densidad óptica media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es necesario un modelo animal de doble exposición para investigar el papel y los posibles mecanismos de la exposición simultánea a la nicotina y al dióxido de silicio cristalino. Este modelo se logró en este trabajo a través de la inyección subcutánea de nicotina y el goteo nasal de sílice. Para garantizar el éxito de la inyección de nicotina, el operador debe familiarizarse con el agarre de los ratones, ya que agarrar la piel de la parte posterior del cuello podría ser doloroso para ellos. Por lo tanto, es importante permitir que los ratones se adapten gradualmente al agarre. Además, un paso crítico en la exposición a la sílice en ratones es el goteo nasal. Para aumentar el éxito del procedimiento y la tasa de supervivencia de los ratones, es esencial practicar previamente el goteo nasal.
Al realizar la inyección, la jeringa debe deslizarse sobre la cabeza del ratón para evitar un fuerte forcejeo cuando el ratón vea la jeringa. La cola del ratón debe agarrarse firmemente con la mano derecha, mientras que la mano izquierda debe usarse para empujar la piel hasta el borde de la oreja en la parte posterior del cuello con cuidado y suavidad y para pellizcar la piel allí. Después de soltar la cola del ratón con la mano derecha, la cola y las extremidades traseras deben estabilizarse con el pulgar y el anular izquierdos para evitar morder. Con una jeringa de 1 ml en la mano derecha, la aguja debe insertarse en la piel suelta por encima del cuello en un ángulo de 30° en dirección de la cabeza a la cola. La aguja debe retirarse ligeramente después de que se pierda la resistencia, y la inyección debe administrarse lenta y uniformemente. En los días 5-19, los ratones del grupo de doble exposición fueron expuestos a nicotina y sílice. Se recomienda que la nicotina se inyecte a las 08:00 a.m., seguida del goteo nasal de dióxido de silicio a las 14:00 p.m., y otra inyección de nicotina a las 20:00 p.m. Las dos inyecciones de nicotina deben administrarse con 12 horas de diferencia para evitar los efectos del agarre repetido en los ratones.
La realización de inyecciones subcutáneas y goteo nasal presenta varios desafíos técnicos. En el caso de las inyecciones subcutáneas, los ratones deben agarrarse con la fuerza adecuada. Si la piel de la parte posterior del cuello se pellizca con demasiada fuerza, las vías respiratorias del ratón se bloquearán, lo que provocará rápidamente la asfixia. Para una resistencia óptima, se debe pellizcar la piel de la parte posterior del cuello hasta que los globos oculares sobresalgan ligeramente. En este momento, el ratón siente el menor dolor y respira suavemente. Además, se debe utilizar una jeringa de 1 ml que se vacía de aire para extraer la inyección de nicotina del tubo, seguida de otros 0,1-0,2 ml de aire. Antes de inyectar, las burbujas deben expulsarse suavemente. Debido al pequeño volumen de la inyección, la nicotina que queda en la punta del extremo de la aguja puede conducir a una dosis insuficiente. Las partes clave de la inyección son insertar la aguja rápidamente, inyectar la nicotina lentamente y retirar la aguja suavemente. Para el goteo nasal, en este estudio, la cavidad nasal de los ratones se expuso completamente bajo anestesia profunda, seguida de la instilación lenta y uniforme de una suspensión de dióxido de silicio. También es importante presionar suavemente la cavidad torácica después de la exposición a la sílice para evitar la tos o la asfixia.
Este modelo tiene ciertas limitaciones. Las partículas de sílice de 1-5 μm utilizadas en los experimentos no se recogieron del medio ambiente y eran partículas de sílice pura. Por el contrario, en entornos ocupacionales reales, los trabajadores pueden estar expuestos a una variedad de materiales peligrosos, no solo partículas de sílice, como una mezcla de carbón y polvo de sílice en una fábrica de cerámica o una mina de carbón. Utilizamos silicio de instilación nasal para lograr dosis bajas y exposiciones múltiples repetidas para simular la exposición crónica de los trabajadores. En el modelo de ratón de doble exposición, aunque la nicotina no proviene de la exposición al humo del cigarrillo, la nicotina inyectada entra directamente en el torrente sanguíneo, lo que permite una exploración más centrada del papel de la nicotina en el proceso de silicosis y evitar los efectos de otros componentes del humo del cigarrillo.
La investigación científica sobre la silicosis ha utilizado típicamente modelos de ratón de un solo factor, ya sea a través de la inhalación o la perfusión bronquial de sílice, para evaluar el papel de la sílice en el desarrollo de la enfermedad. Un enfoque alternativo es la instilación nasal de dióxido de silicio, que es simple y fácil y permite el establecimiento de modelos de exposición repetida y crónica a la sílice13. El modelo de goteo nasal de dióxido de silicio bien establecido causa un daño mínimo a los ratones y podría combinarse con otros factores para crear un modelo animal de exposición multifactorial. Además, los principales métodos de exposición a la nicotina en ratones incluyen la nicotina en el agua potable, la inyección subcutánea de nicotina, la infusión de nicotina a través de minibombas osmóticas y la exposición al humo de tabaco14. La inyección subcutánea utilizada en el modelo de doble exposición permite ajustar con precisión la dosis y el momento de la nicotina, lo que garantiza que a cada ratón se le administre la misma dosis.
En resumen, el modelo animal de la nicotina en combinación con la exposición a la sílice replica un patrón de exposición crónica realista, y este modelo se puede utilizar para futuras investigaciones sobre los impactos de la nicotina en la inflamación y la fibrosis en el desarrollo de la silicosis. Además, este modelo sirve como base para formar un modelo animal de doble exposición con múltiples dosis y marcos temporales.
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Disclosures
Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio contó con el apoyo del Programa de Innovación de Sinergia Universitaria de la Provincia de Anhui (GXXT-2021-077) y el Fondo de Innovación de Posgrado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Anhui (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
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