Summary
מחקר זה מתאר מודל עכברי לחקר ההשפעה הסינרגטית של ניקוטין על התקדמות פיברוזיס ריאתי בעכברי סיליקוזיס ניסיוניים. מודל העכבר בעל החשיפה הכפולה מדמה את ההתקדמות הפתולוגית בריאה לאחר חשיפה בו זמנית לניקוטין ולסיליקה. השיטות המתוארות הן פשוטות וניתנות לשחזור רב.
Abstract
עישון וחשיפה לסיליקה נפוצים בקרב עובדים תעסוקתיים, וסיליקה נוטה יותר לפגוע בריאות של מעשנים מאשר לא מעשנים. תפקידו של הניקוטין, המרכיב הממכר העיקרי בסיגריות, בהתפתחות סיליקוזיס אינו ברור. מודל העכבר ששימש במחקר זה היה פשוט וקל לשליטה, והוא דימה ביעילות את ההשפעות של בליעת ניקוטין כרונית וחשיפה חוזרת לסיליקה על פיברוזיס ריאות באמצעות מעבר אפיתל-מזנכימלי בבני אדם. בנוסף, מודל זה יכול לסייע במחקר ישיר של ההשפעות של ניקוטין על סיליקוזיס תוך הימנעות ההשפעות של רכיבים אחרים עשן סיגריות.
לאחר הסתגלות סביבתית, הוזרקו לעכברים תמיסת ניקוטין במינון 0.25 מ"ג/ק"ג לעור הרפוי שמעל הצוואר בכל בוקר וערב במרווחים של 12 שעות במשך 40 יום. בנוסף, אבקת סיליקה גבישית (1-5 מיקרומטר) הייתה תלויה במי מלח רגילים, דוללה לתרחיף של 20 מ"ג/מ"ל, ופוזרה באופן שווה באמצעות אמבט מים על-קולי. העכברים המורדמים באיזופלורן שאפו 50 מיקרוליטר של תרחיף אבק סיליקה זה דרך האף והתעוררו באמצעות עיסוי חזה. החשיפה לסיליקה ניתנה מדי יום בימים 5-19.
מודל העכבר בעל החשיפה הכפולה נחשף לניקוטין ולאחר מכן לסיליקה, מה שתואם את היסטוריית החשיפה של עובדים שנחשפו לשני הגורמים המזיקים. בנוסף, ניקוטין קידם פיברוזיס ריאתי באמצעות טרנספורמציה אפיתל-מזנכימלית (EMT) בעכברים. מודל בעלי חיים זה יכול לשמש לחקר ההשפעות של גורמים מרובים על התפתחות סיליקוזיס.
Introduction
חשיפה לסיליקה אצל עובדים היא בלתי נמנעת בחלק מהמסגרות התעסוקתיות, וברגע שנחשפו לסיליקה, ההידרדרות מתקדמת גם לאחר הרחקה מהסביבה. בנוסף, רוב העובדים הללו מעשנים, והסיגריות המסורתיות מכילות אלפי כימיקלים, כאשר המרכיב הממכר העיקרי הוא ניקוטין1. סיגריות אלקטרוניות הופכות פופולריות יותר ויותר בקבוצות גיל צעירותיותר 2; סיגריות אלקטרוניות אלה פועלות כמערכת אספקת ניקוטין ומגבירות את הגישה לניקוטין, ובכך מגבירות את רגישות הריאות ודלקת ריאות3. עשן סיגריות גם מאיץ פיברוזיס ריאתי בעכברים שנחשפו לבלומיצין4 ומגביר רעילות ריאתית ופיברוזיס בעכברים שנחשפו לסיליקה 5,6. עם זאת, האם ניקוטין יכול להשפיע על תהליך פיברוזיס דלקתי וריאתי הנגרם על ידי סיליקה עדיין צריך להיחקר.
מודל עכבר הסיליקוזיס שנקבע על ידי שאיפה חד פעמית של מינון גבוה של סיליקה לתוך קנה הנשימה הוא טראומטי לעכברים. למרות ששיטה זו מספקת במהירות מודל סיליקוזיס, היא אינה תואמת את המציאות של סביבה שבה עובדים נחשפים שוב ושוב לסיליקה. לכן, ביססנו מודל עכבר חשוף לסיליקה על ידי מתן מינון נמוך שוב ושוב של מתלי סיליקה באמצעות טפטוף אף; מינון זה עלול לגרום לדלקת ופיברוזיס בעכברים.
כדי לעקוף את ההשפעות של רכיבי סיגריות אחרים, מודל עכבר זה הוזרק תת עורית עם ניקוטין לתוך העור הרפוי של הצוואר כדי לקבוע את ההשפעה של הרכיב הממכר, ניקוטין, על סיליקוזיס. על ידי מתן זריקות תת עוריות, ניתן להשיג מינון מדויק, ובכך לאפשר ליצור מודלים של חשיפה לניקוטין ולצפות בתגובות רעילות למינון, כמו גם התמכרות. מודל התמכרות לניקוטין פותח בעכברים זכרים, עם מינון הזרקת ניקוטין של 0.2-0.4 מ"ג / ק"ג 7,8. במודל זה, כדי לענות על הצרכים המחפשים סמים של העכברים המכורים, ניתנו שתי זריקות תת עוריות במרווחים של 12 שעות. מודל התמכרות לניקוטין בעכבר שימושי להדמיית הרגלי עישון אנושיים וחשיפה לסיליקה.
למודלים חד-גורמיים של בעלי חיים יש מגבלות במחקרי מחלות, בעוד שהשיטה המתוארת כאן כוללת מודל עכברי דו-שלבי של חשיפה משותפת לניקוטין ולסיליקה. לפני החשיפה לסיליקה, העכברים נחשפו מראש לניקוטין כדי לשכפל את החשיפה לניקוטין אצל אנשים מעשנים. לאחר מכן, החשיפה לסיליקה התרחשה מהיום החמישי עד היום ה-19 כדי לחקות חשיפה לסיליקה בסביבת עבודה עבור אנשים עם היסטוריה של עישון.
ידוע כי מקרופאגים בנאדיות ממלאים תפקיד משמעותי בוויסות דלקת ריאות ופיברוזיס. מקרופאגים אינם יכולים לפרק סיליקה בשאיפת סיליקה, מה שמוביל לקיטוב מקרופאגים או אפופטוזיס9 ולשחרור ציטוקינים כגון גורם נמק גידולי-אלפא (TNF-α) ושינוי גורם גדילה בטא (TGF-β). מקרופאגים M1, המזוהים על ידי נוכחות סמן פני השטח CD86, הם הגורמים העיקריים לתגובה הדלקתית בסיליקוזיס, ואילו מקרופאגים M2, המסומנים על ידי CD206, אחראים לשלב הפיברוטי של המצב10. בעכברים בעלי חשיפה כפולה, ניקוטין גרם לקיטוב של מקרופאגים כלפי פנוטיפ M2 בריאות פגועות סיליקה, ובכך קידם פיברוזיס ריאתי. יתר על כן, TGF-β1 הוא המפתח להשראת פיברוזיס ו- EMT11; הביטוי המוגבר של TGF-β1 האיץ את התקדמות פיברוזיס הריאות באמצעות EMT. מודל זה ניתח בהצלחה את ההשפעות של ניקוטין על סיליקוזיס והדגיש עוד יותר את החשיבות של הפסקת ניקוטין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים נערכו על פי ההנחיות שפורסמו על ידי המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (המהדורה השמינית של NRC) ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטת אנחווי למדע וטכנולוגיה.
1. הכנת בעלי חיים
- בית 32 עכברי C57/BL6 זכרים בני 8 שבועות במעבדה עם מחזור אור/חושך של 12 שעות. ודאו שלעכברים יש גישה חופשית למזון ולמים.
- לאחר שבועיים של הסתגלות לסביבה, כאשר עכברים בני 10 שבועות שוקלים 23-26 גרם, משתמשים במספרים אקראיים שנוצרו על ידי מחשב כדי לקבץ באופן אקראי את החיות ללא חלוקה, וכתוצאה מכך נוצרות ארבע קבוצות עכברים: קבוצת הביקורת (Con), קבוצת הניקוטין (Nic), קבוצת הסיליקה (SiO 2) וקבוצת הניקוטין בשילוב עם קבוצת סיליקה (Nic+ SiO2).
2. הכנת ניקוטין
הערה: צפיפות הניקוטין היא 1.01 גרם/מ"ל.
- ממיסים את הניקוטין באתנול נטול מים, ומדללים פי 20 להכנת תמיסת מלאי ניקוטין של 50 מ"ג/מ"ל.
- דללו את תמיסת מלאי הניקוטין פי 1,000 במי מלח רגילים סטריליים ליצירת תמיסת עבודה בריכוז של 0.05 מ"ג/מ"ל.
הערה: יש לאחסן ניקוטין הרחק מאור. ניתן לאחסן את תמיסת המלאי ב -4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
3. הכנת סיליקה
- השהה סיליקה גבישית סטרילית במי מלח להכנת תרחיף סיליקה 20 מ"ג / מ"ל, ותנדנד אותו באמבט מים רועד קולי במשך 25 דקות.
- נערו את מתלה הסיליקה עם מתנד מערבולת במשך 3 דקות לפני שהעכברים מקבלים את טפטוף האף. ערבבו את תרחיף הסיליקה על ידי פיפטציה מעלה ומטה 2x-3x עם פיפטה של 200 μL, ולאחר מכן קחו 50 μL לטפטוף האף.
הערה: יש לערבב את תרחיף הסיליקון דו-חמצני ולתת אותו באמצעות טפטוף מהאף בהקדם האפשרי.
4. לכידת עכבר וחשיפה לניקוטין
- שקלו את העכברים, ורשמו את המשקולות מדי יום לפני החשיפה.
- בימים 1-40, יש להזריק ניקוטין תת-עורית פעמיים ביום (בהפרש של 12 שעות) לעכברים בקבוצות Nic ו-Nic+ SiO2 . השתמש במינון ניקוטין של 0.25 מ"ג / ק"ג; לדוגמה, ודא שעכבר השוקל 25 גרם מקבל 6.25 מיקרוגרם ניקוטין. עבור עכבר זה, נפח ההזרקה יהיה כדלקמן: 6.25/0.05 = 125 μL. במקביל, להזריק את העכברים בקבוצת קון עם נפח שווה של מלוחים.
- הכינו את מזרקי 1 מ"ל הנדרשים לכל קבוצה, והשתמשו בהם כדי לשאוף את נפח ההזרקה של ניקוטין או מי מלח. לפני נטילת הניקוטין, תחילה למשוך 0.1-0.2 מ"ל של אוויר לתוך מזרק, ולאחר מכן לצייר 125 μL של ניקוטין. הקש בזהירות על המזרק כדי למלא את המחט ואת הקצה הקדמי של המזרק עם ניקוטין. הניחו את המזרק המכיל ניקוטין במגש מוגן מפני אור.
הערה: בזמן ההזרקה, 0.1-0.2 מ"ל אוויר ממוקם מאחורי הניקוטין, מה שמבטיח שכל הנוזל מנוהל בהצלחה לעכבר. - אחוז את זנב העכבר ביד ימין, וכאשר החיה נרגעת, השתמש באגודל שמאל ובאצבע כדי ללחוץ על העור על העורף מהזנב לראש עד קצה האוזן, תוך הפעלת לחץ מתון. לאחר מכן, שחרר את יד ימין, והשתמש באגודל הקטן השמאלי ובאצבע הטבעת כדי לצבוט את הזנב ואת הגפיים האחוריות, ובשלב זה העכבר יהיה משותק לחלוטין על ידי יד שמאל.
הערה: אחוז בעכבר בכוח המתאים. כוח לא מספיק מקל על עכברים לנשוך, בעוד שכוח מופרז עלול לגרום לחנק של העכברים. - בעזרת יד ימין להזרקה, לנקב את העור בעורף ליד קצה האוזן של העכברים בכיוון ראש אל זנב עם המזרק, ולהזריק ניקוטין בקצב אחיד. חפשו בליטת עור חצי עגולה המעידה על הזרקה מוצלחת.
הערה: כאשר המחט ניקבה לתוך העור, תהיה תחושה של התנגדות; ההתנגדות נעלמת לאחר החדרת המחט. בשלב זה, המחט צריכה להיות משוכה מעט כדי להזריק לאט ובאופן שווה.
5. חשיפה לסיליקה in vivo
- בימים 5-19, יש להחדיר את תרחיף הסיליקון דו-חמצני לחלל האף של העכברים בקבוצות SiO 2 ו-Nic+ SiO2. הרדימו במהירות כל עכבר עם איזופלורן 2% במכונת הרדמה במינון של 3.6 מ"ל/שעה. לאחר ההרדמה, מניחים את העכבר על כף יד אחת, וחושפים את חלל האף של העכבר. להחדיר 50 μL של תרחיף סיליקה לתוך חלל האף בתוך 4-8 שניות.
- כדי לאפשר לתרחיף הסיליקה להיכנס לריאות בהקדם האפשרי, לאחר ההחדרה, לחץ על לב העכבר בעדינות עם האצבע המורה במשך 3-5 שניות, 3x-5x לשנייה, כדי לקדם את קצב הנשימה שלו.
- לאחר הנשימה של העכבר בהדרגה הופך אחיד, מניחים את העכבר בכלוב להתבונן במשך 3 דקות.
- עבור כל העכברים המקבלים את תרחיף הסיליקה, חזור על שלבים 1-3. בקבוצת הביקורת, להחדיר 50 μL של מלוחים סטריליים לתוך חלל האף בימים 5-19.
6. רכישת רקמות ריאה טריות וקבועות
- ביום ה-41, יש להשתמש ב-50 מ"ג/ק"ג נתרן פנטוברביטל כדי להרדים את העכברים באופן תוך-צפקי במינון של 0.1 מ"ל/20 גרם בהתאם למשקל גופם. תקנו את הגפיים על צלחת בדיקת קצף, ורססו את הפרווה באלכוהול 75%.
- בצע זילוח לב כדי להשיג רקמת ריאה טרייה, לחתוך את קו האמצע של הבטן כדי לחשוף את חלל החזה, ולעשות פתח קטן בקודקוד הלב הימני. לאחר מכן, הזריקו 20 מ"ל של מלח חוצץ פוספט מקורר מראש (PBS) לאט ובאופן שווה מקודקוד הלב השמאלי, מה שגורם לדם לזרום החוצה מהפתח שנוצר בקודקוד הלב הימני. הוציאו את כל אונת הריאה, הכניסו אותה לצינור צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מ"ל, והעבירו לטמפרטורה של 80°C לאחסון עד למיצוי חלבונים.
- לערבב עכברים אחרים עם 20 מ"ל של PBS מקורר מראש ואחריו 10 מ"ל של 4% paraformaldehyde באותו מיקום כדי לתקן ריאות שלמות; לשמר כל ריאה ב 30 מ"ל של 4% PFA.
- לאחר 72 שעות, להטביע את רקמות הריאה הקבועות בפרפין.
- לטבול את רקמת הריאה בקיבוע מוכן באמבט מים קולי ב 40 ° C במשך 30 דקות, ואחריו תהליך התייבשות 75% אתנול, 95% אתנול, אתנול נטול מים, במשך 50 דקות כל אחד.
- יש לשטוף פעמיים עם קסילן במשך 50 דקות כל אחד.
- מניחים את הרקמה בשעוות פרפין מומסת ב 55-60 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות, כך שהקסילן ברקמת הריאה מוחלף בהדרגה בשעוות פרפין.
- מקבעים את רקמת הריאה במסגרת ההטבעה עם פרפין, ומחכים שגוש השעווה יתקשה. לאחר שגוש השעווה התקשה, השתמשו במכונת חיתוך הפרפין כדי לחתוך את הריאה ב-4-5 מיקרומטר.
- מניחים את קטעי הריאה במים טהורים במיוחד ב 45 °C. לאחר שהפרפין נמס, העמיסו את קטע הריאה על מגלשת מיקרוסקופ דבק.
7. צביעת Hematoxylin ו- eosin (HE)
- אופים את המגלשות בטמפרטורה של 60°C למשך שעתיים, ומניחים את המגלשות בקסילן להסרת שעווה למשך 2X30 דקות. לאחר מכן, הניחו את המגלשות באתנול נטול מים, 95% אתנול, 85% אתנול ו-75% אתנול למשך 5 דקות כל אחת. לבסוף, לשטוף אותם במשך 3 x 5 דקות עם מים טהורים במיוחד.
- זרוק 50 μL של תמיסת צביעת hematoxylin על רקמת הריאה עם אקדח פיפטה, וכתם במשך 5 דקות; לאחר מכן, לשטוף את פרוסות עם מים זורמים במשך 5 דקות.
- מוסיפים 50 μL של 2% חומצה הידרוכלורית באתנול על הקטע, ושוטפים במים מזוקקים במשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסף 50 μL של תמיסת צביעת eosin על רקמת הריאה כדי להכתים למשך דקה אחת.
- יש לייבש, לשקוף ולאטום את חלקי הפרפין.
- הוסיפו 100-150 מ"ל של 75% אתנול, 85% אתנול, 95% אתנול, אתנול נטול מים וקסילן במיכל צביעה משולב מפלסטיק. הניחו את המגלשות ב-75%, 85%, 95% ואתנול נטול מים למשך 5 דקות כל אחת כדי להתייבש.
- לאחר מכן, הניחו את המגלשות בקסילן למשך 5 דקות לשקיפות.
- לבסוף, יש לטפטף 20 μL של חניכיים נייטרליות על אזור הריאה, ולהניח כיסוי מעל המגלשה כדי לאטום אותה.
הערה: השלבים לעיל מתבצעים בטמפרטורת החדר.
8. צביעת מסון
- Dewax, לחות ולשטוף את קטעי פרפין כמתואר בשלב 7.1.
- צבעו את החלקים עם 50 μL של תמיסת צביעת המטוקסילין של Weigert למשך 7 דקות, ולאחר מכן 50 μL של תמיסת שבר אתנול חומצי למשך 10 שניות, ושטפו במים זורמים כדי להפוך את הגרעינים לכחולים.
- צובעים את החלקים עם 50 μL של תמיסת טריכרום Masson למשך 4 דקות, ושוטפים במים.
- שטפו את החלקים במים מזוקקים במשך דקה אחת, ולאחר מכן כתם במגנטה חומצה אדומה של ליצ'ון למשך 7 דקות.
- שטפו את החלקים בתמיסת עבודה עם חומצה חלשה (30% חומצה הידרוכלורית) למשך 1-2 דקות, תמיסת חומצה פוספוהומוליבדית למשך 1-2 דקות, ותמיסת עבודה עם חומצה חלשה למשך 1-2 דקות.
- מכתימים את החלקים בתמיסת צביעה כחולה אנילין למשך 2 דקות, ולאחר מכן שוטפים בתמיסת עבודה עם חומצה חלשה למשך דקה.
- יש לייבש את החלקים עם 95% אתנול ואחריו אתנול נטול מים למשך 1 שניות, לשקוף עם קסילן למשך שנייה אחת, ולבסוף לאטום עם שרף נייטרלי כמתואר בשלב 7.4.
9. אימונוהיסטוכימיה
- אופים את הפרוסות בחום של 18 מעלות במשך 6 שעות. Dewax, לחות ולשטוף את קטעי פרפין כמתואר בשלב 7.1.
- שליפת אנטיגן: מניחים את הפרוסות בקופסת חיתוך פלסטיק עמידה בחום המכילה מספיק תמיסת אחזור אנטיגן ציטראט כדי לטבול את הפרוסות, ומרתיחים במשך 20-30 דקות.
- מצננים לטמפרטורת החדר, מסירים את החלקים ושוטפים במים נטולי יונים. לאחר מכן, יש להשרות במשך 2X5 דקות ב-PBS המכיל 0.5% Tween-20 (PBST).
- צייר לולאה ליד קטע הריאה על המגלשה עם עט הידרופובי כדי ליצור מעגל הידרופובי.
- מוסיפים 50 μL של תמיסת מי חמצן 3% (3% H 2 O2)טיפות לפרוסות, ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור לנטרול של peroxidase אנדוגני.
- משרים את הפרוסות ב-PBST למשך 3X5 דקות.
- הוסיפו 50 μL של חלבון 5% בסרום בקר (BSA)-PBST טיפה לפרוסות, וחסמו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- יש להשליך את תמיסת החסימה, להוסיף 50 μL של הנוגדנים הראשוניים המדוללים CD206 (דילול: 1:1,500), TGF-β1 (דילול: 1:200) ווימנטין (דילול: 1:2,000) טיפות לפרוסות, ולדגור לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: בעבודה זו, כל הנוגדנים היו מדוללים ב 5% BSA. - למחרת, מחזירים את הפרוסות לטמפרטורת החדר (40 דקות). שטפו את הפרוסות כמתואר בשלב 9.6.
- לדלל את הנוגדן המשני ב 5% BSA. הוסיפו 50 מיקרוליטר של נוגדן משני עם תווית חזרת פרוקסידז (דילול: 1:500) טיפתית, ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את הפרוסות כמתואר בשלב 9.6.
- יש לזרוק 50 μL של תמיסת 3,3'-diaminobenzidine (DAB) המתאימה לנוגדן המשני המסומן באנזים על רקמת הריאה, ולדגור במשך 5-10 דקות בקופסה רטובה אימונוהיסטוכימית שחורה. התבוננו מתחת למיקרוסקופ עד שהצבע מתפתח לחום חזק. שטפו את הפרוסות במים מזוקקים כדי לסיים את התגובה.
הערה: כתמים חומים נחשבים לכתם חיובי. - מכתים עם 50 μL של כתם hematoxylin במשך 30 s, ולשטוף עם מים זורמים. לאחר מכן, משרים את הפרוסות ב 75%, 85%, 95%, ואתנול נטול מים במשך 3 דקות כל אחד ולאחר מכן בקסילן במשך 2 x 10 דקות. אטום את השקופיות כמתואר בשלב 7.4.
10. ניתוח כתמים מערביים
- הוציאו את רקמת הריאה מהמקפיא, ושקלו אותה. לאחר מכן, להוסיף 150 μL של RIPA lysis buffer המכיל PMSF לכל 20 מ"ג של רקמת ריאה. הניחו את ריאות העכבר על קרח במשך 3-5 דקות באמצעות הומוגנייזר ידני, נערו בעדינות במשך שעתיים בטמפרטורה של 4°C כדי לאפשר ליזה מספקת של רקמת הריאה, הצנטריפוגה בטמפרטורה של 4°C ו-14,800 × גרם במשך 15 דקות, ואספו את הסופרנטנט.
הערה: הוסף 100 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) כמה דקות לפני השימוש במאגר RIPA lysis. הריכוז הסופי של PMSF הוא 1 mM (למשל, 10 μL של PMSF + 990 μL של RIPA). - השתמש בערכת ריכוז חלבון BCA כדי לקבוע את ריכוז החלבון של הדגימה על-ידי ביצוע הוראות היצרן. לאחר הקביעה, תוך שימוש בריכוז הקטן ביותר של חלבון ליזט כבסיס, יש לדלל את אותה אצווה של חלבון ליזט עם RIPA לריכוז הקטן ביותר כדי להשיג את אותה מסה ונפח.
הערה: הכמות הכוללת של העמסת רקמת הריאה היא 30 מיקרוגרם. - הוסף 40 μL של מאגר העמסה 5x ל 160 μL של חלבון ליזט, וחמם אותו ב 100 ° C במשך 10 דקות.
- הרכיבו את הג'ל המוכן 10% נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) במערכת האלקטרופורזה המערבית, הוסיפו את מאגר האלקטרופורזה SDS-PAGE, שלפו בעדינות את מסרק האלקטרופורזה והוסיפו 20 מיקרוליטר דגימת חלבון לכל באר לאט ובאופן אחיד. הפעל את החשמל והפעל את האלקטרופורזה במתח של 80 וולט למשך 30 דקות. לאחר שהחלבונים הגיעו לשכבת הג'ל התחתונה, עברו ל-100 וולט, והמשיכו את האלקטרופורזה במשך 60-70 דקות.
הערה: אלקטרופורזה זקוקה למאגר אלקטרופורזה טרי. - מעבירים את החלבונים לקרום PVDF על ידי העברה רטובה. הפעל את קרום PVDF עם מתנול מראש (5-30 שניות). מוציאים את צלחת ג'ל האלקטרופורזה, פותחים אותה בזהירות, מכניסים את ג'ל המפריד למאגר ההעברה הרטוב, מכינים את כריך ההעברה החשמלית ומרכיבים את מערכת ההעברה הרטובה. מלא את מיכל האלקטרופורזה במאגר העברה, והעבר ב- 400 mA למשך 90 דקות.
הערה: מאגר ההעברה מקורר מראש כדי למנוע השפעות של טמפרטורות גבוהות במהלך ההעברה הרטובה. - שטפו את קרום PVDF במי מלח חוצצים עם 0.5% Tween-20 (TBST) למשך 3 x 5 דקות. לחסום את קרום PVDF עם 5% חלב רזה מדולל TBST, ולדגור על שייקר בטמפרטורת החדר במשך 60 דקות; לאחר מכן, שטפו עם TBST במשך 2 דקות. לאחר השטיפה, יש לדגור על הממברנה למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C כאשר הנוגדן הראשוני vimentin (1:5,000) ו-GAPDH (1:10,000) מדוללים ב-5% BSA.
- מניחים את הממברנה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ושוטפים עם TBST במשך 5X5 דקות. לאחר השטיפה, דוגרים על הממברנה עם הנוגדן המשני (1:10,000) מדולל בחלב רזה 5% למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הממברנה, בצד החלבון, משחררים את תמיסת העבודה ECL המוכנה, דוגרים במשך 1-2 דקות, וצופים בתוצאות עם מכונת הדמיה של ג'ל. השתמש בערכי גווני האפור שנמדדו על-ידי התוכנה במכונת ההדמיה של הג'ל כדי להעריך את רמות ביטוי החלבון.
הערה: כאן, GAPDH שימש כהפניה פנימית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל עכברי לחקר ניקוטין בשילוב עם חשיפה לסיליקה הוקם כדי לחקור את התפקיד הפוטנציאלי של ניקוטין בהתקדמות סיליקוזיס בעכברים. איור 1 מתאר את התהליך הניסיוני לשימוש במודל עכבר בעל חשיפה כפולה, אשר שילב הזרקת ניקוטין עם החדרת תרחיף סיליקה לאף. השינויים הפתולוגיים של העכברים בכל קבוצה נצפו באמצעות צביעת HE. העכברים שנחשפו לניקוטין בשילוב עם סיליקה סבלו מנזק ריאתי חמור יותר באופן משמעותי מאלה שנחשפו לניקוטין או לסיליקה בלבד. לימפוציטים גדלו ליד כלי הלימפה בריאות של עכברים שנחשפו לניקוטין, ויצרו אשכולות תאים דלקתיים. צביעת Masson חשפה עלייה משמעותית בשקיעת סיבי קולגן בריאות שנחשפו לניקוטין בשילוב עם סיליקה בהשוואה לריאות בקבוצות האחרות, וזה נתמך על-ידי כימות צביעת Masson (איור 2). מבנה הנאדיות נהרס בעכברים שנחשפו לסיליקה, ומספר המקרופאגים גדל. עם זאת, לאחר חשיפה לניקוטין בשילוב עם סיליקה, הייתה חדירת תאים דלקתית משמעותית, והופיעו גושים פיברובלסטים. בנוסף, מקרופאגים מצטברים, במיוחד מקרופאגים M2, נוכחים בקבוצת החשיפה הכפולה. מקרופאגים מסוג M2 חיוניים לשלב הפיברוטי המתקדם של סיליקוזיס.
נוסף על כך, עלייה משמעותית בגורם הפרו-פיברוטי TGF-β1 נצפתה על-ידי צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) בריאות של עכברים שנחשפו פעמיים, במיוחד בתאי דלקת ליד כלי הלימפה (איור 3). TGF-β1 המופרש על ידי מקרופאגים מקדם EMT של תאי אפיתל ופיברוזיס ריאתי12. בהשוואה לעכברים שנחשפו לסיליקה בלבד, רמות הווימנטין היו גבוהות משמעותית בריאות של עכברים בחשיפה כפולה. גם צביעת IHC וגם כימות חלבונים הצביעו על EMT חמור בעכברים עם חשיפה כפולה (איור 4). הראיות המשולבות מצביעות על כך שחשיפה כרונית לסיליקה מקדמת EMT לאחר הגברת הרגולציה של TGF-β1, מה שמוביל לעלייה בפיברובלסטים ובפיברוזיס מתקדם. במקביל, תוספת של ניקוטין מאיצה את התהליך של פיברוזיס ריאתי על ידי מחמיר EMT, המאפשר פיברוזיס ריאות להופיע מוקדם יותר. מודל זה נועד לחקור את ההשפעה של ניקוטין על פיברוזיס ריאתי, שהוא תוצאה של חשיפה כרונית לסיליקה בבני אדם.
איור 1: תכנון מודל ניסיוני של חשיפה משולבת לניקוטין וסיליקה בעכברים. הזרקה רציפה של ניקוטין למשך 1-40 יום והחדרה רציפה לאף של סיליקה למשך 5-19 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניקוטין מקדם היווצרות של מסות פיברובלסטיות בריאות של עכברים שנחשפו לסיליקה. (A) נעשה שימוש בצביעת HE כדי לדמיין שינויים פתולוגיים בריאות. העכברים שנחשפו פעמיים סבלו מחדירת תאים דלקתיים חמורים ופיברוזיס. החיצים הירוקים מצביעים על מסות תאים דלקתיות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) צביעת מאסון שימשה להצגת סיבי קולגן בריאות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) כימות סיבי קולגן בריאות. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עלייה בתאים חיוביים ל-CD206 וב-TGF-β1 בריאות של עכברים בעלי חשיפה כפולה לניקוטין ולסיליקה. (A) צביעת IHC של CD206 שימשה לצפייה בתפוצה ובביטוי של מקרופאגים בעכברים בעלי חשיפה כפולה. מקרופאגים חיוביים ל-CD206 עלו בריאות של עכברים לאחר חשיפה משולבת לניקוטין ולסיליקה. החצים הקצרים מייצגים תאים חיוביים CD206. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) TGF-β1, מקדם פיברוזיס, היה גבוה בעכברים בעלי חשיפה כפולה. החצים הארוכים מייצגים תאים חיוביים TGF-β1. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C,D) AOD של CD206 ו- TGF-β1. AOD = IOD (צפיפות אופטית משולבת)/שטח. ה-AOD משקף את הריכוז של CD206 ו-TGF-β1 ליחידת שטח. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. קיצורים: TGF-β1 = שינוי גורם גדילה-בטא; IHC = אימונוהיסטוכימיה; AOD = צפיפות אופטית ממוצעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קידום פיברוזיס ריאתי על-ידי ניקוטין בעכברים שנחשפו לסיליקה באמצעות החמרה של EMT. (A) ביטוי הווימנטין בכל קבוצה נצפה על-ידי צביעת IHC. וימנטין בא לידי ביטוי חזק בריאות העכברים שנחשפו לניקוטין ולסיליקה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.(B) כתם מערבי של ביטוי וימנטין בכל קבוצת חשיפה, עם עלייה בוימנטין ברקמות הריאה של עכברים שנחשפו פעמיים. (C) ערך ה-AOD של וימנטין היה גבוה יותר באופן משמעותי בקבוצת החשיפה הכפולה בהשוואה לקבוצות האחרות. (D) רמת ביטוי החלבון היחסית של וימנטין בהשוואה ל-GAPDH. ביטוי הווימנטין בקבוצת החשיפה הכפולה היה גבוה משמעותית מאשר בקבוצות החשיפה לניקוטין או סיליקה. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. קיצורים: EMT = מעבר אפיתל-מזנכימלי; AOD = צפיפות אופטית ממוצעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל בעלי חיים בחשיפה כפולה נחוץ כדי לחקור את התפקיד ואת המנגנונים הפוטנציאליים של חשיפה בו-זמנית לניקוטין ולצורן דו-חמצני גבישי. מודל זה הושג בעבודה זו באמצעות הזרקה תת עורית של ניקוטין וטפטוף האף של סיליקה. כדי להבטיח הזרקת ניקוטין מוצלחת, על המפעיל להכיר את אחיזת העכברים, שכן אחיזת העור בעורפו עלולה להכאיב להם. לכן, חשוב לאפשר לעכברים להסתגל בהדרגה לאחיזה. בנוסף, שלב קריטי בחשיפה לסיליקה בעכברים הוא טפטוף האף. כדי להגדיל את הצלחת ההליך ואת שיעור ההישרדות של העכברים, חיוני לתרגל את טפטוף האף מראש.
בעת ביצוע ההזרקה, יש לרפרף את המזרק מעל ראשו של העכבר כדי למנוע מאבק חזק כאשר העכבר רואה את המזרק. זנבו של העכבר צריך להיות אחוז היטב ביד ימין, ואילו ביד שמאל יש להשתמש כדי לדחוף את העור עד שולי האוזן בחלק האחורי של הצוואר בזהירות ובעדינות כדי לצבוט את העור שם. לאחר שחרור זנב העכבר ביד ימין, יש לייצב את הזנב והגפיים האחוריות באמצעות האגודל השמאלי והקמיצה כדי למנוע נשיכה. באמצעות מזרק 1 מ"ל ביד ימין, המחט צריכה להיות מוחדרת לתוך העור הרפוי מעל הצוואר בזווית של 30 מעלות בכיוון ראש לזנב. המחט צריכה להיות נסוגה מעט לאחר ההתנגדות הוא איבד, ואת הזריקה צריך להיות מנוהל לאט ובאופן שווה. בימים 5-19 נחשפו עכברים בקבוצת החשיפה הכפולה לניקוטין ולסיליקה. מומלץ להזריק את הניקוטין בשעה 08:00 בבוקר, לאחר מכן טפטוף אף של צורן דו-חמצני בשעה 14:00, והזרקה נוספת של ניקוטין בשעה 20:00. שתי זריקות הניקוטין חייבות להינתן בהפרש של 12 שעות זו מזו, כדי למנוע את ההשפעות של אחיזה חוזרת ונשנית על העכברים.
ביצוע הזרקות תת עוריות וטפטוף אף מציב מספר אתגרים טכניים. עבור זריקות תת עוריות, יש לתפוס את העכברים בכוח מתאים. אם העור בחלק האחורי של הצוואר מכווץ חזק מדי, נתיב האוויר של העכבר ייחסם, מה שיוביל במהירות לחנק. לקבלת חוזק אופטימלי, העור בחלק האחורי של הצוואר צריך להיות צובט עד גלגלי העיניים בולטים מעט. בשלב זה, העכבר מרגיש את הכאב הנמוך ביותר ונושם בצורה חלקה. בנוסף, מזרק 1 מ"ל כי הוא מרוקן מאוויר צריך לשמש כדי למשוך את הזרקת ניקוטין מן הצינור, ואחריו עוד 0.1-0.2 מ"ל של אוויר. לפני ההזרקה, יש להעיף את הבועות בעדינות החוצה. בשל הנפח הקטן של ההזרקה, הניקוטין שנותר בקצה קצה המחט עלול להוביל למינון לא מספיק. החלקים העיקריים של ההזרקה הם החדרת המחט במהירות, הזרקת הניקוטין לאט והסרת המחט בעדינות. עבור טפטוף האף, במחקר זה, חלל האף של העכברים נחשף במלואו תחת הרדמה עמוקה, ואחריה החדרה איטית ואחידה של תרחיף דו תחמוצת הסיליקון. חשוב גם ללחוץ בעדינות על חלל בית החזה לאחר חשיפה לסיליקה כדי למנוע שיעול או חנק.
למודל זה יש מגבלות מסוימות. חלקיקי הסיליקה בגודל 1-5 מיקרומטר ששימשו בניסויים לא נאספו מהסביבה והיו חלקיקי סיליקה טהורים. לעומת זאת, במסגרות תעסוקתיות בפועל, העובדים עלולים להיחשף למגוון חומרים מסוכנים, ולא רק לחלקיקי סיליקה, כגון תערובת של פחם ואבק סיליקה במפעל קרמיקה או במכרה פחם. השתמשנו בסיליקה להחדרה לאף כדי להשיג מינונים נמוכים וחשיפות חוזרות ונשנות כדי לדמות חשיפה כרונית של עובדים. במודל העכבר בעל החשיפה הכפולה, למרות שהניקוטין אינו מגיע מחשיפה לעשן סיגריות, הניקוטין המוזרק נכנס ישירות לזרם הדם, ומאפשר חקירה ממוקדת יותר של תפקיד הניקוטין בתהליך הסיליקוזיס והימנעות מההשפעות של רכיבים אחרים של עשן סיגריות.
המחקר המדעי על סיליקוזיס השתמש בדרך כלל במודלים של עכברים בעלי גורם יחיד, בין אם באמצעות שאיפה או זילוח סימפונות של סיליקה, כדי להעריך את תפקיד הסיליקה בהתפתחות מחלות. גישה חלופית היא החדרת צורן דו-חמצני לאף, שהיא פשוטה וקלה ומאפשרת הקמת מודלים של חשיפה חוזרת וכרונית לסיליקה13. מודל טפטוף האף המבוסס היטב של צורן דו-חמצני גורם נזק מינימלי לעכברים וניתן לשלב אותו עם גורמים אחרים כדי ליצור מודל רב גורמי של בעלי חיים. בנוסף, השיטות העיקריות לחשיפה לניקוטין בעכברים כוללות ניקוטין במי השתייה, הזרקה תת עורית של ניקוטין, עירוי ניקוטין באמצעות משאבות אוסמוטיות וחשיפה לעשן טבק14. ההזרקה התת עורית המשמשת במודל החשיפה הכפולה מאפשרת להגדיר במדויק את המינון והתזמון של ניקוטין, ומבטיחה שכל עכבר יקבל את אותו המינון.
בקיצור, המודל החייתי של ניקוטין בשילוב עם חשיפה לסיליקה משכפל דפוס חשיפה כרוני מציאותי, וניתן להשתמש במודל זה למחקרים נוספים על השפעות הניקוטין על דלקת ופיברוזיס בהתפתחות סיליקוזיס. בנוסף, מודל זה משמש בסיס ליצירת מודל בעלי חיים בעלי חשיפה כפולה עם מינונים ומסגרות זמן מרובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית החדשנות הסינרגית האוניברסיטאית של מחוז אנחווי (GXXT-2021-077) וקרן החדשנות לבוגרי אוניברסיטת אנחווי למדע וטכנולוגיה (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
