Summary
Bu çalışma, deneysel silikoz farelerinde nikotinin pulmoner fibrozun ilerlemesi üzerindeki sinerjik etkisini incelemek için bir fare modelini açıklamaktadır. Çift pozlamalı fare modeli, nikotin ve silikaya aynı anda maruz kaldıktan sonra akciğerdeki patolojik ilerlemeyi simüle eder. Açıklanan yöntemler basittir ve yüksek oranda tekrarlanabilir.
Abstract
Sigara içmek ve silikaya maruz kalmak meslek çalışanları arasında yaygındır ve silikanın sigara içenlerin akciğerlerine sigara içmeyenlere göre zarar verme olasılığı daha yüksektir. Sigaradaki birincil bağımlılık yapıcı bileşen olan nikotinin silikoz gelişimindeki rolü belirsizdir. Bu çalışmada kullanılan fare modeli basit ve kolay kontrol edildi ve insanlarda epitelyal-mezenkimal geçiş yoluyla kronik nikotin alımının ve tekrar tekrar silikaya maruz kalmanın akciğer fibrozu üzerindeki etkilerini etkili bir şekilde simüle etti. Ek olarak, bu model, sigara dumanındaki diğer bileşenlerin etkilerinden kaçınırken, nikotinin silikoz üzerindeki etkilerinin doğrudan incelenmesine yardımcı olabilir.
Çevresel adaptasyondan sonra, farelere 40 gün boyunca her sabah ve akşam 12 saat aralıklarla boyun üzerindeki gevşek cilde 0.25 mg / kg nikotin çözeltisi ile deri altına enjekte edildi. Ek olarak, kristal silika tozu (1-5 μm) normal salin içinde süspanse edildi, 20 mg / mL'lik bir süspansiyona seyreltildi ve ultrasonik bir su banyosu kullanılarak eşit olarak dağıtıldı. İzofluran ile uyuşturulmuş fareler, bu silika tozu süspansiyonunun 50 μL'sini burundan soludu ve göğüs masajı ile uyandırıldı. Silika maruziyeti 5-19. günlerde günlük olarak uygulandı.
Çift maruz kalan fare modeli, her iki zararlı faktöre de maruz kalan işçilerin maruz kalma geçmişiyle eşleşen nikotine ve ardından silikaya maruz bırakıldı. Ek olarak, nikotin, farelerde epitelyal-mezenkimal dönüşüm (EMT) yoluyla pulmoner fibrozu teşvik etti. Bu hayvan modeli, birden fazla faktörün silikoz gelişimi üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
İşçilerde silika maruziyeti bazı mesleki ortamlarda kaçınılmazdır ve bir kez silikaya maruz kaldıktan sonra bozulma ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra bile ilerler. Buna ek olarak, bu işçilerin çoğu sigara içiyor ve geleneksel sigaralar binlerce kimyasal içeriyor ve temel bağımlılık yapıcı bileşen nikotin1. E-sigaralar genç yaş gruplarında giderek daha popüler hale geliyor2; Bu e-sigaralar bir nikotin dağıtım sistemi görevi görür ve nikotin erişimini arttırır, böylece akciğer duyarlılığını ve zatürreyi arttırır3. Sigara dumanı ayrıca bleomisine maruz kalan farelerde 4 pulmoner fibrozu hızlandırır ve silikaya maruz kalan farelerdepulmoner toksisiteyi ve fibrozu artırır 5,6. Bununla birlikte, nikotinin silikanın neden olduğu enflamatuar ve pulmoner fibroz sürecini etkileyip etkilemediği araştırılmaya devam etmektedir.
Yüksek dozda silikanın trakeaya bir kerelik solunmasıyla oluşturulan silikoz fare modeli, fareler için travmatiktir. Bu yöntem hızlı bir şekilde silikoz modeli sağlasa da, işçilerin tekrar tekrar silikaya maruz kaldığı bir ortamın gerçekliğiyle uyuşmuyor. Bu nedenle, burun akıntısı yoluyla tekrar tekrar düşük dozda silika süspansiyonu vererek silikaya maruz kalan bir fare modeli oluşturduk; Bu doz farelerde iltihaplanma ve fibrozise neden olabilir.
Diğer sigara bileşenlerinin etkilerini atlatmak için, bu fare modeli, bağımlılık yapan bileşen olan nikotinin silikoz üzerindeki etkisini belirlemek için boynun gevşek derisine deri altından nikotin enjekte edildi. Deri altı enjeksiyonların uygulanmasıyla, doğru dozlama elde edilebilir, böylece nikotin maruziyet modelleri oluşturmayı ve doz-toksisite tepkilerini ve bağımlılığı gözlemlemeyi mümkün kılar. Erkek farelerde nikotin enjeksiyon dozu 0.2-0.4 mg/kg 7,8 olan bir nikotin bağımlılığı modeli geliştirilmiştir. Bu modelde, bağımlı farelerin ilaç arama ihtiyaçlarını karşılamak için, 12 saatlik aralıklarla iki deri altı enjeksiyon uygulandı. Bu fare nikotin bağımlılığı modeli, insanların sigara içme alışkanlıklarını ve silikaya maruz kalmayı simüle etmek için kullanışlıdır.
Tek faktörlü hayvan modellerinin hastalık çalışmalarında sınırlamaları vardır, oysa burada açıklanan yöntem, nikotin ve silika birlikte maruz kalmanın iki faktörlü bir fare modelini içerir. Silika maruziyetinden önce, fareler sigara içen kişilerde nikotin maruziyetini çoğaltmak için nikotine önceden maruz bırakıldı. Daha sonra, sigara içme öyküsü olan bireyler için bir çalışma ortamında silika maruziyetini taklit etmek için 5. günden 19. güne kadar silika maruziyeti gerçekleşti.
Alveoler makrofajların akciğer iltihabı ve fibrozisin düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Makrofajlar, silika solunduğunda silikayı parçalayamaz, bu da makrofaj polarizasyonuna veya apoptoza9 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) ve dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGF-β) gibi sitokinlerin salınmasına yol açar. Yüzey belirteci CD86'nın varlığı ile tanımlanan M1 makrofajları, silikozda inflamatuar yanıtın birincil tetikleyicileri iken, CD206 ile işaretlenen M2 makrofajları, durumun10'unun fibrotik fazından sorumludur. Çift maruz kalan farelerde nikotin, silika ile yaralanmış akciğerlerde makrofajların M2 fenotipine doğru polarizasyonunu indükledi ve böylece pulmoner fibrozu teşvik etti. Ayrıca, TGF-β1, fibroz ve EMT11'in indüksiyonunun anahtarıdır; TGF-β1'in artan ekspresyonu, EMT yoluyla akciğer fibrozunun ilerlemesini hızlandırdı. Bu model, nikotinin silikoz üzerindeki etkilerini başarılı bir şekilde analiz etti ve nikotin bırakmanın önemini daha da vurguladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu (NRC'nin 8. baskısı) tarafından yayınlanan yönergelere göre yürütüldü ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.
1. Hayvan hazırlama
- 8 haftalık 32 erkek C57/BL6 fareyi 12 saatlik aydınlık/karanlık döngüsüne sahip bir laboratuvarda barındırın. Farelerin yiyecek ve suya serbestçe erişebildiğinden emin olun.
- Çevreye alıştıktan 2 hafta sonra, 10 haftalık fareler 23-26 g ağırlığındayken, hayvanları bölmeden rastgele gruplandırmak için bir bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele sayıları kullanın ve dört fare grubu elde edin: kontrol grubu (Con), nikotin grubu (Nic), silika grubu (SiO 2) ve silika grubu (Nic + SiO2) ile birleştirilmiş nikotin.
2. Nikotin hazırlama
NOT: Nikotin yoğunluğu 1.01 g/mL'dir.
- Nikotini susuz etanol içinde çözün ve 50 mg / mL'lik bir nikotin stok çözeltisi hazırlamak için 20x seyreltin.
- 0.05 mg / mL konsantrasyonda çalışan bir çözelti yapmak için nikotin stok çözeltisini 1.000x steril normal salin ile seyreltin.
NOT: Nikotini ışıktan uzakta saklayın. Stok solüsyon 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir.
3. Silika hazırlama
- 20 mg / mL silika süspansiyonu hazırlamak için steril kristal silikayı tuzlu su içinde askıya alın ve 25 dakika boyunca ultrasonik çalkalama su banyosunda salın.
- Fareler burun damlasını almadan önce silika süspansiyonunu bir girdap osilatörü ile 3 dakika çalkalayın. Silika süspansiyonunu 200 μL'lik bir pipetle 2x-3x yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve ardından burun damlası için 50 μL alın.
NOT: Silikon dioksit süspansiyonu mümkün olan en kısa sürede karıştırılmalı ve burun damlası yoluyla uygulanmalıdır.
4. Fare yakalama ve nikotin maruziyeti
- Fareleri tartın ve maruz kalmadan önce ağırlıkları günlük olarak kaydedin.
- 1-40. günlerde, Nic ve Nic + SiO2 gruplarındaki farelere günde iki kez (12 saat arayla) deri altından nikotin enjekte edin. 0.25 mg / kg'lık bir nikotin dozu kullanın; Örneğin, 25 g ağırlığındaki bir farenin 6.25 μg nikotin aldığından emin olun. Bu fare için enjeksiyon hacmi şu şekilde olacaktır: 6.25/0.05 = 125 μL. Eşzamanlı olarak, Con grubundaki farelere eşit miktarda salin enjekte edin.
- Her grup için gerekli 1 mL'lik şırıngaları hazırlayın ve bunları nikotin veya salin enjeksiyon hacmini aspire etmek için kullanın. Nikotini almadan önce, önce şırıngaya 0.1-0.2 mL hava çekin ve ardından 125 μL nikotin çekin. İğneyi ve şırınganın ön ucunu nikotinle doldurmak için şırıngaya dikkatlice dokunun. Nikotin içeren şırıngayı ışıktan korunan bir tepsiye yerleştirin.
NOT: Enjeksiyon sırasında, nikotinin arkasında 0.1-0.2 mL hava bulunur ve bu da tüm sıvının fareye başarıyla uygulanmasını garanti eder. - Farenin kuyruğunu sağ elinizle kavrayın ve hayvan rahatladığında, boynun arkasındaki cildi kuyruktan başağa, kulağın kenarına kadar bastırmak için sol başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın, orta derecede basınç uygulayın. Bundan sonra, sağ elinizi bırakın ve sol küçük başparmağınızı ve yüzük parmağınızı kullanarak kuyruğu ve arka bacakları sıkıştırın, bu noktada fare sol el tarafından tamamen hareketsiz hale getirilecektir.
NOT: Fareyi uygun kuvvetle kavrayın. Yetersiz güç, farelerin ısırmasını kolaylaştırırken, aşırı güç, farelerin boğulmasına neden olabilir. - Enjekte etmek için sağ elinizi kullanarak, farelerin kulak kenarına yakın boynun arkasındaki cildi şırınga ile baştan kuyruğa doğru delin ve eşit bir oranda nikotin enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonu gösteren yarım daire biçimli bir cilt çıkıntısı arayın.
NOT: İğne cilde girdiğinde, bir direnç hissi olacaktır; İğne yerleştirildikten sonra direnç kaybolur. Bu noktada, yavaş ve eşit bir şekilde enjekte etmek için iğnenin hafifçe çekilmesi gerekir.
5. İn vivo silika maruziyeti
- 5-19. günlerde, silikon dioksit süspansiyonunu SiO 2 ve Nic + SiO2 gruplarındaki farelerin burun boşluğuna aşılayın. Her fareyi bir anestezi makinesinde% 2 izofluran ile 3.6 mL / s'lik bir dozda hızla uyuşturun. Anesteziden sonra, fareyi bir elin avucuna yerleştirin ve farenin burun boşluğunu ortaya çıkarın. 4-8 saniye içinde burun boşluğuna 50 μL silika süspansiyonu damlatın.
- Silika süspansiyonunun mümkün olan en kısa sürede akciğerlere girmesine izin vermek için, damlatmadan sonra, solunum hızını artırmak için farenin kalbine işaret parmağıyla saniyede 3-5 sn, 3x-5x hafifçe bastırın.
- Farenin solunumu yavaş yavaş homojen hale geldikten sonra, fareyi 3 dakika boyunca gözlemlemek için bir kafese yerleştirin.
- Silika süspansiyonu alan tüm fareler için 1-3 arasındaki adımları tekrarlayın. Kontrol grubunda, 5-19. günlerde burun boşluğuna 50 μL steril salin damlatın.
6. Taze ve sabit akciğer dokularının alınması
- 41. günde, fareleri vücut ağırlıklarına göre 0.1 mL / 20 g'lık bir dozda intraperitoneal olarak uyuşturmak için 50 mg / kg sodyum pentobarbital kullanın. Uzuvları bir köpük test plakasına sabitleyin ve kürkü% 75 alkol püskürtün.
- Taze akciğer dokusu elde etmek için kardiyak perfüzyon yapın, göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için karnın orta hattını kesin ve sağ kalbin tepesinde küçük bir açıklık açın. Daha sonra, sol kalbin tepesinden 20 mL önceden soğutulmuş fosfat tamponlu salin (PBS) yavaşça ve eşit bir şekilde enjekte edin ve kanın sağ kalbin tepesinde oluşturulan açıklıktan dışarı akmasına neden olun. Tüm akciğer lobunu çıkarın, önceden soğutulmuş 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve protein ekstraksiyonunu bekleyen depolama için −80 ° C'ye aktarın.
- Tüm akciğerleri sabitlemek için diğer fareleri 20 mL önceden soğutulmuş PBS ve ardından aynı yerde 10 mL% 4 paraformaldehit ile perfüze edin; her akciğeri 30 mL% 4 PFA'da koruyun.
- 72 saat sonra, sabit akciğer dokularını parafine gömün.
- Akciğer dokusunu hazırlanan fiksatife 40 ° C'de 30 dakika boyunca ultrasonik su banyosuna daldırın, ardından her biri 50 dakika boyunca% 75 etanol,% 95 etanol ve susuz etanol içinde bir dehidrasyon işlemi yapın.
- Her biri 50 dakika boyunca 2x ksilen ile yıkayın.
- Dokuyu 55-60 °C'de 2-3 saat eritilmiş parafin mumuna yerleştirin, böylece akciğer dokusundaki ksilen yavaş yavaş parafin mumu ile değiştirilir.
- Akciğer dokusunu gömme çerçevesine parafin ile sabitleyin ve balmumu bloğunun sertleşmesini bekleyin. Balmumu bloğu sertleştikten sonra, akciğeri 4-5 μm'de dilimlemek için parafin kesitleme makinesini kullanın.
- Akciğer bölümlerini 45 °C'de ultra saf suya koyun. Parafin eridikten sonra, akciğer bölümünü yapışık bir mikroskop lamına yükleyin.
7. Hematoksilen ve eozin (HE) boyama
- Slaytları 60 °C'de 2 saat pişirin ve slaytları 2 x 30 dakika mumdan arındırmak için ksilen içine koyun. Ardından, slaytları her biri 5 dakika boyunca susuz etanol, %95 etanol, %85 etanol ve %75 etanol içine yerleştirin. Son olarak, ultra saf suyla 3 x 5 dakika yıkayın.
- Bir pipet tabancası ile akciğer dokusuna 50 μL hematoksilen boyama solüsyonu damlatın ve 5 dakika boyayın; Daha sonra dilimleri 5 dakika akan su ile yıkayın.
- Bölüme etanol içinde 50 μL% 2 hidroklorik asit ekleyin ve 30 saniye boyunca damıtılmış su ile durulayın. Daha sonra, 1 dakika boyunca boyamak için akciğer dokusuna 50 μL eozin boyama solüsyonu ekleyin.
- Parafin bölümlerini kurutun, şeffaflaştırın ve kapatın.
- Kombine bir plastik boyama tankına 100-150 mL %75 etanol, %85 etanol, %95 etanol, susuz etanol ve ksilen ekleyin. Slaytları kurutmak için her biri 5 dakika boyunca %75, %85, %95 ve susuz etanol içine yerleştirin.
- Ardından, slaytları şeffaflaştırmak için 5 dakika ksilen içine yerleştirin.
- Son olarak, akciğer bölümüne 20 μL nötr sakız damlatın ve sızdırmaz hale getirmek için lamel üzerine bir lamel yerleştirin.
NOT: Yukarıdaki adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
8. Masson boyama
- Parafin bölümlerini adım 7.1'de açıklandığı gibi mumdan arındırın, nemlendirin ve yıkayın.
- Bölümleri 7 dakika boyunca 50 μL yapılandırılmış Weigert'in hematoksilen boyama solüsyonu, ardından 10 saniye boyunca 50 μL asidik etanol fraksiyonlama solüsyonu ile boyayın ve çekirdekleri maviye çevirmek için akan su ile yıkayın.
- Bölümleri 50 μL Masson trikrom çözeltisi ile 4 dakika boyayın ve suyla yıkayın.
- Bölümleri 1 dakika damıtılmış suyla durulayın ve ardından 7 dakika boyunca Lichun kırmızı asit macenta ile boyayın.
- Bölümleri 1-2 dakika zayıf asit çalışma solüsyonu (% 30 hidroklorik asit), 1-2 dakika fosfomolibdik asit solüsyonu ve 1-2 dakika zayıf asit çalışma solüsyonu ile yıkayın.
- Bölümleri anilin mavisi boyama solüsyonunda 2 dakika boyayın ve ardından 1 dakika boyunca zayıf bir asit çalışma solüsyonu ile yıkayın.
- Bölümleri %95 etanol ve ardından 1 saniye susuz etanol ile kurutun, 1 saniye ksilen ile şeffaflaştırın ve son olarak adım 7.4'te açıklandığı gibi nötr reçine ile kapatın.
9. İmmünohistokimya
- Dilimleri 60 °C'de 6 saat pişirin. Parafin bölümlerini adım 7.1'de açıklandığı gibi mumdan arındırın, nemlendirin ve yıkayın.
- Antijen alımı: Dilimleri, dilimleri daldırmak için yeterli sitrat antijen alma solüsyonu içeren ısıya dayanıklı plastik bir dilimleme kutusuna koyun ve 20-30 dakika kaynatın.
- Oda sıcaklığına soğutun, bölümleri çıkarın ve deiyonize su ile durulayın. Daha sonra,% 0,5 Tween-20 (PBST) içeren PBS'de 2 x 5 dakika bekletin.
- Hidrofobik bir daire oluşturmak için hidrofobik bir kalemle slayttaki akciğer bölümünün yanına bir halka çizin.
- Dilimlere damla damla 50 μL %3 hidrojen peroksit çözeltisi (%3H2O2) ekleyin ve endojen peroksidazın inaktivasyonu için ışıktan korunarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Dilimleri PBST'de 3 x 5 dakika bekletin.
- Dilimlere damla damla 50 μL sığır serum proteini (BSA)-PBST ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat bloke edin.
- Bloke edici çözeltiyi atın, 50 μL seyreltilmiş primer antikor CD206 (seyreltme: 1:1,500), TGF-β1 (seyreltme: 1:200) ve vimentin (seyreltme: 1:2.000) dilimlere damla damla ekleyin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
NOT: Bu çalışmada, tüm antikorlar %5 BSA'da seyreltilmiştir. - Ertesi gün dilimleri oda sıcaklığına getirin (40 dakika). Dilimleri adım 9.6'da anlatıldığı gibi yıkayın.
- İkincil antikoru% 5 BSA'da seyreltin. Damla damla 50 μL yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikor (seyreltme: 1:500) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Dilimleri adım 9.6'da anlatıldığı gibi yıkayın.
- Enzim etiketli sekonder antikora karşılık gelen 50 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) solüsyonunu akciğer dokusuna damlatın ve siyah bir immünohistokimyasal ıslak kutuda 5-10 dakika inkübe edin. Renk güçlü bir kahverengiye dönüşene kadar mikroskop altında gözlemleyin. Reaksiyonu sonlandırmak için dilimleri damıtılmış suyla durulayın.
NOT: Kahverengi boyama pozitif boyama olarak kabul edilir. - 30 saniye boyunca 50 μL hematoksilen boyası ile boyayın ve akan su ile yıkayın. Daha sonra dilimleri %75, %85, %95 ve susuz etanolde her biri 3 dakika ve ardından 2 x 10 dakika ksilen içinde bekletin. Slaytları adım 7.4'te açıklandığı gibi kapatın.
10. Batı lekesi analizi
- Akciğer dokusunu dondurucudan çıkarın ve tartın. Daha sonra, 20 mg akciğer dokusu başına PMSF içeren 150 μL RIPA lizis tamponu ekleyin. El tipi bir homojenizatör kullanarak fare akciğerlerini 3-5 dakika buz üzerinde parçalayın, akciğer dokusunun yeterli parçalanmasını sağlamak için 4 ° C'de 2 saat hafifçe çalkalayın, 4 ° C'de santrifüj edin ve 15 dakika boyunca 14.800 × g ve süpernatanı toplayın.
NOT: RIPA lizis tamponunu kullanmadan birkaç dakika önce 100 mM fenilmetansülfonilflorür (PMSF) ekleyin. PMSF'nin nihai konsantrasyonu 1 mM'dir (ör., 10 μL PMSF + 990 μL RIPA). - Üreticinin talimatlarını izleyerek numunenin protein konsantrasyonunu belirlemek için bir BCA protein konsantrasyon kiti kullanın. Belirlemeden sonra, en küçük protein lizat konsantrasyonunu baz olarak kullanarak, aynı kütle ve hacmi elde etmek için aynı protein lizat partisini RIPA ile en küçük konsantrasyona seyreltin.
NOT: Toplam akciğer dokusu yükleme miktarı 30 μg'dır. - 160 μL protein lizatına 40 μL 5x yükleme tamponu ekleyin ve 100 °C'de 10 dakika ısıtın.
- Hazırlanan% 10 sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jelini batı lekeleme elektroforez sisteminde birleştirin, SDS-PAGE elektroforez tamponunu ekleyin, elektroforez tarağını yavaşça dışarı çekin ve 20 μL protein numunesi ekleyin. Gücü açın ve elektroforezi 30 dakika boyunca 80 V'ta başlatın. Proteinler alt jel tabakasına ulaştıktan sonra 100 V'a geçin ve elektroforeze 60-70 dakika devam edin.
NOT: Elektroforez, taze elektroforez tamponuna ihtiyaç duyar. - Proteinleri ıslak transfer yoluyla bir PVDF membranına aktarın. PVDF membranını önceden metanol ile etkinleştirin (5-30 s). Elektroforez jel plakasını çıkarın, dikkatlice kaldırın, ayırıcı jeli ıslak transfer tamponuna yerleştirin, elektrikli transfer sandviçini yapın ve ıslak transfer sistemini monte edin. Elektroforez tankını transfer tamponu ile doldurun ve 400 mA'da 90 dakika boyunca aktarın.
NOT: Islak transfer sırasında yüksek sıcaklıkların etkilerini önlemek için transfer tamponu önceden soğutulur. - PVDF membranını %0,5 Tween-20 (TBST) içeren Tris tamponlu salin ile 3 x 5 dakika yıkayın. PVDF membranını TBST ile seyreltilmiş% 5 yağsız sütle bloke edin ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 60 dakika inkübe edin; daha sonra TBST ile 2 dakika yıkayın. Yıkadıktan sonra, membranı gece boyunca 4 °C'de% 5 BSA içinde seyreltilmiş birincil antikor vimentin (1: 5.000) ve GAPDH (1: 10.000) ile inkübe edin.
- Membranı 30 dakika oda sıcaklığına getirin ve TBST ile 5 x 5 dakika yıkayın. Yıkadıktan sonra, membranı oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 5 yağsız sütle seyreltilmiş ikincil antikor (1: 10.000) ile inkübe edin.
- Membranı protein tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin, hazırlanan ECL çalışma solüsyonunu bırakın, 1-2 dakika inkübe edin ve sonuçları bir jel görüntüleyici ile gözlemleyin. Protein ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için jel görüntüleyicideki yazılım tarafından ölçülen gri tonlama değerlerini kullanın.
NOT: Burada, GAPDH dahili bir referans olarak hizmet vermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farelerde silikozun ilerlemesinde nikotinin potansiyel rolünü araştırmak için silika maruziyeti ile birlikte nikotini incelemek için bir fare modeli oluşturulmuştur. Şekil 1 , bir nikotin enjeksiyonunu bir silika süspansiyonunun nazal damlatmasıyla eşleştiren çift pozlamalı bir fare modelini kullanmak için deneysel prosedürü göstermektedir. Her gruptaki farelerin patolojik değişiklikleri HE boyama kullanılarak gözlendi. Silika ile birlikte nikotine maruz kalan fareler, tek başına nikotin veya silikaya maruz kalanlara göre önemli ölçüde daha ciddi akciğer hasarına sahipti. Lenfositler, nikotine maruz kalan farelerin akciğerlerindeki lenfatik damarların yakınında artarak enflamatuar hücre kümeleri oluşturdu. Masson boyama, diğer gruplardaki akciğerlere kıyasla silika ile birlikte nikotine maruz kalan akciğerlerde kollajen lif birikiminde önemli bir artış olduğunu ortaya koydu ve bu, Masson boyama miktar tayini ile desteklendi (Şekil 2). Silikaya maruz kalan farelerde alveolar yapı tahrip edildi ve makrofaj sayısı arttı. Bununla birlikte, silika ile birlikte nikotine maruz kaldıktan sonra, önemli inflamatuar hücre infiltrasyonu vardı ve fibroblast nodülleri ortaya çıktı. Ek olarak, birikmiş makrofajlar, özellikle M2 makrofajları, çift maruz kalan grupta bulunur. M2 makrofajları, silikozun ileri fibrotik evresi için gereklidir.
Ek olarak, çift maruz kalan farelerin akciğerlerinde, özellikle lenfatik damarların yakınındaki enflamatuar hücrelerde immünohistokimyasal (IHC) boyama ile pro-fibrotik faktör TGF-β1'de önemli bir artış gözlenmiştir (Şekil 3). Makrofajlar tarafından salgılanan TGF-β1, epitel hücrelerinin EMT'sini ve pulmoner fibrozis12'yi destekler. Sadece silikaya maruz kalan farelerle karşılaştırıldığında, çift maruziyetli farelerin akciğerlerinde vimentin seviyeleri önemli ölçüde yükselmiştir. Hem IHC boyaması hem de protein ölçümü, çift maruz kalan farelerde şiddetli EMT'yi gösterdi (Şekil 4). Birleşik kanıtlar, kronik silika maruziyetinin TGF-β1'in yukarı regülasyonundan sonra EMT'yi desteklediğini ve fibroblastlarda ve ilerleyici fibrozda bir artışa yol açtığını göstermektedir. Aynı zamanda, nikotin ilavesi, EMT'yi ağırlaştırarak pulmoner fibroz sürecini hızlandırır ve akciğer fibrozunun daha erken ortaya çıkmasına izin verir. Bu model, insanlarda kronik silika maruziyetinin bir sonucu olan nikotinin pulmoner fibroz üzerindeki etkisini araştırmak için tasarlanmıştır.
Şekil 1: Farelerde nikotin ve silikaya kombine maruz kalmanın deneysel bir modelinin tasarımı. 1-40 gün boyunca sürekli nikotin enjeksiyonu ve 5-19 gün boyunca sürekli nazal silika damlatılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nikotin, silikaya maruz kalan farelerin akciğerlerinde fibroblastik kitlelerin oluşumunu teşvik eder. (A) Akciğerlerdeki patolojik değişiklikleri görselleştirmek için HE boyaması kullanıldı. Çift maruz kalan farelerde şiddetli inflamatuar hücre infiltrasyonu ve fibroz vardı. Yeşil oklar enflamatuar hücre kitlelerini gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Akciğerlerdeki kollajen liflerini göstermek için Masson boyaması kullanıldı. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Akciğerlerdeki kollajen liflerinin miktarının belirlenmesi. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nikotin ve silika çift maruz kalan farelerin akciğerlerinde artmış CD206 pozitif hücreler ve TGF-β1. (A) CD206'nın IHC boyaması, çift maruz kalan farelerde makrofajların dağılımını ve ekspresyonunu gözlemlemek için kullanıldı. CD206 pozitif makrofajlar, kombine nikotin ve silika maruziyetinden sonra farelerin akciğerlerinde artmıştır. Kısa oklar CD206 pozitif hücreleri temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Fibrozun bir promotörü olan TGF-β1, çift maruz kalan farelerde yükselmiştir. Uzun oklar TGF-β1-pozitif hücreleri temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C,D) CD206 ve TGF-β1'in AOD'si. AOD = IOD (entegre optik yoğunluk)/alan. AOD, birim alan başına CD206 ve TGF-β1 konsantrasyonunu yansıtır. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Kısaltmalar: TGF-β1 = dönüştürücü büyüme faktörü-beta; IHC = immünohistokimya; AOD = ortalama optik yoğunluk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: EMT'nin şiddetlendirilmesi yoluyla silikaya maruz kalan farelerde nikotin ile akciğer fibrozunun teşviki. (A) Her grupta vimentin ekspresyonu IHC boyama ile gözlendi. Vimentin, nikotin ve silikaya maruz kalan farelerin akciğerlerinde güçlü bir şekilde eksprese edildi. Ölçek çubuğu = 50 μm.(B) Her maruziyet grubunda vimentin ekspresyonunun batı lekesi, çift maruz kalan farelerin akciğer dokularında vimentin artışı. (C) Vimentinin AOD değeri, çift maruz kalan grupta diğer gruplara göre önemli ölçüde daha yüksekti. (D) GAPDH'ye kıyasla vimentinin nispi protein ekspresyon seviyesi. Çift maruziyet grubundaki vimentin ekspresyonu, nikotin veya silika maruziyet gruplarından önemli ölçüde daha yüksekti. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Kısaltmalar: EMT = epitelyal-mezenkimal geçiş; AOD = ortalama optik yoğunluk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nikotin ve kristalin silikon dioksite eşzamanlı maruz kalmanın rolünü ve potansiyel mekanizmalarını araştırmak için çift maruziyetli bir hayvan modeli gereklidir. Bu model, bu çalışmada deri altı nikotin enjeksiyonu ve silika burun damlası yoluyla elde edildi. Başarılı bir nikotin enjeksiyonu sağlamak için, operatörün fareleri kavramaya aşina olması gerekir, çünkü boynun arkasındaki cildi kavramak onlar için acı verici olabilir. Bu nedenle, farelerin yavaş yavaş kavramaya uyum sağlamasına izin vermek önemlidir. Ek olarak, farelerde silika maruziyetinde kritik bir adım burun akıntısıdır. İşlemin başarısını ve farelerin hayatta kalma oranını artırmak için burun damlasını önceden uygulamak önemlidir.
Enjeksiyonu gerçekleştirirken, fare şırıngayı gördüğünde güçlü bir mücadeleyi önlemek için şırınga farenin kafasının üzerinden geçirilmelidir. Farenin kuyruğu sağ elle sıkıca kavranmalı, sol el ise cildi boynun arkasındaki kulak kenarına kadar dikkatli ve nazik bir şekilde itmek ve oradaki deriyi sıkıştırmak için kullanılmalıdır. Farenin kuyruğunu sağ elle serbest bıraktıktan sonra, ısırmayı önlemek için kuyruk ve arka bacaklar sol başparmak ve yüzük parmağı kullanılarak stabilize edilmelidir. Sağ elde 1 mL'lik bir şırınga kullanılarak, iğne boynun üstündeki gevşek deriye baştan kuyruğa doğru 30°'lik bir açıyla sokulmalıdır. Direnç kaybolduktan sonra iğne hafifçe geri çekilmeli, enjeksiyon yavaş ve eşit bir şekilde uygulanmalıdır. 5-19. günlerde, çift maruz kalan gruptaki fareler nikotin ve silikaya maruz bırakıldı. Sabah 08:00'de nikotin enjekte edilmesi, ardından saat 14:00'te silikon dioksitin burun damlası ve saat 20:00'de başka bir nikotin enjeksiyonu yapılması önerilir. Fareler üzerinde tekrarlanan kavramanın etkilerinden kaçınmak için iki nikotin enjeksiyonu 12 saat arayla yapılmalıdır.
Deri altı enjeksiyonları ve burun akıntısı yapmak çeşitli teknik zorluklar sunar. Deri altı enjeksiyonlar için fareler uygun kuvvetle kavranmalıdır. Boynun arkasındaki deri çok sıkı sıkışırsa, farenin hava yolu tıkanır ve hızla boğulmaya neden olur. Optimum güç için, boynun arkasındaki cilt, gözbebekleri hafifçe çıkıntı yapana kadar sıkıştırılmalıdır. Bu sırada, fare en düşük acıyı hisseder ve sorunsuz nefes alır. Ek olarak, nikotin enjeksiyonunu tüpten çekmek için havadan boşaltılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanılmalı ve ardından 0.1-0.2 mL daha hava verilmelidir. Enjekte etmeden önce, kabarcıklar hafifçe dışarı atılmalıdır. Enjeksiyonun hacminin küçük olması nedeniyle, iğne ucunun ucunda kalan nikotin yetersiz doza yol açabilir. Enjeksiyonun kilit kısımları iğneyi hızlı bir şekilde sokmak, nikotini yavaşça enjekte etmek ve iğneyi nazikçe çıkarmaktır. Burun akıntısı için, bu çalışmada, farelerin burun boşluğu derin anestezi altında tamamen açığa çıkarıldı, ardından bir silikon dioksit süspansiyonunun yavaş ve homojen bir şekilde damlatılması izledi. Öksürmeyi veya boğulmayı önlemek için silika maruziyetinden sonra göğüs boşluğuna hafifçe bastırmak da önemlidir.
Bu modelin belirli sınırlamaları vardır. Deneylerde kullanılan 1-5 μm silika partikülleri ortamdan toplanmamıştır ve saf silika partikülleridir. Buna karşılık, gerçek mesleki ortamlarda, işçiler sadece bir seramik fabrikasında veya bir kömür madeninde kömür ve silika tozu karışımı gibi silika parçacıklarına değil, çeşitli tehlikeli maddelere maruz kalabilirler. Düşük dozlar elde etmek için nazal damlatma silika kullandık ve işçilerin kronik maruziyetini simüle etmek için çoklu maruziyetleri tekrarladık. Çift maruziyetli fare modelinde, nikotin sigara dumanına maruz kalmaktan gelmese de, enjekte edilen nikotin doğrudan kan dolaşımına girer ve nikotinin silikoz sürecindeki rolünün daha odaklı bir şekilde araştırılmasına ve sigara dumanının diğer bileşenlerinin etkilerinden kaçınılmasına olanak tanır.
Silikoz üzerine yapılan bilimsel araştırmalar, silikanın hastalık gelişimindeki rolünü değerlendirmek için tipik olarak silikanın solunması veya bronşiyal perfüzyonu yoluyla tek faktörlü fare modellerini kullanmıştır. Alternatif bir yaklaşım, basit ve kolay olan ve tekrarlanan ve kronik silika maruziyet modellerinin oluşturulmasına izin veren silikon dioksitin nazal damlatılmasıdır13. İyi kurulmuş silikon dioksit burun damlası modeli, farelere minimum zarar verir ve çok faktörlü maruz kalan bir hayvan modeli oluşturmak için diğer faktörlerle birleştirilebilir. Ek olarak, farelerde nikotine maruz kalmanın ana yöntemleri arasında içme suyunda nikotin, deri altı nikotin enjeksiyonu, ozmotik mini pompalar yoluyla nikotin infüzyonu ve tütün dumanına maruz kalma yer alır14. Çift maruziyet modelinde kullanılan deri altı enjeksiyonu, nikotin dozajının ve zamanlamasının tam olarak ayarlanmasına izin vererek her fareye aynı dozun uygulanmasını sağlar.
Kısacası, silika maruziyeti ile kombinasyon halinde nikotinin hayvan modeli, gerçekçi bir kronik maruziyet modelini kopyalar ve bu model, nikotinin silikoz gelişiminde inflamasyon ve fibroz üzerindeki etkileri hakkında daha fazla araştırma için kullanılabilir. Ek olarak, bu model, birden fazla doz ve zaman dilimi ile çift maruziyetli bir hayvan modeli oluşturmak için bir temel görevi görür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Bu çalışma, Anhui Eyaleti Üniversite Sinerji İnovasyon Programı (GXXT-2021-077) ve Anhui Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Lisansüstü İnovasyon Fonu (2021CX2120) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
