تحسين نماذج ليبوفوسين والقياس الكمي لقدرة البلعمة في الجزء الخارجي في الثقافات الظهارية الصبغية للشبكية البشرية شديدة الاستقطاب

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج تراكم الليبوفوسين في الثقافات الظهارية الصبغية الشبكية البشرية شديدة التمايز والاستقطاب (RPE) ومقايسة البلعمة المحسنة للجزء الخارجي (OS) للكشف عن إجمالي سعة استهلاك / تدهور نظام التشغيل ل RPE. تتغلب هذه الطرق على قيود نماذج ليبوفوسين السابقة ومقايسات البلعمة الكلاسيكية لمطاردة النبض.

Abstract

تساهم البلعمة اليومية للأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية بواسطة ظهارة صبغة الشبكية (RPE) في تراكم صبغة الشيخوخة داخل الخلايا التي تسمى ليبوفوسين. سمية ليبوفوسين راسخة في مرض ستارغاردت ، وهو تنكس الشبكية الوراثي الأكثر شيوعا ، ولكنه أكثر إثارة للجدل في الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، وهو السبب الرئيسي للعمى الذي لا رجعة فيه في العالم المتقدم. كان تحديد سمية الليبوفوسين في البشر أمرا صعبا ، والنماذج الحيوانية ل Stargardt لها سمية محدودة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نماذج في المختبر تحاكي RPE البشري في الجسم الحي لفهم توليد الليبوفوسين وإزالته وسميته بشكل أفضل. كانت غالبية نماذج ليبوفوسين زراعة الخلايا حتى الآن في خطوط الخلايا أو تضمنت تغذية RPE بمكون واحد من خليط الليبوفوسين المعقد بدلا من شظايا / أطراف الجزء الخارجي للمستقبل الضوئي بأكمله ، مما يولد نموذجا أكثر اكتمالا وفسيولوجيا ليبوفوسين. الموصوف هنا هو طريقة للحث على تراكم المواد الشبيهة بالليبوفوسين (تسمى مادة التألق الذاتي غير القابلة للهضم ، أو UAM) في RPE البشري الأولي قبل الولادة (hfRPE) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) المشتقة من RPE. تراكمت UAM في الثقافات عن طريق التغذية المتكررة لشظايا OS المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية التي تمتصها RPE عن طريق البلعمة. كما تمت مناقشة الطرق الرئيسية التي يقترب بها UAM ويختلف عن lipofuscin في الجسم الحي . يرافق هذا النموذج من التراكم الشبيه بالليبوفوسين ، يتم تقديم طرق التصوير لتمييز طيف التألق الذاتي الواسع لحبيبات UAM من تلطيخ الأجسام المضادة المتزامن. أخيرا ، لتقييم تأثير UAM على قدرة البلعمة RPE ، تم تقديم طريقة جديدة لتحديد كمية امتصاص الجزء الخارجي / الأطراف وتفكيكها. تتغلب هذه الطريقة ، التي يطلق عليها “السعة الاستهلاكية الكلية” ، على التفسيرات الخاطئة المحتملة لقدرة البلعمة RPE المتأصلة في فحوصات “مطاردة النبض” الكلاسيكية للجزء الخارجي. يمكن استخدام النماذج والتقنيات المقدمة هنا لدراسة توليد الليبوفوسين ومسارات الإزالة والسمية المفترضة.

Introduction

توفر ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) دعما حاسما للمستقبلات الضوئية العلوية ، بما في ذلك الامتصاص اليومي وتدهور أطراف أو شظايا الجزء الخارجي للمستقبلات الضوئية (خلال هذا البروتوكول ، يشير اختصار OS إلى نصائح أو شظايا نظام التشغيل بدلا من الأجزاء الخارجية بأكملها). هذا الامتصاص اليومي في RPE بعد الانقسام يؤدي في النهاية إلى زيادة التحميل على قدرة البلعمة ويؤدي إلى تراكم مادة غير قابلة للهضم ، ذاتية الفلورسنت داخل الخلايا ، تسمى ليبوفوسين. ومن المثير للاهتمام ، أن العديد من الدراسات أظهرت أيضا أن RPE lipofuscin يمكن أن يتراكم بدون البلعمة^{OS 1,2}. يحتوي Lipofuscin على العديد من المكونات ، بما في ذلك المضافات المتشابكة المشتقة من الرتينوئيدات ذات الدورة البصرية ، ويمكن أن تشغل ما يقرب من 20٪ من حجم خلايا RPE لمن تزيد أعمارهم عن 80³.

ما إذا كان ليبوفوسين ساما قد نوقش بشدة. مرض ستارغاردت هو تنكس صبغي جسدي متنحي للمستقبلات الضوئية و RPE حيث تؤدي طفرة في ABCA4 إلى معالجة غير صحيحة لراتينويدات الدورة البصرية الموجودة داخل الأجزاء الخارجية للمستقبلات الضوئية. تؤدي معالجة الريتينويد غير الصحيحة إلى ربط متقاطع شاذ وتشكيل أنواع ثنائي الريتينويد ، بما في ذلك ثنائي الريتينويد N-retinylidene-N-retinylethanolamine (A2E). أظهرت الدراسات آليات متعددة لسمية A2E ^4,5. يساهم Lipofuscin في إشارات التألق الذاتي لقاع العين أثناء التصوير السريري ، ويظهر كل من مرضى Stargardt والنماذج الحيوانية زيادة في التألق الذاتي لقاع العين قبل تنكس الشبكية ، مما يشير إلى وجود علاقة بين مستويات الليبوفوسين والسمية ^6,7. ومع ذلك ، مع تقدم العمر ، يتراكم الليبوفوسين في جميع البشر دون التسبب في تنكس RPE. علاوة على ذلك ، في التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، حيث يحدث تنكس RPE فقط في المرضى المسنين ، فإن أولئك الذين يعانون من أشكال مبكرة ومتوسطة من المرض لديهم إشارات تألق ذاتي قاع العين أقل من البشر غير المصابين بالعمر⁸. تم التحقق من هذه النتائج السريرية على المستوى النسيجي وكذلك ^9,10.

كما تركت النماذج الحيوانية لتراكم الليبوفوسين RPE بعض الغموض حول سمية الليبوفوسين. لا يعرض ماوس خروج المغلوب ABCA4 تنكس الشبكية على خلفية مصطبغة ، بينما يفعل ذلك على خلفية ألبينو أو عند تعرضه للضوء الأزرق^11,12. علاوة على ذلك ، من المحتمل أن تختلف سمية ليبوفوسين المشتقة عن طريق خروج المغلوب ABCA4 عن تراكم الليبوفوسين ببطء والذي يحدث مع الشيخوخة الطبيعية ، كما هو موضح في AMD¹³.

توفر النماذج المختبرية لتراكم الليبوفوسين بديلا لدراسة آثار تراكم الليبوفوسين على صحة RPE. تسمح هذه النماذج بمعالجة مكونات الليبوفوسين ، من تغذية مكونات الريتينويد المفردة إلى تغذية نظام التشغيل ، وتسمح بالدراسة في RPE البشري بدلا من الحيواني. في العقدين الماضيين ، تم تطوير طرق متعددة لنمذجة RPE lipofuscin في الثقافة. جنبا إلى جنب مع مجموعات أخرى ، قامت مجموعة الدكتور بولتون بتغذية نظام التشغيل البقري يوميا لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر عند المرور من 4 إلى 7 خلايا RPE أولية بشرية من متبرعين تتراوح أعمارهم بين 4 و 85 عاما¹⁴ عاما. بدلا من ذلك ، أدى تثبيط الالتهام الذاتي أيضا إلى تراكم الليبوفوسين في الممرات من 3 إلى 7 ثقافات RPE البشرية الأولية¹⁵. ومع ذلك، فإن تثبيط الليزوزومات شبه المميتة في مزارع RPE البشرية الأولية قبل الولادة (hfRPE) شديدة التمايز في الممر 1 فشلت في تحفيز الليبوفوسين، حتى مع الإضافة المتكررة لنظام التشغيل على أساس يومي¹⁶.

كنهج أكثر اختزالا ، قام آخرون بتغذية مكونات ليبوفوسين مفردة للثقافات ، وخاصة ثنائي الريتينويد A2E ^4,17. هذه الدراسات قيمة من حيث أنها تحدد الآليات المباشرة المحتملة للسمية لمكونات الليبوفوسين الفردية ، والتي تنطوي ، على سبيل المثال ، على الكوليسترول الليزوزومي وتوازن السيراميد¹⁸. في الوقت نفسه ، هناك جدل حول سمية A2E¹⁹ ، وإطعامه مباشرة إلى الخلايا يتحايل على المسار النموذجي لتراكم الليبوفوسين ، والذي ينطوي على البلعمة من مستقبلات الضوء OS. في محاولة لتوصيل جميع مكونات الليبوفوسين إلى ثقافات RPE ، قام بولتون ومارشال بتنقية الليبوفوسين من عيون الإنسان وتغذيته بالممر 4 إلى 7 ثقافات RPE الأولية البشرية المستمدة من كل من المتبرعين البشريين الجنين وكبار السن²⁰. على الرغم من أن هذه الطريقة مبتكرة ، إلا أنها تمثل مصدرا محدودا للليبوفوسين للتجارب المتكررة.

في حين أن التغذية المتكررة لثقافات نظام التشغيل إلى RPE تنتج ليبوفوسين في العديد من الأنظمة ، إلا أنها تفشل في القيام بذلك في ثقافات RPE الأولية شديدة التمايز¹⁶. يحفز نظام التشغيل المؤكسد الضوئي تفاعلات الربط المتقاطع مثل تكوين ثنائي الريتينويد الذي يحدث بشكل طبيعي أثناء تكوين ليبوفوسين في الجسم الحي. يمكن أن يؤدي ذلك إلى تسريع تكوين حبيبات تشبه الليبوفوسين في أنظمة زراعة RPE ، حتى تلك شديدة التمايز ومقاومة لتراكم الليبوفوسين¹⁶. هنا ، يتم تقديم طريقة للحث على تراكم الحبيبات الشبيهة بالليبوفوسين في hfRPE شديد التمايز و iPSC-RPE البشري ، وتعديلها من بروتوكول Wihlmark المنشور²¹. تتميز هذه الطريقة بتحفيز حبيبات شبيهة بالليبوفوسين تستخدم نفس المصدر (مستقبل ضوئي OS) والمسار (امتصاص OS البلعمي) كما يحدث في تكوين الدهون في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يتم إجراؤه على ثقافات RPE البشرية المتباينة للغاية والتحقق من صحتها في دراسات متعددة لتكرار RPE البشري في الجسم الحي²²،^23،24. تسمى هذه الحبيبات الشبيهة بالليبوفوسين بالمواد الفلورية الذاتية غير القابلة للهضم (UAM) ، وتوفر بيانات ومناقشة في هذا البروتوكول تقارن UAM بالدهون في الجسم الحي. جنبا إلى جنب مع طرق لبناء وتقييم الثقافات المحملة ب UAM في RPE البشري شديد التمايز ، يتم أيضا تقديم طريقة محدثة لتقييم البلعمة RPE OS. تم إدخال العديد من طرق مطاردة النبض الممتازة لقياس البلعمة OS ، بما في ذلك النشاف الغربي ، والكيمياء الخلوية المناعية ، و FACS²⁵،^26،27. ومع ذلك ، في وقت مبكر من مطاردة نبض نظام التشغيل ، يمكن الخلط بين الظروف التي تؤدي إلى ضعف امتصاص نظام التشغيل مع الظروف التي تعزز التدهور السريع لنظام التشغيل الداخلي. تقيس الطريقة المعروضة هنا إجمالي كمية نظام التشغيل الذي تم إدخاله / تدهوره بالكامل بواسطة RPE (“إجمالي السعة الاستهلاكية”) ، مما يساعد على إزالة هذا الغموض. ومن المتوقع أن يتم استخدام رؤى حول سمية ليبوفوسين باستخدام هذه البروتوكولات، بما في ذلك التأثيرات على معدلات البلعمة باستخدام طريقة “السعة الاستهلاكية الكلية”، لإلقاء الضوء على سمية ليبوفوسين في الجسم الحي.

Protocol

تمت مراجعة البروتوكول الحالي الذي يتضمن اقتناء واستخدام الأنسجة البشرية والموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة ميشيغان (HUM00105486). 1. إعداد نصائح وشظايا الجزء الخارجي المؤكسد بالصور ملاحظة: تم شراء شبكية العين البقري المتكيفة مع الظلام وشحنها على ا…

Representative Results

يوضح الشكل 1Ai إعداد الأكسدة الضوئية لنظام التشغيل. تسمح الشرائح المطلية بالبولي تترافلورو إيثيلين بتحميل حجم كبير من نظام التشغيل في المحلول لكل مستطيل مفتوح دون الانتشار عبر بقية الشريحة. يتم احتواء الشريحة مع نظام التشغيل داخل طبق بتري معقم مع الغطاء ، ويتم وضع مصباح ال?…

Discussion

بينما تمت دراسة RPE lipofuscin لعقود من الزمن ، فإن سميته تناقش²،⁹،^16،42. بالنظر إلى الغموض حول سمية الليبوفوسين من النماذج الحيوانية¹¹ ، فإن النماذج في المختبر التي تستخدم RPE البشري قيمة. تم وصف مجموعة من نماذج …

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000