Modelos mejorados de lipofuscina y cuantificación de la capacidad de fagocitosis del segmento externo en cultivos epiteliales de pigmento retiniano humano altamente polarizados

Summary

Este protocolo describe un modelo de acumulación de lipofuscina en cultivos epiteliales pigmentarios (EPR) humanos altamente diferenciados y polarizados y un ensayo de fagocitosis de segmento externo (SG) mejorado para detectar la capacidad total de consumo/degradación de SG del EPR. Estos métodos superan las limitaciones de los modelos anteriores de lipofuscina y los ensayos clásicos de fagocitosis del segmento externo de persecución de pulsos.

Abstract

La fagocitosis diaria de los segmentos externos de los fotorreceptores por el epitelio pigmentario de la retina (EPR) contribuye a la acumulación de un pigmento de envejecimiento intracelular denominado lipofuscina. La toxicidad de la lipofuscina está bien establecida en la enfermedad de Stargardt, la degeneración retiniana hereditaria más común, pero es más controvertida en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado. Determinar la toxicidad de la lipofuscina en humanos ha sido difícil, y los modelos animales de Stargardt tienen una toxicidad limitada. Por lo tanto, se necesitan modelos in vitro que imiten el EPR humano in vivo para comprender mejor la generación, eliminación y toxicidad de la lipofuscina. La mayoría de los modelos de lipofuscina de cultivo celular hasta la fecha han estado en líneas celulares o han implicado alimentar al EPR con un solo componente de la mezcla compleja de lipofuscina en lugar de fragmentos/puntas de todo el segmento externo de los fotorreceptores, lo que genera un modelo de lipofuscina más completo y fisiológico. Aquí se describe un método para inducir la acumulación de material similar a la lipofuscina (denominado material de autofluorescencia no digerible, o UAM) en RPE prenatal humano primario altamente diferenciado (hfRPE) y RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). La UAM se acumuló en cultivos mediante la alimentación repetida de fragmentos de SG tratados con luz ultravioleta absorbidos por el EPR a través de fagocitosis. También se discuten las formas clave en que UAM se aproxima y difiere de la lipofuscina in vivo . Acompañando a este modelo de acumulación similar a la lipofuscina, se introducen métodos de imagen para distinguir el amplio espectro de autofluorescencia de los gránulos de UAM de la tinción concurrente de anticuerpos. Finalmente, para evaluar el impacto de UAM en la capacidad de fagocitosis del EPR, se ha introducido un nuevo método para cuantificar la captación y descomposición de fragmentos / puntas del segmento externo. Denominado “capacidad consuntiva total”, este método supera posibles interpretaciones erróneas de la capacidad de fagocitosis del EPR inherente a los ensayos clásicos de “persecución de pulsos” del segmento externo. Los modelos y técnicas introducidos aquí se pueden utilizar para estudiar las vías de generación y eliminación de lipofuscina y la toxicidad putativa.

Introduction

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) proporciona un soporte crítico para los fotorreceptores suprayacentes, incluida la absorción diaria y la degradación de las puntas o fragmentos del segmento externo de los fotorreceptores (a lo largo de este protocolo, la abreviatura OS significa puntas o fragmentos del sistema operativo en lugar de segmentos externos completos). Esta absorción diaria en el EPR postmitótico eventualmente sobrecarga la capacidad fagolisosomal y conduce a la acumulación de material intracelular autofluorescente no digerible, denominado lipofuscina. Curiosamente, varios estudios también han demostrado que la lipofuscina RPE puede acumularse sin fagocitosis OS ^1,2. La lipofuscina tiene muchos componentes, incluidos los aductos reticulados derivados de los retinoides del ciclo visual, y puede ocupar casi el 20% del volumen de células del EPR para los mayores de 80^años.

Si la lipofuscina es tóxica ha sido objeto de acalorados debates. La enfermedad de Stargardt es una degeneración autosómica recesiva de los fotorreceptores y el EPR en la que una mutación en ABCA4 desencadena un procesamiento inadecuado de los retinoides del ciclo visual contenidos dentro de los segmentos externos de los fotorreceptores. El procesamiento inadecuado de retinoides conduce a la reticulación aberrante y la formación de especies de bis-retinoides, incluyendo el bis-retinoide N-retinilideno-N-retiniletanolamina (A2E). Los estudios han demostrado múltiples mecanismos para la toxicidad de A2E ^4,5. La lipofuscina contribuye a las señales de autofluorescencia del fondo de ojo durante la imagen clínica, y tanto los pacientes de Stargardt como los modelos animales muestran un aumento de la autofluorescencia del fondo de ojo antes de la degeneración retiniana, lo que sugiere una correlación entre los niveles de lipofuscina y la toxicidad ^6,7. Sin embargo, con la edad, la lipofuscina se acumula en todos los seres humanos sin desencadenar una degeneración del EPR. Además, en la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), donde la degeneración del EPR ocurre solo en pacientes de edad avanzada, aquellos con formas tempranas e intermedias de la enfermedad tienen menos señales de autofluorescencia del fondo de ojo que los humanos no enfermos de la misma edad⁸. Estos hallazgos clínicos han sido verificados también a nivel histológico ^9,10.

Los modelos animales de acumulación de lipofuscina RPE también han dejado cierta ambigüedad sobre la toxicidad de la lipofuscina. El ratón knockout ABCA4 no muestra degeneración retiniana sobre un fondo pigmentado, mientras que sí lo hace sobre un fondo albino o cuando se expone a la luz azul^11,12. Además, la toxicidad de la lipofuscina derivada a través del knockout ABCA4 probablemente difiere de la lipofuscina de acumulación más lenta que ocurre con el envejecimiento natural, como se ve en AMD¹³.

Los modelos in vitro de acumulación de lipofuscina proporcionan una alternativa al estudio de los efectos de la acumulación de lipofuscina en la salud del EPR. Tales modelos permiten manipular los componentes de la lipofuscina, desde la alimentación de componentes retinoides individuales hasta la alimentación de SG, y permiten el estudio en RPE humano en lugar de animal. En las últimas dos décadas, se han desarrollado múltiples métodos para modelar la lipofuscina RPE en cultivo. Junto con otros grupos, el grupo del Dr. Boulton alimentó la SG bovina diariamente durante un máximo de tres meses al pasar de 4 a 7 células RPE primarias humanas de donantes de 4 a 85 años de edad¹⁴. Alternativamente, la inhibición de la autofagia también ha llevado a la acumulación de lipofuscina en los pasajes 3 a 7 cultivos primarios de EPR humanos¹⁵. Sin embargo, la inhibición lisosomal subletal en cultivos de EPR prenatal humano primario (eRPH) altamente diferenciados, pasaje 1, no logró inducir lipofuscina, incluso con la adición repetida de SG^{diariamente 16}.

Como un enfoque más reduccionista, otros han alimentado componentes individuales de lipofuscina a cultivos, especialmente el bis-retinoide A2E ^4,17. Tales estudios son valiosos porque definen posibles mecanismos directos de toxicidad para componentes individuales de lipofuscina, implicando, por ejemplo, el colesterol lisosomal y la homeostasis de ceramida¹⁸. Al mismo tiempo, existe un debate sobre la toxicidad de A2E¹⁹, y alimentarlo directamente a las células elude la vía típica para la acumulación de lipofuscina, que implica la fagocitosis de la SG fotorreceptora. En un intento de administrar todos los componentes de la lipofuscina a los cultivos de EPR, Boulton y Marshall purificaron la lipofuscina de los ojos humanos y la alimentaron con el paso de 4 a 7 cultivos primarios de EPR humanos derivados de donantes humanos fetales y ancianos²⁰. Aunque innovador, este método representa una fuente limitada de lipofuscina para experimentos repetidos.

Mientras que la alimentación repetida de SG a cultivos de EPR produce lipofuscina en muchos sistemas, no lo hace en cultivos primarios de EPR altamente diferenciados¹⁶. La SG fotooxidante induce reacciones de reticulación como la formación de bis-retinoides que ocurre naturalmente durante la formación de lipofuscina in vivo. Esto puede acelerar la formación de gránulos similares a la lipofuscina en sistemas de cultivo de EPR, incluso aquellos que son altamente diferenciados y resistentes a la acumulación de lipofuscina¹⁶. Aquí, se introduce un método para inducir la acumulación de gránulos similares a la lipofuscina en hfRPE altamente diferenciado y iPSC-RPE humano, modificado del protocolo²¹ publicado por Wihlmark. Este método tiene la ventaja de inducir gránulos similares a la lipofuscina empleando la misma fuente (SG fotorreceptora) y vía (captación de SG fagolisomal) que ocurre para la lipofuscinogénesis in vivo. Además, se realiza en cultivos humanos de EPR altamente diferenciados y validados en múltiples estudios para replicar el EPR humano in vivo^22,23,24. Estos gránulos similares a la lipofuscina se denominan material autofluorescente no digerible (UAM), y proporcionan datos y discusión en este protocolo que compara UAM con lipofuscina in vivo. Junto con los métodos para construir y evaluar cultivos cargados de UAM en RPE humano altamente diferenciado, también se introduce un método actualizado para evaluar la fagocitosis de SG RPE. Se han introducido múltiples métodos excelentes de persecución de pulsos para cuantificar la fagocitosis de SG, incluyendo Western blotting, inmunocitoquímica y FACS^25,26,27. Sin embargo, al principio de la persecución del pulso del sistema operativo, las condiciones que conducen a una absorción deficiente del sistema operativo pueden combinarse con las condiciones que promueven la rápida degradación del sistema operativo internalizado. El método presentado aquí mide la cantidad total de sistema operativo introducido que es completamente consumido / degradado por el RPE (“Capacidad consuntiva total”), ayudando a eliminar esta ambigüedad. Se anticipa que los conocimientos sobre la toxicidad de la lipofuscina utilizando estos protocolos, incluidos los efectos sobre las tasas de fagocitosis de SG utilizando el método de “Capacidad consuntiva total”, se utilizarán para arrojar luz sobre la toxicidad de la lipofuscina in vivo.

Protocol

El presente protocolo que implica la adquisición y el uso de tejido humano fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Michigan (HUM00105486). 1. Preparación de puntas y fragmentos de segmentos externos fotooxidados NOTA: Las retinas bovinas adaptadas a la oscuridad se compraron y se enviaron en hielo (consulte la Tabla de materiales). A partir de estas retinas, la SG fue purificada siguiendo un protocolo pre…

Representative Results

La configuración para la fotooxidación de la SG se demuestra en la Figura 1Ai. Los portaobjetos recubiertos de politetrafluoroetileno permiten cargar un gran volumen de OS en solución por rectángulo abierto sin extenderse por el resto del portaobjetos. El portaobjetos con OS está contenido dentro de una placa de Petri estéril con la tapa apagada, y se coloca una lámpara UV sobre el portaobjetos como se muestra en la Figura 1Aii. Alternativamente, la diapo…

Discussion

Si bien la lipofuscina RPE se ha estudiado durante décadas, su toxicidad se debate 2,9,16,42. Dada la ambigüedad sobre la toxicidad de la lipofuscina de modelos animales¹¹, los modelos in vitro que utilizan EPR humano son valiosos. Se ha descrito una gama de modelos de acumulación de lipofuscina in vitro, pero ninguno ha utilizado tanto la alimentaci…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000