מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

Summary

פרוטוקול זה מתאר מודל הצטברות ליפופוסצין בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושי (RPE) מובחנות ומקוטבות מאוד ובדיקת פגוציטוזה משופרת של סגמנט חיצוני (OS) כדי לזהות את יכולת הצריכה/השפלה הכוללת של מערכת ההפעלה של RPE. שיטות אלה מתגברות על המגבלות של מודלים קודמים של ליפופוסצין ומבחני פאגוציטוזה קלאסיים של הקטע החיצוני של מרדף הדופק.

Abstract

הפאגוציטוזה היומית של המקטעים החיצוניים של קולטני האור על ידי אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תורמת להצטברות פיגמנט הזדקנות תוך תאי המכונה ליפופוסצין. הרעילות של ליפופוסצין מבוססת היטב במחלת סטארגארדט, ניוון הרשתית התורשתי הנפוץ ביותר, אך שנויה יותר במחלוקת בניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD), הגורם המוביל לעיוורון בלתי הפיך בעולם המפותח. קביעת רעילות ליפופוסצין בבני אדם הייתה קשה, ולמודלים של בעלי חיים של סטארגארדט יש רעילות מוגבלת. לכן, מודלים במבחנה המחקים RPE in vivo אנושי נדרשים כדי להבין טוב יותר את יצירת ליפופוסצין, פינוי ורעילות. רוב המודלים של ליפופוסצין בתרבית תאים עד כה היו בקווי תאים או כללו הזנת RPE ברכיב יחיד של תערובת ליפופוסצין המורכבת ולא במקטעים/קצוות של כל המקטע החיצוני של קולטני האור, מה שיוצר מודל ליפופוסצין שלם ופיזיולוגי יותר. מתוארת כאן שיטה לגרימת הצטברות של חומר דמוי ליפופוסצין (המכונה חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, או UAM) ב- RPE ראשוני טרום לידתי אנושי מובחן מאוד (hfRPE) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הנגזר RPE. UAM הצטבר בתרביות על ידי הזנה חוזרת ונשנית של מקטעי מערכת הפעלה שטופלו באור אולטרה סגול שנקלטו על ידי RPE באמצעות פגוציטוזה. הדרכים העיקריות שבהן UAM מקורב ושונה מ lipofuscin in vivo נדונים גם. בליווי מודל זה של הצטברות דמוית ליפופוסצין, מוצגות שיטות הדמיה להבחנה בין ספקטרום אוטופלואורסצנטי רחב של גרגרי UAM לבין צביעת נוגדנים בו-זמנית. לבסוף, כדי להעריך את ההשפעה של UAM על יכולת הפאגוציטוזה של RPE, הוצגה שיטה חדשה לכימות ספיגה ופירוק של מקטע חיצוני. שיטה זו, המכונה “Total Consumptive Capacity”, מתגברת על פרשנויות שגויות אפשריות של יכולת פגוציטוזה RPE הטבועה במבחני “מרדף דופק” קלאסיים של המקטע החיצוני. המודלים והטכניקות שהוצגו כאן יכולים לשמש לחקר מסלולי ייצור ופינוי ליפופוסצין ורעילות משוערת.

Introduction

אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מספק תמיכה קריטית עבור photoreceptors over, כולל ספיגה יומית והשפלה של קצוות או מקטעים של מקטע חיצוני photoreceptor (לאורך פרוטוקול זה, מערכת ההפעלה קיצור מייצג טיפים או מקטעים של מערכת ההפעלה ולא מקטעים חיצוניים שלמים). ספיגה יומית זו של RPE פוסט-מיטוטי בסופו של דבר מעמיסה על קיבולת פגוליזומלית ומובילה להצטברות של חומר תוך-תאי אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול, המכונה ליפופוסצין. באופן מעניין, מספר מחקרים הוכיחו גם כי RPE lipofuscin יכול להצטבר ללא מערכת ההפעלה phagocytosis ^1,2. Lipofuscin יש רכיבים רבים, כולל adducts cross-linked נגזר רטינואידים מחזור הראייה, והוא יכול לתפוס כמעט 20% מנפח התא RPE עבור אלה מעל גיל 80³.

השאלה אם ליפופוסצין רעיל נדונה בלהט. מחלת סטארגרדט היא ניוון אוטוזומלי רצסיבי של הפוטורצפטורים וה-RPE שבו מוטציה ב-ABCA4 גורמת לעיבוד לא תקין של רטינואידים במחזור הראייה הכלולים במקטעים החיצוניים של קולטני האור. עיבוד רטינואיד לא תקין מוביל לקישור צולב חריג ולהיווצרות של מיני ביס-רטינואידים, כולל ביס-רטינואיד N-רטינילidene-N-רטינילאתנולאמין (A2E). מחקרים הדגימו מנגנונים מרובים לרעילות A2E ^4,5. ליפופוסצין תורם לאותות אוטופלואורסצנטיים של פונדוס במהלך הדמיה קלינית, וגם המטופלים של סטארגרדט וגם מודלים של בעלי חיים מראים עלייה בפונדוס אוטופלואורסצנטיות לפני ניוון הרשתית, מה שמרמז על מתאם בין רמות ליפופוסצין ורעילות ^6,7. עם זאת, עם הגיל, lipofuscin מצטבר בכל בני האדם מבלי לעורר ניוון RPE. יתר על כן, בניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), שבו ניוון RPE מתרחש רק בחולים קשישים, אלה עם צורות מוקדמות ובינוניות של המחלה יש פחות אותות אוטופלואורסצנטיים פונדוס מאשר בני אדם שאינם חולים תואמי גיל⁸. ממצאים קליניים אלה אומתו גם ברמה ההיסטולוגית ^9,10.

מודלים של בעלי חיים של הצטברות ליפופוסצין RPE השאירו גם עמימות מסוימת לגבי רעילות ליפופוסצין. עכבר הנוקאאוט ABCA4 אינו מציג ניוון רשתית על רקע פיגמנט, בעוד שהוא עושה זאת על רקע לבקנים או כאשר הוא נחשף לאור כחול^11,12. יתר על כן, הרעילות של ליפופוסצין שמקורה בנוקאאוט ABCA4 ככל הנראה שונה מהליפופוסצין המצטבר לאט יותר המתרחש עם ההזדקנות הטבעית, כפי שניתן לראות ב- AMD¹³.

מודלים במבחנה של הצטברות ליפופוסצין מספקים חלופה לחקר ההשפעות של הצטברות ליפופוסצין על בריאות RPE. מודלים כאלה מאפשרים מניפולציה של רכיבי ליפופוסצין, החל מהזנת רכיבי רטינואיד בודדים ועד להאכלת מערכת ההפעלה, ומאפשרים מחקר ב-RPE של בני אדם ולא של בעלי חיים. בשני העשורים האחרונים פותחו שיטות רבות למדל ליפופוסצין RPE בתרבית. יחד עם קבוצות אחרות, הקבוצה של ד”ר בולטון האכילה את מערכת ההפעלה של בקר מדי יום במשך עד שלושה חודשים במעבר 4 עד 7 תאי RPE ראשוניים אנושיים מתורמים בגילאי 4 עד 85 בגילאי¹⁴. לחלופין, עיכוב של אוטופגיה הוביל גם להצטברות ליפופוסצין במעברים 3 עד 7 תרביות RPE אנושיות ראשוניות¹⁵. עם זאת, עיכוב ליזוזומלי תת-קטלני בתרביות RPE ראשוניות (hfRPE) אנושיות מובחנות מאוד, מעבר 1, לא הצליח לגרום לליפופוצין, אפילו עם תוספת חוזרת ונשנית של מערכת ההפעלה על בסיס יומי¹⁶.

כגישה רדוקציוניסטית יותר, אחרים הזינו רכיבי ליפופוסצין בודדים לתרביות, במיוחד ביס-רטינואיד A2E ^4,17. מחקרים כאלה הם בעלי ערך בכך שהם מגדירים מנגנונים ישירים פוטנציאליים של רעילות עבור רכיבי ליפופוסצין בודדים, ומסבכים, למשל, כולסטרול ליזוזומלי והומאוסטזיס סרמיד¹⁸. יחד עם זאת, יש ויכוח על הרעילות של A2E¹⁹, והאכלתו ישירות לתאים עוקפת את המסלול האופייני להצטברות ליפופוסצין, הכוללת פגוציטוזה של מערכת ההפעלה photoreceptor. בניסיון להעביר את כל מרכיבי הליפופוסצין לתרביות RPE, בולטון ומרשל טיהרו ליפופוסצין מעיניים אנושיות והזינו אותו למעבר 4 עד 7 תרביות RPE ראשוניות אנושיות שמקורן בתורמים אנושיים עובריים וקשישים²⁰. למרות היותה חדשנית, שיטה זו מייצגת מקור ליפופוסצין מוגבל לניסויים חוזרים.

בעוד הזנות חוזרות ונשנות של מערכת ההפעלה לתרביות RPE מייצרות ליפופוסצין במערכות רבות, היא אינה מצליחה לעשות זאת בתרביות RPE ראשוניות מובחנות מאוד¹⁶. מערכת הפעלה לחמצון תמונות גורמת לתגובות קישור צולבות כמו היווצרות ביס-רטינואיד המתרחשת באופן טבעי במהלך היווצרות ליפופוסצין in vivo. זה יכול להאיץ היווצרות גרגירים דמויי ליפופוצין במערכות תרבית RPE, אפילו אלה שהן מאוד מובחנות ועמידות בפני הצטברות ליפופוסצין¹⁶. כאן מוצגת שיטה להשראת הצטברות גרגירים דמויי ליפופוסצין ב-hfRPE מובחן מאוד וב-iPSC-RPE אנושי, ששונתה מפרוטוקול²¹ שפורסם על ידי Wihlmark. לשיטה זו יש את היתרון של גרגירים דמויי ליפופוצין המשתמשים באותו מקור (photoreceptor OS) ומסלול (ספיגת מערכת הפעלה פגוליזומלית) כפי שקורה עבור lipofuscinogenesis in vivo. יתר על כן, זה נעשה על תרבויות RPE אנושיות כי הם מאוד מובחנים ומתוקפים במחקרים מרובים כדי לשכפל RPE אנושי in vivo^22,23,24. גרגירים דמויי ליפופוסצין אלה מכונים חומר אוטופלואורסצנטי בלתי ניתן לעיכול (UAM), והם מספקים נתונים ודיונים בפרוטוקול זה המשווה בין UAM ל- in vivo lipofuscin. יחד עם שיטות לבנייה והערכה של תרבויות עמוסות UAM ב- RPE אנושי מובחן מאוד, מוצגת גם שיטה מעודכנת להערכת פגוציטוזה של מערכת ההפעלה RPE. הוצגו מספר שיטות מצוינות לכימות פגוציטוזה של מערכת ההפעלה, כולל כתם מערבי, אימונוציטוכימיה ו-FACS^25,26,27. עם זאת, בשלב מוקדם של מרדף הדופק של מערכת ההפעלה, תנאים שמובילים לקליטה לקויה של מערכת ההפעלה יכולים להיות מבולבלים עם תנאים המקדמים השפלה מהירה של מערכת ההפעלה המופנמת. השיטה המוצגת כאן מודדת את הכמות הכוללת של מערכת ההפעלה שהוצגה שנצרכת/מתפרקת במלואה על ידי RPE (“Total Consumptive Capacity”), ובכך מסייעת בביטול עמימות זו. צפוי כי תובנות לגבי רעילות ליפופוסצין המשתמשות בפרוטוקולים אלה, כולל השפעות על שיעורי הפאגוציטוזה של מערכת ההפעלה תוך שימוש בשיטת “Total Consumptive Capacity”, ישמשו כדי לשפוך אור על הרעילות של lipofuscin in vivo.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי הכולל רכישה ושימוש ברקמה אנושית נבדק ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת מישיגן (HUM00105486). 1. הכנת קצוות ושברי מקטע חיצוני מחומצן הערה: רשתיות בקר כהות נרכשו ונשלחו על קרח (ראה טבלת חומרים). מרשתיות אלה, מערכת ההפעלה טוהרה ב?…

Representative Results

ההגדרה לחמצון תמונות של מערכת ההפעלה מודגמת באיור 1Ai. השקופיות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן מאפשרות טעינה של נפח גדול של מערכת הפעלה בתמיסה לכל מלבן פתוח מבלי להתפשט על פני שאר השקופית. השקופית עם מערכת ההפעלה נמצאת בתוך צלחת פטרי סטרילית כשהמכסה כבוי, ומנורת UV ממוקמת מעל …

Discussion

בעוד RPE lipofuscin נחקר במשך עשרות שנים, רעילותו שנויה במחלוקת 2,9,16,42. בהינתן עמימות לגבי הרעילות של ליפופוסצין ממודלים של בעלי חיים¹¹, מודלים במבחנה המשתמשים ב– RPE אנושי הם בעלי ערך. מגוון מודלים של הצטברות לי…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000