Amélioration des modèles de lipofuscine et quantification de la capacité de phagocytose du segment externe dans des cultures épithéliales de pigments rétiniens humains hautement polarisés

Summary

Ce protocole décrit un modèle d’accumulation de lipofuscine dans des cultures épithéliales de pigment rétinien humain (EPR) hautement différenciées et polarisées et un test de phagocytose du segment externe (SG) amélioré pour détecter la capacité totale de consommation/dégradation de la SG de l’EPR. Ces méthodes surmontent les limites des modèles précédents de lipofuscine et des tests classiques de phagocytose du segment externe par impulsions.

Abstract

La phagocytose quotidienne des segments externes du photorécepteur par l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) contribue à l’accumulation d’un pigment de vieillissement intracellulaire appelé lipofuscine. La toxicité de la lipofuscine est bien établie dans la maladie de Stargardt, la dégénérescence rétinienne héréditaire la plus courante, mais est plus controversée dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la principale cause de cécité irréversible dans le monde développé. Déterminer la toxicité de la lipofuscine chez l’homme a été difficile, et les modèles animaux de Stargardt ont une toxicité limitée. Ainsi, des modèles in vitro qui imitent l’EPR humain in vivo sont nécessaires pour mieux comprendre la génération, la clairance et la toxicité de la lipofuscine. La majorité des modèles de lipofuscine de culture cellulaire à ce jour ont été dans des lignées cellulaires ou ont impliqué l’alimentation en EPR d’un seul composant du mélange complexe de lipofuscine plutôt que de fragments / pointes de l’ensemble du segment externe du photorécepteur, ce qui génère un modèle lipofuscine plus complet et physiologique. La méthode décrite ici est une méthode pour induire l’accumulation de matériel de type lipofuscine (appelé matériau d’autofluorescence non digestible, ou UAM) dans l’EPR prénatal primaire humain hautement différencié (hfRPE) et l’EPR induite dérivée de cellules souches pluripotentes (CSPi). L’UAM s’est accumulée dans les cultures par des alimentations répétées de fragments de SG traités à la lumière ultraviolette absorbés par l’EPR par phagocytose. Les principales façons dont UAM se rapproche et diffère de la lipofuscine in vivo sont également discutées. Parallèlement à ce modèle d’accumulation de type lipofuscine, des méthodes d’imagerie permettant de distinguer le large spectre d’autofluorescence des granules UAM de la coloration simultanée des anticorps sont introduites. Enfin, pour évaluer l’impact de la MNA sur la capacité de phagocytose de l’EPR, une nouvelle méthode de quantification de l’absorption et de la dégradation des fragments et des pointes du segment externe a été introduite. Appelée « capacité totale de consommation », cette méthode permet de surmonter les erreurs potentielles d’interprétation de la capacité de phagocytose de l’EPR inhérentes aux tests classiques de « chasse au pouls » du segment externe. Les modèles et les techniques présentés ici peuvent être utilisés pour étudier les voies de génération et de clairance de la lipofuscine et la toxicité putative.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) fournit un soutien essentiel pour les photorécepteurs sus-jacents, y compris l’absorption quotidienne et la dégradation des extrémités ou des fragments du segment externe du photorécepteur (dans ce protocole, l’abréviation OS signifie embouts ou fragments OS plutôt que segments externes entiers). Cette absorption quotidienne de l’EPR post-mitotique finit par surcharger la capacité phagolysosomale et conduit à l’accumulation de matériel intracellulaire autofluorescent non digestible, appelé lipofuscine. Fait intéressant, plusieurs études ont également démontré que la lipofuscine RPE peut s’accumuler sans phagocytose^{OS 1,2}. La lipofuscine a de nombreux composants, y compris des adduits réticulés dérivés des rétinoïdes du cycle visuel, et peut occuper près de 20% du volume des cellules EPR pour les personnes de plus de 80 ans³.

La question de savoir si la lipofuscine est toxique a fait l’objet de vifs débats. La maladie de Stargardt est une dégénérescence autosomique récessive des photorécepteurs et de l’EPR dans laquelle une mutation d’ABCA4 déclenche un traitement incorrect des rétinoïdes du cycle visuel contenus dans les segments externes des photorécepteurs. Un traitement inadéquat des rétinoïdes conduit à une réticulation aberrante et à la formation d’espèces bis-rétinoïdes, y compris le bis-rétinoïde N-rétinylidène-N-rétinyléthanolamine (A2E). Des études ont démontré de multiples mécanismes de toxicité A2E ^4,5. La lipofuscine contribue aux signaux d’autofluorescence du fond d’œil lors de l’imagerie clinique, et les patients de Stargardt et les modèles animaux présentent une autofluorescence accrue du fond d’œil avant la dégénérescence rétinienne, suggérant une corrélation entre les niveaux de lipofuscine et la toxicité ^6,7. Cependant, avec l’âge, la lipofuscine s’accumule chez tous les humains sans déclencher de dégénérescence de l’EPR. De plus, dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), où la dégénérescence de l’EPR ne survient que chez les patients âgés, les personnes atteintes de formes précoces et intermédiaires de la maladie ont moins de signaux d’autofluorescence du fond d’œil que les humains non malades appariés selon l’âge⁸. Ces résultats cliniques ont également été vérifiés au niveau histologique ^9,10.

Les modèles animaux de l’accumulation de lipofuscine RPE ont également laissé une certaine ambiguïté sur la toxicité de la lipofuscine. La souris knockout ABCA4 ne présente pas de dégénérescence rétinienne sur un fond pigmenté, alors qu’elle le fait sur un fond albinos ou lorsqu’elle est exposée à la lumière bleue^11,12. De plus, la toxicité de la lipofuscine dérivée via ABCA4 knockout diffère probablement de la lipofuscine à accumulation plus lente qui se produit avec le vieillissement naturel, comme on le voit dans AMD¹³.

Les modèles in vitro d’accumulation de lipofuscine offrent une alternative à l’étude des effets de l’accumulation de lipofuscine sur la santé des EPR. De tels modèles permettent de manipuler des composants de lipofuscine, de l’alimentation de composants rétinoïdes simples à l’alimentation de la SG, et permettent d’étudier l’EPR humaine plutôt qu’animale. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs méthodes ont été développées pour modéliser la lipofuscine RPE en culture. Avec d’autres groupes, le groupe du Dr Boulton a nourri quotidiennement la SG bovine pendant une période allant jusqu’à trois mois sur le passage de 4 à 7 cellules primaires humaines EPR provenant de donneurs âgés de 4 à 85 ans¹⁴. Alternativement, l’inhibition de l’autophagie a également conduit à l’accumulation de lipofuscine dans les passages 3 à 7 cultures primaires d’EPR humaines¹⁵. Cependant, l’inhibition lysosomale sublétale dans des cultures hautement différenciées de RPE prénatale humaine primaire (hfRPE) de passage 1 n’a pas réussi à induire la lipofuscine, même avec l’ajout répété de SG sur une base quotidienne¹⁶.

Comme approche plus réductionniste, d’autres ont donné des composants simples de lipofuscine aux cultures, en particulier le bis-rétinoïde A2E ^4,17. De telles études sont précieuses en ce qu’elles définissent des mécanismes directs potentiels de toxicité pour les composants individuels de la lipofuscine, impliquant, par exemple, le cholestérol lysosomal et l’homéostasie des céramides¹⁸. Dans le même temps, il y a un débat sur la toxicité de l’A2E¹⁹, et l’alimenter directement aux cellules contourne la voie typique d’accumulation de lipofuscine, qui implique la phagocytose du système d’exploitation photorécepteur. Dans une tentative d’administrer tous les composants de la lipofuscine aux cultures d’EPR, Boulton et Marshall ont purifié la lipofuscine à partir d’yeux humains et l’ont transmise au passage 4 à 7 cultures humaines primaires d’EPR dérivées de donneurs humains fœtaux et âgés²⁰. Bien qu’innovante, cette méthode représente une source limitée de lipofuscine pour des expériences répétées.

Alors que l’alimentation répétée de cultures OS à RPE produit de la lipofuscine dans de nombreux systèmes, elle ne le fait pas dans les cultures RPE primaires hautement différenciées¹⁶. La SG photo-oxydante induit des réactions de réticulation comme la formation de bis-rétinoïdes qui se produit naturellement lors de la formation de lipofuscine in vivo. Cela peut accélérer la formation de granules de type lipofuscine dans les systèmes de culture EPR, même ceux qui sont très différenciés et résistants à l’accumulation de lipofuscine¹⁶. Ici, une méthode pour induire l’accumulation de granules de type lipofuscine dans l’hfRPE hautement différencié et l’iPSC-RPE humain est introduite, modifiée à partir du protocole publié par Wihlmark²¹. Cette méthode a l’avantage d’induire des granules de type lipofuscine utilisant la même source (système d’exploitation photorécepteur) et la même voie (absorption de la SG phagolysosomale) que pour la lipofuscinogenèse in vivo. De plus, il est effectué sur des cultures humaines d’EPR hautement différenciées et validées dans de multiples études pour reproduire l’EPR humaine in vivo^22,23,24. Ces granules de type lipofuscine sont appelés matériaux autofluorescents non digestibles (UAM) et fournissent des données et une discussion dans ce protocole comparant UAM à la lipofuscine in vivo. Outre les méthodes de construction et d’évaluation des cultures chargées d’UAM dans l’EPR humaine hautement différenciée, une méthode mise à jour pour évaluer la phagocytose de la SG EPR est également introduite. Plusieurs excellentes méthodes de chasse par impulsions pour quantifier la phagocytose OS ont été introduites, y compris le transfert Western, l’immunocytochimie et FACS^25,26,27. Cependant, au début de la chasse au pouls du système d’exploitation, les conditions qui conduisent à une mauvaise adoption de la SG peuvent être confondues avec des conditions qui favorisent la dégradation rapide du système d’exploitation internalisé. La méthode présentée ici mesure la quantité totale de SG introduits qui est entièrement consommée/dégradée par l’EPR (« Capacité de consommation totale »), ce qui aide à éliminer cette ambiguïté. On s’attend à ce que des informations sur la toxicité de la lipofuscine à l’aide de ces protocoles, y compris les effets sur les taux de phagocytose de la SG à l’aide de la méthode de la « capacité totale de consommation », soient utilisées pour faire la lumière sur la toxicité de la lipofuscine in vivo.

Protocol

Le présent protocole concernant l’acquisition et l’utilisation de tissus humains a été examiné et approuvé par le comité d’examen institutionnel de l’Université du Michigan (HUM00105486). 1. Préparation des extrémités et des fragments du segment extérieur photo-oxydés REMARQUE : Des rétines bovines adaptées à l’obscurité ont été achetées et expédiées sur glace (voir le tableau des matières). À partir de ces rétines, l…

Representative Results

La configuration pour la photo-oxydation de la SG est illustrée à la figure 1Ai. Les lames revêtues de polytétrafluoroéthylène permettent de charger un grand volume de SG en solution par rectangle ouvert sans se répandre sur le reste de la lame. La lame avec OS est contenue dans une boîte de Petri stérile avec le couvercle enlevé, et une lampe UV est placée sur la lame comme illustré à la figure 1Aii. La lame peut également être placée dans un di…

Discussion

Alors que la lipofuscine RPE a été étudiée pendant des décennies, sa toxicité est débattue 2,9,16,42. Compte tenu de l’ambiguïté sur la toxicité de la lipofuscine à partir de modèles animaux¹¹, les modèles in vitro utilisant l’EPR humaine sont précieux. Une gamme de modèles d’accumulation de lipofuscine in vitro a été décrite, ma…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000