Summary
このプロトコルでは、高度に分化および分極されたヒト網膜色素上皮(RPE)培養におけるリポフスチン蓄積モデルと、RPEの総OS消費/分解能力を検出するための改良された外部セグメント(OS)食作用アッセイについて説明します。これらの方法は、以前のリポフスチンモデルおよび古典的なパルスチェイス外セグメント食作用アッセイの限界を克服します。
Abstract
網膜色素上皮(RPE)による視細胞外側セグメントの毎日の食作用は、リポフスチンと呼ばれる細胞内老化色素の蓄積に寄与する。リポフスチンの毒性は、最も一般的な遺伝性網膜変性症であるスターガルト病で十分に確立されていますが、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢黄斑変性症(AMD)ではより物議を醸しています。ヒトにおけるリポフスチン毒性を決定することは困難であり、Stargardtの動物モデルは毒性が限られている。したがって、in vivoでヒトRPEを模倣するin vitroモデルは、リポフスチンの生成、クリアランス、および毒性をよりよく理解するために必要です。これまでの細胞培養リポフスチンモデルの大部分は、細胞株内にあったか、またはRPEに光受容体外周セグメント全体の断片/先端ではなく、複雑なリポフスチン混合物の単一成分を供給し、より完全で生理学的なリポフスチンモデルを生成します。ここに記載されているのは、高度に分化した初代ヒト出生前RPE(hfRPE)および人工多能性幹細胞(iPSC)由来RPEにおいてリポフスチン様物質(難消化性自己蛍光物質、またはUAMと呼ばれる)の蓄積を誘導する方法である。UAMは、RPEが取り込んだ紫外線処理されたOSフラグメントを食作用によって繰り返し摂食することにより、培養物に蓄積されました。UAMがin vivoでリポフスチンに近似し、異なる主な方法についても説明します。リポフスチン様蓄積のこのモデルに伴い、UAM顆粒の広範な自家蛍光スペクトルを同時抗体染色と区別するためのイメージング方法が導入されています。最後に、RPE食作用能力に対するUAMの影響を評価するために、外側セグメントの断片/ヒントの取り込みと分解を定量化するための新しい方法が導入されました。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来の外部セグメント「パルスチェイス」アッセイに固有のRPE食作用能力の潜在的な誤解を克服します。ここで紹介するモデルと技術は、リポフスチンの生成とクリアランス経路、および推定毒性を研究するために使用できます。
Introduction
網膜色素上皮(RPE)は、感光体の外側セグメントの先端または断片の毎日の取り込みおよび分解を含む、上にある光受容体に対する重要なサポートを提供する(このプロトコル全体を通して、略語OSは、外側セグメント全体ではなくOSの先端または断片を表す)。有糸分裂後のRPEにおけるこの毎日の取り込みは、最終的に食性ソソーム能力を過負荷にし、リポフスチンと呼ばれる難消化性の自己蛍光性細胞内物質の蓄積につながります。興味深いことに、いくつかの研究はまた、RPEリポフスチンがOS貪食なしに蓄積できることを実証しています1,2。リポフスチンは、視覚周期レチノイドに由来する架橋付加物を含む多くの成分を有しており、80歳以上のRPE細胞体積のほぼ20%を占めることができる3。
リポフスチンが有毒であるかどうかは熱く議論されています。スターガルト病は、光受容体とRPEの常染色体劣性変性であり、ABCA4の変異が光受容体の外側セグメントに含まれる視覚周期レチノイドの不適切な処理を引き起こします。不適切なレチノイド処理は、異常な架橋と、ビス-レチノイドN-レチニリデン-N-レチニルエタノールアミン(A2E)を含むビス-レチノイド種の形成につながります。研究は、A2E毒性の複数のメカニズムを示しています4,5。リポフスチンは臨床イメージング中の眼底自己蛍光シグナルに寄与し、Stargardtの患者と動物モデルの両方が網膜変性の前に眼底自家蛍光の増加を示し、リポフスチンレベルと毒性との相関関係を示唆しています6,7。しかし、年齢とともに、リポフスチンはRPE変性を引き起こすことなくすべての人間に蓄積します。さらに、RPE変性が高齢患者にのみ起こる加齢黄斑変性症(AMD)では、初期および中間型の疾患を有する患者は、年齢を一致させた非疾患のヒトよりも眼底自己蛍光シグナルが少ない8。これらの臨床所見は、組織学的レベルでも検証されています9,10。
RPEリポフスチン蓄積の動物モデルも、リポフスチン毒性についていくつかの曖昧さを残しています。ABCA4ノックアウトマウスは、色素沈着した背景に網膜変性を示しませんが、アルビノの背景または青色光にさらされた場合に現れます11,12。さらに、ABCA4ノックアウトを介して誘導されるリポフスチンの毒性は、AMD13に見られるように、自然な老化に伴って生じるよりゆっくりと蓄積するリポフスチンとは異なる可能性があります。
リポフスチン蓄積のin vitroモデルは、RPEの健康に対するリポフスチン蓄積の影響を研究する代替手段を提供します。このようなモデルは、単一のレチノイド成分の給餌からOSの給餌まで、リポフスチン成分を操作することを可能にし、動物RPEではなくヒトでの研究を可能にする。過去数十年で、培養中のRPEリポフスチンをモデル化するための複数の方法が開発されてきました。他のグループとともに、ボールトン博士のグループは、4〜85歳のドナーからの継代4〜7個のヒト初代RPE細胞で最大3か月間、ウシOSを毎日給餌しました14。あるいは、オートファジーの阻害は、継代3〜7初代ヒトRPE培養物15におけるリポフスチン蓄積ももたらしている。しかし、高度に分化した継代1、初代ヒト出生前RPE(hfRPE)培養における亜致死的リソソーム阻害は、毎日OSを繰り返し添加してもリポフスチンを誘導できなかった16。
より還元主義的なアプローチとして、他の人は単一のリポフスチン成分、特にビスレチノイドA2E 4,17を培養物に与えました。このような研究は、個々のリポフスチン成分に対する毒性の潜在的な直接的なメカニズムを定義するという点で貴重であり、例えば、リソソームコレステロールおよびセラミド恒常性18を示唆する。同時に、A2E19の毒性については議論があり、それを細胞に直接供給することは、光受容体OSの食作用を伴うリポフスチン蓄積の典型的な経路を回避する。リポフスチンの全成分をRPE培養物に送達しようとして、ボールトンおよびマーシャルは、ヒトの目からリポフスチンを精製し、これを胎児および高齢のヒトドナーの両方に由来する継代4〜7ヒト一次RPE培養物に供給した20。この方法は革新的ですが、繰り返し実験するための限られたリポフスチン源を表しています。
RPE培養物へのOSの反復給餌は多くの系でリポフスチンを産生するが、高度に分化した初代RPE培養ではそうしない16。光酸化OSは、生体内のリポフスチン形成中に自然に起こるビスレチノイド形成のような架橋反応を誘導します。これは、高度に分化し、リポフスチン蓄積に耐性を有するものであっても、RPE培養系におけるリポフスチン様顆粒形成を加速することができる16。ここでは、高分化型hfRPEおよびヒトiPSC-RPEにおけるリポフスチン様顆粒蓄積を誘導する方法が紹介され、Wihlmarkの公開プロトコル21から改変される。この方法は、生体内のリポフスチン生成に対して起こるのと同じソース(視細胞OS)および経路(ファゴリソソームOS取り込み)を用いてリポフスチン様顆粒を誘導するという利点を有する。さらに、インビボでヒトRPEを複製するために、高度に分化され、複数の研究で検証されたヒトRPE培養で行われます22、23、24。 これらのリポフスチン様顆粒は、難消化性自己蛍光物質(UAM)と呼ばれ、UAMをin vivoリポフスチンと比較するこのプロトコルのデータと考察を提供します。 高度に分化したヒトRPEにおけるUAMを含む培養物の構築と評価の方法とともに、RPE OSの食作用を評価するための最新の方法も紹介されています。OS食作用を定量化するための複数の優れたパルスチェイス法が導入されており、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、FACS25,26,27などが含まれています。しかし、OSパルスチェイスの早い段階では、OSの取り込み不良につながる条件と、内部化されたOSの急速な劣化を促進する条件が混同される可能性があります。ここで紹介する方法は、RPEによって完全に消費/低下された導入OSの総量(「総消費容量」)を測定し、このあいまいさを排除するのに役立ちます。「総消費容量」法によるOS貪食率への影響など、これらのプロトコルを活用したリポフスチン毒性に関する知見は、生体内でのリポフスチンの毒性を明らかにするために利用されることが期待されます。
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Protocol
ヒト組織の取得と使用を含む本プロトコルは、ミシガン大学治験審査委員会(HUM00105486)によってレビューおよび承認されました。
1. 光酸化アウターセグメントチップおよびフラグメントの調製
注:暗順応したウシ網膜を購入し、氷上で出荷しました( 材料の表を参照)。これらの網膜から、OSは、以前に公開されたプロトコル23に従って精製された。
- UVランプによるアウターセグメント架橋
- ポリテトラフルオロエチレンでコーティングされたスライド( 材料の表を参照)を70%エタノールに完全に浸し、バイオセーフティキャビネットに10分間浸して、スライドを滅菌します。スライドを滅菌済みの100 mm細胞培養皿で風乾します。
- 各スライドを1つの新しい100 mm細胞培養皿に入れ、200 μLの血清含有細胞培養培地(手元のRPE培養に通常使用される培地)を各長方形に追加し、次にハンドヘルド254 nmUV光(材料の表を参照)をバルブをスライドに直接向けた100 mm細胞培養皿(蓋なし)に置きます。 そして20分間露光します。この研究に特に使用された培地および培地の構成要素の特定の製品番号は、以前に公開されている22,23。このメディアは、このプロトコル全体で「RPEメディア」と呼ばれます。
メモ: メディアの UV 処理はガラス表面をブロックし、次の手順で OS がくっつくのを防ぎます。 - 凍結したOSアリコートを37°Cで解凍します(手または水浴 を介して )。必要な OS の量は、アプリケーションによって異なります。一般に、スライド上の長方形あたり最大500 μLの2 x 108 OS/mLを処理できます。
- 解凍したら、OSを2400 x g で室温で5分間回転させます。ペレットの偶発的な損失を防ぐために、真空ではなくピペットを使用してバイオセーフティキャビネット内の上清を直ちに吸引します。
- ペレットを滅菌PBSで静かに再懸濁します。
注意: 再懸濁された量と予想される濃度を追跡します。例えば、1 x 10 8 OS/mLの1 mLチューブから500 μL PBSでペレットを再懸濁すると、2 x 108 OS/mLが得られます。ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたスライド上の長方形あたりの最大容量と濃度は、2 x 108 OS/mLの500 μLです。 - スライドから培地を吸引し、スライドの各長方形に最大500 μLの2 x 108 OS/mL PBS溶液を置きます。ハンドヘルドUVライトを細胞培養皿(蓋なし)の上に置き、電球をOSに直接向けます。 OS溶液を254nmの光に40分間さらします。
注意: 40分間の暴露中は、UVランプと皿をタオルまたは吸収パッドで覆い、バイオセーフティキャビネットサッシを閉じて、ブロワーをオフにします。これにより、大幅な蒸発を防ぐことができます。このプロトコルで使用されているUVランプが研究者に利用できない場合、適切な量の架橋を確実に達成するための2つの選択肢があります。1つ目は、ステップ1.2で概説したデバイス、または1.2で前記デバイスと同じ定量的放射曝露を提供できる別のデバイスのいずれかを使用して、ステップ1.2で概説した定量的UV曝露に従うことです。別の代替案は、 図1Cに見られるクマシー染色の架橋の程度を誘発する時間、OSをUV照射にさらすことである。 - 処理したOS PBS溶液を滅菌マイクロ遠心チューブに集め、コーティングされたスライドの長方形を200〜500μLのPBS(2〜3x)で再洗浄し、各洗浄をマイクロ遠心チューブに回収します。完了したら、組織培養室の顕微鏡でスライドを見て、ほぼすべてのOSがスライドから削除されていることを確認します。
- OS PBS溶液を室温で2400 x g で5分間スピンダウンし、バイオセーフティキャビネット内のPBSをピペッターで吸引し、RPE培養に使用される500 μLの標準培地(例:セクション1.1.2で定義された「RPE培地」)に再懸濁します。再懸濁量は、所望の光酸化OS(OxOS)濃度に基づいて調整することができる。
- 10 μLの懸濁液を新しい微量遠心チューブに入れ、より多くの細胞培養培地で50〜100倍に希釈し、血球計算盤でOSをカウントします。
- OS数に基づいて、OxOSサスペンションを最終的なストック濃度に希釈します。24ウェルトランスウェル(表面積0.33 cm 2;材料表を参照)で高度に成熟したRPE培養物を供給する場合、2 x 107 OS/mLの最終培地濃度が推奨されます。
- これを達成するには、OxOSを5.6 x 107 OS/mL濃度で25 μLアリコートに分配し、標準的なRPE培地に懸濁します。25 μLのアリコートを解凍した後、アリコート全体を45 μLの標準RPE培地と混合し、OxOSトランスウェル供給ごとに70 μLの最終培地容量と2 x 107 OS/mLのOS濃度を提供します。
- OxOSを分注する前に、OSの取り込みとリポフスチンの蓄積を促進する食作用ブリッジリガンド(プロテインSおよびMFG-E8、 材料の表を参照)を追加します。24ウェルトランスウェル中の架橋リガンドの使用濃度は、ヒト精製プロテインSで4 μg/mL、ヒト組換えMFG-E8で1.5 μg/mLです。したがって、5.6 x 107 OS/mLで25 μLのOxOSアリコートの場合、プロテインSのストック濃度は11.2 μg/mLであり、MFG-E8のストック濃度は4.2 μg/mLです。
注:ブリッジリガンド濃度は、24ウェルトランスウェルでのhfRPE培養用に最適化されており、細胞数は0.33 cm2 ウェルあたり約320,000細胞でした。食作用受容体の利用可能性を超えて存在するリガンドは逆説的にOSの取り込みを遮断する可能性があるため、リガンド濃度は他のRPEタイプおよび細胞密度に対して調整する必要があるかもしれない28。 - 液体窒素中のアリコートをスナップ凍結します。
メモ: 複数回のフリーズ解凍は、OS の整合性に非常に悪影響を及ぼします。
- UV架橋剤装置によるアウターセグメント架橋
メモ: 手順 1.1.2 と 1.1.6 をそれぞれ置き換える以下の手順を除き、手順 1.1 に従います。- (手順 1.1.2 を置き換えます)各スライドを1つの新しい100 mm細胞培養皿に入れ、200 μLの血清含有細胞培養培地(例:「RPE培地」またはその他の代替品)を各長方形に追加し、スライドを紫外線架橋剤デバイス( 材料の表を参照)に入れ、3〜6 J / cm2 の放射露光で254 nmのUVで処理して、ガラス表面をブロックし、次のステップでのOSの固着を防ぎます。
- (ステップ1.1.6を置き換えます)スライドから培地を吸引し、スライドの各長方形に滅菌PBS中の2 x 108 OS/mLを最大500 μL入れます。スライドを紫外線架橋剤装置に入れ、必要に応じて治療放射露出(3-9 J/cm2)を設定し、254 nmで処理します。
注:必要な放射曝露は、自家蛍光の程度まで3〜9 J / cm2の間で放射曝露を滴定し、タンパク質架橋(図1Bおよび図1Cに見られるように)を達成することによって慎重に決定できます。
注意: バイオセーフティキャビネットの外でOSを取り扱うと、汚染が発生する可能性があります。OSをUV架橋装置にさらした後、滅菌ピペットチップでOSを収集し、滅菌マイクロ遠心チューブに移し、バイオセーフティフードで以降のすべてのステップを処理します。
- 酸化OSのキャラクタリゼーション
- イメージングによる自家蛍光発光スペクトルの定量化
- 未処理のOSとOxOSからの20〜50μLのストック溶液を2つの別々のマイクロ遠心チューブに入れます。室温で2400 x g で5分間遠心分離し、ペレットを緩衝(PBSなど)4%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、室温で15分間固定します。
- 固定後、上記のようにスピンダウンし、PBS x 2で洗浄し(洗浄の合間にスピンダウン)、30 μL未満のPBSに再懸濁します。
- 数マイクロリットルの再懸濁液を顕微鏡スライドに置き、封入剤( 材料表を参照)を追加し、最後にカバーガラスを追加します。
- 共焦点顕微鏡での画像OxOS( 材料表を参照)。
注:OxOSの自家蛍光は、広範囲のレーザー波長で励起できますが、通常は405nmまたは488nmのレーザーラインが使用されます。発光も同様に広いですが、自家蛍光を見るには、典型的なGFP/FITC励起/発光フィルターのセットアップで十分です。 - OxOS発光スペクトルを測定するには、共焦点顕微鏡でλスキャンを使用します。典型的なλスキャン設定には、405 nmまたは488 nmでの励起、およびレーザー励起ラインから赤方偏移した10 nmから約800 nmまでの範囲の発光の検出が含まれ、λステップサイズは10 nmです。各顕微鏡システムには、λモードの採用方法に関する独自の指示があり、読者は特定の共焦点のマニュアルを参照する必要があります。
- 別の方法として、フローサイトメトリーによって自家蛍光を定量します。
- 2 x 10 7未処理OSと2 x 107 OxOSをマイクロ遠心チューブで別々にスピンダウンし、1 mLのPBSに再懸濁します。
注:解凍直後にフローサイトメトリーを行う場合、固定は必要ありません。 - 未処理のOSおよびOxOSサンプルをフローサイトメーターにロードします( 材料表を参照)。前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)をFSC-SSC散布図の許容可能な広がりに調整します。PBSをコントロールとして使用して、汚染された小さな粒子を除外します。OSはセルよりもかなり小さいことに注意してください。
- フローサイトメーターの標準FITCチャンネルを使用して、自己蛍光定量を行います。少なくとも 10,000 件のイベントをカウントします。FITCヒストグラムのパルス面積値を使用して、蛍光強度を表します。
注:本研究では、すべてのデータは、製造元の指示に従って、フローサイトメーター分析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して分析されます。
- 2 x 10 7未処理OSと2 x 107 OxOSをマイクロ遠心チューブで別々にスピンダウンし、1 mLのPBSに再懸濁します。
- OxOSにおける架橋の程度を評価する
- 2 x 10 7未処理OSと2 x 107 OxOSをマイクロ遠心チューブで別々にスピンダウンします。上清を除去し、1.2倍のLaemmliサンプルバッファーを加えてペレットを直接溶解します(カバーするのに十分です;材料の表を参照)。ボルテックス、室温で30分間保持し、室温で12000×g以上で10分間スピンダウンし、上清を回収する。
注:OxOSにおけるタンパク質架橋の程度を評価すると、UV処理の妥当性がわかります。未処理のOSとOxOSを比較し、クーマシー染色を支配する単量体ロドプシンバンド(図1C、矢印)が知覚できるだけで、ゲルの上部に高次凝集体とタンパク質塗抹標本が出現すると、適切な架橋が発生します。
注意: サンプルバッファーを使用してOSを溶解する場合は、ロドプシン凝集を引き起こす可能性があるため、その後溶解溶液を加熱しないでください。また、SDSを沈殿させるため、保存の準備ができるまで溶解したOSを冷却することは避けてください。未使用のライセートは-20°Cに保つことができます。 リサリングする場合は、ライセートが室温で完全に解凍されていることを確認してから使用してください。 - 高いSDSおよび還元剤濃度に耐性のあるタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を定量します29。適切なタンパク質アッセイ試薬に関する提案については、 材料表 を参照し、これらの試薬の製造元のプロトコルに従ってください。
- 標準トリスグリシンSDSバッファーを使用して、4%〜15%のグラジエントゲル上でSDS-PAGE電気泳動30 によって未処理のOSおよびOxOSサンプルを実行します。ゲルは、サンプルがスタックに入るまで80 Vで実行され、次に室温で50〜60分間120 Vで実行されます。
- 標準プロトコル31を使用して、ゲルをクマシーブルーで染色します。クーマシー染色は、UV処理によって誘発される架橋の妥当性を実証します。
- 2 x 10 7未処理OSと2 x 107 OxOSをマイクロ遠心チューブで別々にスピンダウンします。上清を除去し、1.2倍のLaemmliサンプルバッファーを加えてペレットを直接溶解します(カバーするのに十分です;材料の表を参照)。ボルテックス、室温で30分間保持し、室温で12000×g以上で10分間スピンダウンし、上清を回収する。
- イメージングによる自家蛍光発光スペクトルの定量化
2. RPE培養におけるリポフスチン様顆粒(UAM)の構築
- OxOSフィード:量、頻度、および食作用ブリッジングリガンド
注:摂食は、継代1のヒトiPSC-RPEまたはhfRPE培養で行われ、Bhartiラボ(iPSC-RPEの場合)32によって概説されたプロトコルまたはシェルドンミラーラボ22,23から適応されたhfRPEの以前に概説されたプロトコルに従って増殖します。以下のすべての計算は、OxOSまたはOSを1つの24ウェルトランスウェル(直径6.5 mm、成長面積0.33 cm2)に供給することに基づいています。- 25 μLの5.6 x 107 OxOS/mLを37°Cで解凍し、45 μLの細胞培養培地をOxOSアリコートに加えると、最終容量は70 μLになります。
注:ステップ1で調製したOxOSアリコートには、食作用架橋リガンドMFG-E8およびプロテインSが含まれます。ただし、これらのリガンドが凍結前にアリコートに添加されていない場合は、このステップで添加することができ、細胞に供給される培地中のリガンドの最終濃度がプロテインSで4 μg/mL、MFG-E8で1.5 μg/mLになるようにします。ステップ1.1.11で述べたように、ブリッジリガンドの濃度は、他のRPEタイプまたは細胞密度に合わせて変更する必要があるかもしれません。 - Transwellから頂端培地を除去し、貪食ブリッジリガンドを頂端チャンバーに結合する2 x 107 OxOS/mLを70 μL加えます。24時間後、取り外して新しいOxOSフィードと交換します。給餌は、週末を除いて、20回の給餌が完了するまで(~1か月)平日は毎日行われます。基底外側細胞培養培地(400-550 μL)を2〜3回/週に交換します。
- 20回の給餌が完了したら、ウェルの通常の培地交換を再開します。
注:RPE頂端表面から粘着性のあるOxOSを洗い流すには、さらにいくつかの培地交換が必要なため、UAMを含む培養物の実験は、OxOSフィードが終了してから少なくとも1〜2週間後に行う必要があります。
注意: OxOS フィードを介した UAM の蓄積を適切に制御することが重要です。毎日の培地交換はRPE生物学に影響を与える可能性があるため、以下のコントロールウェルが推奨されます:コントロール1:OxOS処理群と同じ数の給餌のために、平日は毎日培地を交換してください。対照2:RPE未処理OSを平日、OxOS給餌と同じ濃度と量で、同じ給餌回数で毎日給餌する。
- 25 μLの5.6 x 107 OxOS/mLを37°Cで解凍し、45 μLの細胞培養培地をOxOSアリコートに加えると、最終容量は70 μLになります。
- 経上皮電気抵抗(TEER)および細胞死アッセイによるリポフスチン様顆粒を含む培養物の健康状態のモニタリング
注:OxOSの供給中および給餌後のRPE培養の健全性は、RPEタイトジャンクションの完全性と細胞死を評価することによって測定できます。経上皮電気抵抗(TEER)の測定によるタイトジャンクションの完全性の評価は、一般的な細胞の健康の敏感なマーカーであることが以前に示されています33。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出など、より伝統的な細胞死の非侵襲的マーカーも採用できます。- ティアを実行する
注意: TEERは、経上皮電気抵抗(TEER)メーターとTEAR電極でテストされ、通常は製造元の指示に従ってテストされます( 材料表を参照)。- TEER電極を滅菌するには、70%エタノールに浸したタスクワイパーを使用して電極を洗浄し、電極プローブの先端を70%エタノールに10分間浸します。
- 電極を完全に乾燥させてから、電極を滅菌培地に浸します。
- 滅菌培地からプローブを取り出し、TEAR電極の2つのプローブを培養トランスウェルの頂端チャンバーと基底外側チャンバーに挿入します。長いプローブチップは基底外側チャンバーに収まります。
注:練習せずにTEER電極で頂端チャンバーの底部をこするのは簡単で、そのような掻き取りは、コンフルエントなRPE単層が破壊されると、TEARの読み取り値が劇的に変化します。したがって、初心者は、実験的なRPE培養でテストする前に、重要でないトランスウェルで練習することをお勧めします。さらに、RPE培養の各プレートがテストされた後、実験者は、標準的な組織培養顕微鏡下でRPE単層の掻き取りを確認する必要があります。 - 頂端プローブと基底外側プローブがトランスウェルに配置されたら、 読み取り ボタンを押すか、メーターのフットスイッチを踏んでTEERを記録します。プレートまたはセル群の間で、電極プローブを滅菌培地で洗浄します。感染が懸念される場合は、プレート間で再滅菌してください。
- メーターから抵抗の読み取り値を取得し、培地を含むがセルがない空白のトランスウェルの値(表面積が0.33cm2 の24ウェルトランスウェルの場合は通常100〜110 Ω)を差し引き、トランスウェルの表面積を掛けてTEARを計算します。
注:TEER値は、細胞表面積に正規化して報告する必要があります。健康なhfRPE培養の典型的な値は350〜1100Ωcm2の範囲です。TEER値は温度が下がると増加します。したがって、培養物を37°Cのインキュベーターから室温のフードに移すと、TEER値はプレート全体で増加する傾向があります。この変動を防ぐには、迅速に作業するか(経験がある場合)、プレート温度が室温と平衡になるまで10〜15分待ちます。
- LDH放出アッセイの実行
注:細胞培養上清へのLDHの放出は細胞死中に発生し、標準キットで測定されます(材料の表を参照)。- 24時間のインキュベーション後に細胞の上から上清を収集し、標準培地を使用して1:100に希釈します。
- 24ウェルトランスウェルのコントロール細胞から100 μLの頂端培地に2 μL 10%トリトンX-100を添加することにより、ステップ2.2.2.1のすべての値を正規化するために重要な、可能な総LDH放出を誘導します。トリトン/細胞上清混合物を37°Cで15分間インキュベートした後、溶解した細胞の上に培地を混合して回収し、可能な総LDH放出を測定します。
- 上清を回収したら、メーカーの標準的な説明書を使用してアッセイを実行し、キットの緩衝液を使用して30分間インキュベートした後に発光を測定します。
注:すべてのLDH値は、LDH放出の可能な合計量に正規化されています。
- ティアを実行する
- リポフスチン様顆粒スペクトルおよび組成の特性評価
- 自家蛍光定量とスペクトルの取得
- UAMを含む培養物を4%PFAで室温で15分間固定し、続いてPBSで5回洗浄します。
- 頂端室に少量のPBSを保管してから、トランスウェルを逆さまにします。解剖顕微鏡とかみそりの刃を使用して、トランスウェルから半多孔膜を切り取り、膜とトランスウェルの接合部に切削力を加えます。
注意: トランスウェル膜は、カットが一貫していないときに反ったりしわになったりする傾向があるため、カットが行われるトランスウェルの唇にどれだけ近いかについて一貫性を保ちます。 - トランスウェルメンブレンを切断したら、すぐに鉗子を使用して顕微鏡スライドの上に置き、トランスウェルメンブレンの一部に細胞に触れないように注意してください。細胞に触れないようにしながら、タスクワイプで余分なPBSを吸い取ります。マウントメディアとカバーガラスを追加します。トランスウェルをカバースリップするときは、トランスウェルのどちら側が「右側を上に」しているかを追跡してください。
- ステップ1.3.1.4およびステップ1.3.1.5と同じ設定と手順で自己蛍光強度とスペクトルを取得します。
注:UAMをイメージングする場合、重要な交絡因子は、OxOSが自己蛍光性であり、OxOSフィードの完了後数日、場合によっては数週間もRPE頂端表面に付着することが多いことです。その結果、UAMを定量する場合、測定された自家蛍光がOxOSではなくUAMから来ていることを確認する方法を採用する必要があります。最も簡単な方法は、リポフスチン培養物をロドプシン抗体と共染色することです。例えば、抗ロドプシン抗体4D2は、1:1000の希釈率で、標準的なPFA固定免疫細胞化学プロトコル34と共に使用することができる。ロドプシンの二次抗体は、UAMおよびOxOSの自己蛍光がこの波長で最も弱い傾向があるため、遠赤色色素結合抗体(例えば、647 nm付近に励起極大を有する)である必要があります。その後、共焦点画像を2つのチャネルで順次取得でき、UAMとOxOSの自家蛍光を405 nmレーザーで励起し、415 nmから550 nmの発光を励起し、未消化のOxOSを示す残留ロドプシンは、別のチャネルで標準的な遠赤色色素イメージングパラメーターで励起できます。取得後、ロドプシンチャネルをImageJのようなプログラムでサブトラクティブマスクとして使用して、粘着性のある残りのOxOSから来る自家蛍光を除去し、UAM自家蛍光だけを残して定量することができます。
注意:光酸化されていないOSでもある程度の自家蛍光を示し、厳密な洗浄を行っても、一部のOSおよびOxOSはRPE表面に付着します。したがって、ロドプシン免疫染色を用いてサブトラクティブマスクを生成しなければ、上記の注で示唆されているように、OxOまたは標準OSを給餌した培養物におけるUAM自己蛍光レベルの正確な定量は不可能である。
- リポフスチン様顆粒と他の免疫蛍光マーカーの同時検出
注:ステップ2.3.1で詳述されているように、リポフスチンの広い自己蛍光スペクトルは、蛍光共染色の選択肢を制限します。共染色を容易にするために、以下の方法が考えられる。- 遠赤色蛍光色素を使用します。リポフスチンからの自家蛍光は近赤外線では弱い。したがって、目的の抗原の蛍光検出に遠赤色色素を使用し、共焦点顕微鏡上でのチャネル設定の慎重な調整と組み合わせることで、通常、自家蛍光と共染色蛍光を区別することができます。
- リポフスチンの長い蛍光発光テールを活用しましょう。
注:リポフスチンは非常に広い蛍光発光スペクトルを持っているため、低nm波長(例:405 nmレーザー)で励起され、スペクトルのオレンジ/赤色部分(例:585-635nm)で発光が検出されることがよくあります。励起波長と発光波長のこのユニークな組み合わせは、多くの場合、別の共染色蛍光色素を中心に調整できます。- 488 nm付近にピーク励起を持つ蛍光色素を使用して目的の抗原を検出し、500-530 nmで発光を検出します。405 nmの励起と585-635 nmの発光による自己蛍光検出用に別のチャンネルを設定します。この2番目のチャネルはUAMのみを検出し、最初のチャネルは目的の抗原とリポフスチンを検出します。
- ImageJのようなフリーウェアプログラムを使用して、この2番目のUAM専用チャネルを減算マスクとして使用して、最初のチャネル(抗原信号とUAM信号の両方を含む)からUAM信号を削除します。
- スペクトルアンミキシングを利用します。最新の共焦点顕微鏡のほとんどには、スペクトルアンミキシングオプションが含まれています。これにより、UAMのみでサンプルのスペクトルを取得し、目的の共染色蛍光色素のみで別のサンプルのスペクトルを取得できます。次に、UAMと共染色蛍光色素の両方を含む実験サンプルを取得し、線形アンミキシング法にかけ、シグナルの何パーセントが自家蛍光によるものと共染色によるものかを計算できます。
注:スペクトルアンミキシングの包括的なガイドは、最新の共焦点顕微鏡で入手できます。 - 蛍光寿命イメージングを活用します。UAMと目的の共染色蛍光色素の発光スペクトルは類似しているかもしれませんが、蛍光寿命は大きく異なる可能性があります。一般に、UAMは、ほとんどの特異的蛍光色素よりも短い蛍光寿命を示します。生涯イメージングを可能にする共焦点顕微鏡へのアクセスにより、蛍光シグナルをゲートして、典型的なリポフスチンの寿命よりも長いシグナルを検出することができます。
注:一般に、蛍光寿命を2nsより長い信号にゲーティングすると、UAM汚染が大幅に減少しますが、シグナルが完全になくなるわけではありません。 - 自家蛍光抑制剤の利用。伝統的に、スーダンブラックは、特異的免疫蛍光染色の前に自家蛍光を消光するために使用されてきた35。いくつかの市販の自家蛍光消光剤製品は、スーダンブラックの結果を改善することを報告しており、これらの製品は 材料表に詳述されています。もちろん、自己蛍光消光はリポフスチンを検出する能力を破壊します。
- リポフスチン様顆粒の組成を決定する
- 中性脂質の評価
- UAMを含んだRPEとコントロールウェル(未処理のOSを供給)を4%PFAに室温で15分間固定し、PBSで5回洗浄します。
- 10 μg/mL ナイルレッドまたは3.33 μg/mL Bodipy 493/503を3%BSA PBS溶液中で室温で1時間使用し、続いてPBSで5分間3回洗浄した後、中性脂質を染色します。
- 手順2.3.1.2および2.3.1.3と同様にTranswellを切り取って取り付け、画像を作成します。一般に、イメージングには、ナイルレッド-ex543 nm、em 620-700 nmおよびボディ493/503-ex488 nm、em 500-550 nmの励起帯域幅と発光帯域幅を使用します。
- エステル化コレステロールと非エステル化コレステロールの評価
- ステップ 2.3.3.1.1 に従います。
- フィリピンは、エステル化されていないコレステロールを認識する蛍光染料ですが、エステル化コレステロールは認識しません36。したがって、UAM中の総コレステロール(エステル化されていないおよびエステル化)の量を評価するために、最初にサンプルをコレステロールエステラーゼで前処理して、エステル化コレステロールをエステル化されていないコレステロールに変換します。細胞を0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(pH 7.2)中の20 U/mLコレステロールエステラーゼ( 材料の表を参照)で37°Cで3.5時間処理した後、PBSで5分間3回洗浄します。
- PBS中の50 μg/mLフィリピン( 材料の表を参照)で室温で1時間染色し、PBSで5分間3回洗浄します。フィリピンの光退色しやすいため、サンプルを光から遠ざけてカバーしてください。
注:エステル化されていないコレステロールのみを定量する場合は、ステップ2.3.3.2.2のコレステロールエステラーゼをスキップできます。エステル化コレステロールの量が定量されるべきである場合、試料中の総コレステロールと非エステル化コレステロールとの差によって推定することができる。 - 手順2.3.1.2および2.3.1.3と同様にTranswellを切り取って取り付け、イメージします。
注:フィリピンを画像化すると、非常に速く光退色します。励起の強度と持続時間を最小限に抑える必要があり、接眼レンズを通してサンプルを見ると、いくらかの光退色が発生する可能性があると予想する必要があります。したがって、イメージングの際には、(1)フィリピンチャネル以外の蛍光チャンネルを用いてイメージングに適した領域を探索し、(2)共焦点顕微鏡ではなく広視野顕微鏡でフィリピンを撮像し(光露光の強度を制限するため)、(3)領域の繰り返しイメージングを避けるべきである。一般に、フィリピンのイメージングには以下の励起および発光帯域幅を使用する−ex380nm、em480nm。
- 中性脂質の評価
- 自家蛍光定量とスペクトルの取得
3. RPE食作用に対するリポフスチン様顆粒の効果の評価:総消費能力
注:以下のOSパルスのみのプロトコルを介してOSの食作用を測定する理論的根拠は、代表的な結果のセクションで詳しく説明されています。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来のOSパルスチェイス食作用アッセイで発生する可能性のある食作用効率に関するあいまいさを回避します。アッセイは、4 x 106 OS/mLを含む50 μLの培地を使用して、24ウェルトランスウェルプレート上で行われます。
- 実験に必要なウェル数を計算し、適量の通常のOSを解凍し、室温で2400 x g で5分間スピンダウンし、標準のRPE細胞培養培地で4 x 106 OS/mLに再懸濁します。ブリッジリガンドを追加して、食作用速度を促進します。
注:細胞に供給される培地中の架橋リガンドの最終濃度は、プロテインSで4 μg/mL、MFG-E8で1.5 μg/mLです。ステップ1.1.11で述べたように、ブリッジリガンドの濃度は、他のRPEタイプまたは細胞密度に合わせて変更する必要があるかもしれません。 - 頂端培地を除去し、理想的には適切な濃度の架橋リガンドとともに50 μL 4 x 106 OS/mLを加えます。
- OS添加後のさまざまな時点(例:0時間、1時間、4時間、24時間)に、プロテアーゼ阻害剤を含む16.67 μL 4x Laemmliサンプルバッファーを加えて、細胞とその上にあるOS含有上清の両方を溶解します。P-200ピペットを使用してトランスウェル表面を傷つけ、トランスウェルメンブレンに穴を開けたり、メンブレンをトランスウェルから剥離したりしないように注意し、細胞上清と細胞ライセートを一緒に収集します。ボルテックス、スピンダウンし、室温で30分間放置して完全に変性させます。
注意:サンプルバッファーを使用してOSを溶解する場合でも、ロドプシン凝集を引き起こす可能性があるため、その後溶解溶液を加熱しないでください。また、保存の準備ができるまで溶解したOSを冷却するとタンパク質が沈殿するため、避けてください。未使用のライセートを-20°Cで凍結し、ライセートが完全に解凍されていることを確認してから使用してください。 - ステップ 1.3.3 と同じ設定を使用して SDS PAGE でライセートを実行し、ウェルごとに同量のライセートをロードします。食作用率は細胞数に依存するため、GAPDH、βアクチン、または別のハウスキーピングタンパク質を使用して細胞数を正規化する必要があります。
- ロドプシンのN末端またはC末端に対する抗体でウェスタンブロットをプローブします。標準的なウェスタンブロッティング条件を使用し、抗体希釈は 材料表に記載されています。
注:メインのロドプシンバンドの下には、複数のロドプシンフラグメントがあります。これらの断片は、部分的に消化されたロドプシンを表し、ファゴソームとリソソームとの融合の前に開始されるプロセス32,33。対照RPEと比較したUAM含有RPEにおけるロドプシンフラグメントの数の増加は、ファゴソーム-リソソーム融合、リソソーム酸性化、および/または分解酵素機能のレベルで、ファゴリソソーム容量の下流の欠陥を示している可能性があります16,34,35。
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Representative Results
OSの光酸化のセットアップを図1Aiに示します。ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたスライドにより、スライドの残りの部分に広がることなく、開いた長方形ごとに大量の溶液中のOSをロードできます。OS付きのスライドは、蓋を外した滅菌ペトリ皿内に含まれ、図1Aiiに示すようにUVランプがスライドの上に置かれます。あるいは、スライドは、図1Aiiiに示すようにUV架橋剤装置に配置することができる。光酸化後、顕微鏡とフローサイトメトリーの両方で評価されるように、OSの自家蛍光は有意に増加します(図1B)。光酸化後のタンパク質架橋の程度は、ドミナントタンパク質バンド(単量体ロドプシン)の高次凝集体および塗抹標本への変換として示される、クマシー染色を用いたSDS-PAGEによって評価することができる(図1C)。ハンドヘルドUVランプによる光酸化(図1Aii)とUV架橋装置(図1Aiii)を比較すると、ハンドヘルドUVランプは、UV架橋剤装置(図1B)からの3 J/cm 2処理と同程度の自家蛍光、およびUV架橋装置からの6 J/cm 2処理(図1C)と同程度のタンパク質架橋を有するOxOSを生成することが示されています。).研究者が利用できるUVランプがこのプロトコルで使用されているものと異なる場合は、図1CのUVランプレーンに見られるレベルの架橋を達成するために、露光時間を滴定することをお勧めします。OxOSの自己蛍光スペクトルは、OSのタンパク質単離画分とOS16の脂質単離画分の両方において、未処理OSのスペクトルと比較して軽度の青方偏移です。
RPE培養におけるUAM蓄積量はOxOSの摂食回数に依存し(図2A)、約4週間にわたって20回の摂食は強力な量のUAM蓄積を提供します。UAMの自己蛍光と、洗浄後数日から数週間でもRPE頂端表面に付着したままの残留OxOSの自家蛍光を区別するために、遠赤色色素で検出されるロドプシン抗体で染色します。このロドプシン蛍光チャネルをマスクとして使用することで、UAMチャネルからOxOSの自家蛍光を差し引くことができ、UAMのみからの自家蛍光を真に定量化できます16。上記で概説した染色プロトコルを利用すると、このモデルに蓄積されたUAMは、天然リポフスチンと同様に、ナイルレッド染色16によって評価されるように、豊富な中性脂質を有する。しかし、エステル化または非エステル化コレステロールの蓄積はほとんどまたはまったく見られず(図2B)、これは健康な目からの天然リポフスチンに見られるコレステロール蓄積の欠如と一致しています(データは示されていません)。
リポフスチンの非常に広い蛍光発光スペクトルを考えると、リポフスチンの自己蛍光と同時に目的の蛍光マーカーを追跡することは困難です。上記の方法のセクションでは、この問題を克服するためのいくつかの方法について詳しく説明します。上記のステップ2.3.2.1で概説した方法は、遠赤色のリポフスチンに対する低い自己蛍光発光強度を利用する。 図2Ciでは、UAMとオートファジーマーカーLC3の共局在をAlexa 647色素でLC3を染色することによって評価しています。LC3チャネルへのUAMのブリードスルーにもかかわらず、リポフスチンとLC3がこれらの画像のどこにあるかは明らかです。上記のステップ2.3.2.2で概説した方法では、リポフスチンの非常に長い蛍光発光スペクトルにより、リポフスチンのみからの蛍光を含む発光チャネルの設計が可能になります。 図2Ciiでは、UAMは488 nmのレーザーで励起されていますが、発光は500-535 nmと600-645 nmの両方で検出されています。サンプルはLC3と共染色され、Alexa 488色素で検出されます。Alexa 488チャンネル(励起:488 nm、発光:500-535 nm)には、LC3信号とUAM信号の両方が含まれています。ただし、488 nmの励起と600〜645 nmの発光を持つ2番目のチャネルにはUAMのみが含まれています。この2番目のチャンネルをマスクとして使用し、Alexa 488/LC3チャンネルに適用して、LC3信号から不要なUAM信号を差し引くことができます。上記のステップ2.3.2.4で概説した方法では、自己蛍光リポフスチンの蛍光寿命が短いため、リポフスチンを共染色蛍光と区別することができます。図2Ciiiでは、2nsより前にフォトンカウンティング検出器に到達するすべての蛍光シグナルが除去され、 LC3からの共染色シグナルを大部分保持しながら、UAM自己蛍光シグナルの多くがゲートアウトされます。リポフスチンと共染色蛍光色素の強い共局在がある場合、リポフスチンと共染色蛍光を区別するために方法の組み合わせが必要になる場合があります。
複数の研究がOSの食作用率5,36,37,38,39に対するRPEリポフスチン蓄積の影響を仮定しているため、UAMを含む培養におけるOSの食作用能力が評価されました。典型的な食作用アッセイでは、細胞をOSとともに短時間インキュベートし(「パルス」)、その後、結合していないOSを洗い流し、「追跡」期間にわたってOSを含まない培地を交換します。追跡中、OSが分解されると、RPE内でOSで最も豊富なタンパク質であるロドプシンが失われます。追跡中のさまざまな時点で、OSフリー培地が除去され、続いて細胞溶解およびRPE溶解物内に残るロドプシンのSDS-PAGEが除去されます。しかし、OSのパルス周期はOSの取り込みと分解の両方からなるため、取り込みと分解が高いRPE(「食作用効率の良い」細胞)は、取り込みと分解の低いRPE(「食作用効率の悪い」細胞)と同じロドプシンレベルをチェイス期間の早い段階で持つ可能性があります。これは、Zhangら23による研究で概略的に表されています。この曖昧さを克服するために、ここでは「パルスのみ」のアッセイが採用されました。この方法では、OSはRPEにパルスされますが、洗い流されません。OS添加後の様々な時点で、培地および細胞溶解液が一緒に収集される。培地には未消化のOSが含まれ、細胞ライセートには、細胞表面の無傷のOS、内部化された部分的に消化されたOS、およびリソソームを正常に通過した完全に消化されたOSの組み合わせが含まれています。対照として、細胞はOSに曝露されますが、その後、細胞ライセートとOS含有上清が直ちに収集されます。このコントロールは、細胞にどれだけの総ロドプシンが導入されたかを明らかにします。ライセートと上清はOS導入後のさまざまな時点で収集されるため、ロドプシンシグナル全体の何パーセントが消失したかを評価でき、これを導入/開始OSの量が完全に分解された量のマーカーとして使用できます。このアッセイの読み出しは、すべてのOS劣化を正確に測定し、上記のパルス追跡実験の交絡解釈の対象とならないため、「総消費容量」と呼ばれます。
図3Aおよび補足図1は、総消費能力アッセイを用いた残りのロドプシンのウェスタンブロットを示す。細胞に供給されるOSの量は、0時間におけるロドプシンバンドにより測定される。メインロドプシンバンドは、コントロールとUAMを含むRPEサンプルの間で同等の効率で分解されます(4時間および24時間で一本の矢印)。しかし、メインロドプシンバンドの下に現れるロドプシンの部分的に分解された断片を見ると、グループ間に違いがあります。断片存在量の違いは、タンパク質分解的に切断されたロドプシンの断片が正常なリソソーム機能で急速に分解されるべきであるため、UAM群におけるリソソーム能力の低下を意味する。主要なロドプシンフラグメントの存在量の増加なしにこれらのフラグメントの存在量が増加したことは、UAMを含む培養物におけるリソソーム分解能力におけるより微妙な欠陥を示唆しています。以前の研究では、リポフスチンが実際にOS食作用44の欠陥を誘発できることが示唆されていますが、ロドプシンフラグメントに対するリポフスチンの効果を調べた以前の研究ではなく、ファゴリソソーム分解の末期への機能障害をより正確に特定できます。図3Bは、2つの異なる抗ロドプシン抗体を用いたメインロドプシンバンドとロドプシンフラグメントのウエスタンブロッティングを示しています。抗体4D2はロドプシンのN末端を認識し、N末端フラグメントはリソソームで分解されるロドプシンの最後の部分である。対照的に、抗体1D4は、ファゴソーム-リソソーム融合の前でさえ分解されるロドプシンのC末端を認識する。したがって、どのフラグメントがどの抗体で染色されるかを理解することは、プレリソソーム対リソソーム32、40、41であるロドプシンプロセシング欠損の感覚を提供する。
図1:光酸化アウターセグメント(OxOS)の処理と特性評価。 (A)254 nmのUVハンドヘルドランプ(ii)またはUV架橋剤デバイス(iii)のいずれかで処理されたポリテトラフルオロエチレンコーティングされたスライド(i)上のOSの描写。 (B)未処理(通常の)OS(RegOS)と比較して、処理OS(OxOS)は、共焦点イメージング(左)(スケールバー= 10 μm)およびフローサイトメトリー(右)によって示されるように、自家蛍光が増加しました。ハンドヘルドUVランプで処理したOxOSの自己蛍光強度は、3J/cm2の放射暴露でUV架橋剤装置で処理したOSと同様であった(エラーバー=S.E.M.)。(C)UV曝露によって誘導されるOSタンパク質の架橋を実証するSDS-PAGE。ハンドヘルドUVランプを介したOxOS架橋は、6 J / cm2の放射曝露でUV架橋剤デバイスで処理されたOSと同様でした。単量体ロドプシンは矢印で強調表示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:hfRPE培養におけるOxOS誘導性リポフスチン様顆粒のイメージング。 (A)OxOSによって誘導される自己蛍光顆粒 (緑色) は、5回の給餌と比較して、20回の給餌後に有意に多く蓄積した。ロドプシン抗体(マゼンタ)による残留OxOS染色。スケールバー= 10μm。 (B)OxOSによって誘導されたUAM(緑)は、フィリピン染色 (赤) によって評価されるように、遊離コレステロールまたはコレステロールエステルで富化されなかった。セレバー= 10μm。 (C) リポフスチン存在下での蛍光共染色のためのイメージング方法。(i)遠赤色蛍光色素(Alexa 647)を使用してオートファジーマーカーLC3 ( マゼンタ)を染色し、UAMブリードスルーを最小限に抑えます。標準のグリーンチャンネル励起および発光フィルター設定で画像化された純粋なUAM(グリーン)。スケールバー = 2 μm。 (ii) レシオメトリックイメージングの使用は、Alexa 488で標識されたLC3染色からUAM自家蛍光を解読するのに役立ちます。励起は488 nm、緑チャネル発光バンドパスは500-535 nm、赤チャネル発光バンドパスは600-645 nmです。赤チャンネルを減法混法マスクとして適用して、LC3信号を緑チャンネルから分離することができます。スケールバー = 5 μm。 (iii) リポフスチン/UAMの蛍光寿命は通常、特定の色素よりも短いため、フォトンカウンティング検出器に到達する蛍光信号を2ns未満でゲーティングアウトすることで、UAMの自家蛍光を減らすことができます。トップ画像はゲーティングなしです。下の画像はゲーティング付きで、2nsより長い寿命を持つ蛍光シグナルのみを保持します。上と下の画像の間では、特定のLC3信号(Alexa 488でラベル付け)と比較して、UAM信号の相対的な減少が大きくなります。スケールバー = 5 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:OS食作用を測定するための「総消費能力」方法。 (A) ウェスタンブロットでアッセイされた、RPE培養へのOSの導入後の細胞溶解液および上清の両方に残っている総ロドプシンタンパク質。通常のOSを50 μL培地に供給した後、馴化培地/上清と細胞の両方を0、4、および24時間で一緒に溶解しました。0時間のタイムポイントはコントロールとして機能し、各Transwellに供給されるOSの合計量を示します。無傷のロドプシンバンド(一本の矢印)は、対照細胞とUAMを含むRPE細胞の間で差がなく、RPE貪食に対するUAMの大きな影響がないことを示唆しています。しかし、二重矢印で示すロドプシンの切断産物はUAM群で高く、ファゴリソソーム系における軽度の分解機能障害を示唆しています。等しいレベルのGAPDHは、食作用率に影響を与える可能性のあるウェル間の細胞数が等しいことを示しています。 (B) 異なるロドプシン抗体は、異なる分解断片を認識する。4D2はロドプシンのN末端を認識し、リソソーム分解の最後の段階まで無傷です。したがって、認識するフラグメントは小さいです(二重矢印)。対照的に、1D4は、ファゴリソソームプロセスの早い段階で分解されるロドプシンのC末端を認識します。したがって、この抗体は、より高い分子量のロドプシンフラグメントを認識する(二重矢印)。どちらの抗体も無傷のロドプシンを認識します(一本の矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:図3Aに対応する未編集のブロット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
RPEリポフスチンは何十年にもわたって研究されてきましたが、その毒性は議論されています2,9,16,42。動物モデル11からのリポフスチンの毒性についての曖昧さを考えると、ヒトRPEを用いたin vitroモデルは貴重です。さまざまなin vitroリポフスチン蓄積モデルが記載されているが、OS摂食と高度に成熟および分化したヒトRPE培養の両方を利用したものはありません。この組み合わせは、OS給餌がin vivoでのリポフスチン蓄積の方法を要約し、高度に成熟したヒトRPE培養がin vivoでのRPE挙動を最もよく再現するため、理想的なモデルを表しています。興味深いことに、高度に分化したhfRPE培養を利用した場合、反復給餌後でも、日常的なOS曝露はリポフスチン様物質を誘導するには不十分であることが発見されました16。したがって、このプロトコルは、制御された方法で光酸化OS(OxOS)によってリポフスチン蓄積プロセスを加速します。ヒトiPSC-RPE培養物とhfRPE培養物の両方にOxOSを給餌すると、難消化性自己蛍光物質(UAM)と呼ばれるリポフスチン様顆粒が強力に蓄積しました。UAM蓄積は、インビボで健康なヒトRPEを模倣する培養系におけるリポフスチンのモデリングを可能にする22、23、29、43、44。以前の出版物とこの研究の両方で、健康な高齢者からの天然リポフスチンと比較したUAMの広範な特徴付けは、類似点と相違点の両方を示しています。UAMは、リポフスチン顆粒がメラニン顆粒と融合してメラノリポフスチン16を形成する傾向を含む、インビボでのリポフスチンの超微細構造を模倣する。UAMとリポフスチンの両方に実質的な中性脂質が含まれ、ロドプシンは含まれず、コレステロールの有意な濃縮はありません(以前の出版物16の図2A、B、上記の図2A、B、および未発表データ)。また、天然のリポフスチン顆粒のサイズとスペクトルをUAMのものと比較しました(以前の出版物の図316)。UAM顆粒は、最初は天然リポフスチンと比較してわずかに大きく、青方偏移していますが、培養中のかなりの期間にわたって、UAMは発光スペクトルのサイズと赤方偏移にコンパクトになり、天然リポフスチンのサイズとスペクトルプロファイルにはるかに類似します。
OxOS UAMモデルは、リポフスチン顆粒の予防および除去に対するオートファジー誘導因子の効果50 およびRPE極性および代謝に対するリポフスチンの効果16を含む、さまざまな用途に利用されている。さらに、これらの顆粒は培養RPEで1年以上持続することが示されており、長期間にわたるリポフスチンスペクトル、形態、および挙動の進化を研究することができます16。このモデルの他の用途には、補体活性化51、リソソーム安定性および炎症反応52、およびミトコンドリア妥協53に関するリポフスチン蓄積の研究が含まれる。
このプロトコルにはいくつかの重要な手順があります。第一に、RPE文化は高度に分化され、成熟している必要があります。OxOSの給餌は、RPEが少なくとも8週間トランスウェルに投与され、高度に成熟したRPEに特徴的なすべての品質を獲得した後にのみ開始する必要があります(Finnemannらによって精緻化された5 'P'-形態、有糸分裂後、色素、分極、および食作用の多角形54)。第二に、OSは非常に壊れやすいため、ピペッティング中は注意して取り扱う必要があります。過度のピペッティングまたは凍結融解はOSを分解します。 最後に、総UVフラックス曝露に対するOSの比率は、そのまま残っているがUAMを誘発する可能性のあるOxOSを生成するために重要です。この比率は、このプロトコルで洗練されています。特定の数のOSに対してUV光が多すぎると、過剰な架橋が発生し、OSの重要な化学構造が破壊されます。 特定の数のOSに対してUV光が少なすぎると、培養中にUAMを誘導できません。
プロトコルの変更には、主にOxOSの摂食時間または濃度の変更が含まれます。経験的には、約4週間の間に20回の給餌は、大量のUAM蓄積を生み出します。これを超える給餌はUAM蓄積を徐々に増加させる可能性がありますが、給餌が少ないと散発的なUAM蓄積のみを引き起こす可能性があります。給餌の数は、実験者および実験者の目的、ニーズ、およびリソースに基づいて調整できます。分化度の低いRPE培養物(継代数が多い、細胞株が多い、または上皮間葉移行特性を示す培養物)では、強力なUAM誘導に必要な給餌量が少なく、OxOS濃度が低くなっています。
このプロトコルにはいくつかの制限があります。OSの光酸化にハンドヘルドUVランプを使用すると、OSに供給される総放射曝露を正確に定量化できなくなります。しかし、ハンドヘルドランプを使用したOSの光酸化は、この研究では、放射曝露のパラメータを提供するのに役立つ 、図1 のはるかに高価な(しかし定量的な)UV架橋剤デバイスと相関していました。実験者は、架橋/ロドプシン塗抹パターンが 図1CのウェスタンブロットのUVランプカラムに見られるパターンを模倣するまで、UV曝露の持続時間を変更することをお勧めします。
この方法の第2の制限は、 インビボでのリポフスチン蓄積の特徴の多くを欠いている可能性が高いことである。実際、このプロトコル全体を通して、リポフスチン様顆粒は、この区別を明確にするために難消化性自己蛍光材料(UAM)と呼ばれる。光酸化OSは、病状の光受容体外側セグメントで起こる天然の化学的架橋の一部を要約するが、架橋は大幅に加速され、UAMモデルではより非特異的である可能性が高い。さらに、1か月近くのOxOS摂食にもかかわらず、UAMモデルは、リポフスチンがヒトに蓄積するのにかかる数十年と比較して、リポフスチン誘導OSへの「急性」曝露を依然として表しています。培養中のリポフスチン蓄積がより長期化すると、表現型の影響が少なくなる可能性があります。それにもかかわらず、UAM顆粒はここに提示された培養システムで1年以上持続するため、RPEの健康に対するそれらの長期的な影響を研究する機会があります16。
RPE食能を評価するためにここに提示された「総消費能力」法の制限は、食作用の欠陥がOS結合対取り込み対分解によるものであるかどうかを区別できないことです。実際、食作用アッセイの目標が食作用プロセスの特定のステップの機能不全への機構的洞察である場合、従来のOSパルスチェイスアッセイがより適切である。「総消費能力」の測定は、制御下と実験条件下でのRPE培養のOS食能力を明確に測定することが目的である場合に採用する必要があります。
結論として、高度に分化したヒトRPE培養におけるリポフスチン様顆粒蓄積のプロトコルが提示されています。この方法は、リポフスチン蓄積の生理学的プロセス(光酸化OSの繰り返し給餌)と、反復研究で示されたRPE培養モデルを組み合わせて、 in vivoで ヒトRPEを強力に再現します。得られたリポフスチン様顆粒を充填した培養物は、RPE生物学に対するリポフスチン効果の評価から、リポフスチン蓄積の調節に重要な小分子、遺伝子、シグナル伝達経路の試験まで、無数の用途に使用できます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、硝子体網膜外科財団(VRSF)、ファイト・フォー・サイト(FFS)、および国際網膜研究財団(IRRF)からの助成金によって部分的にサポートされています。J.M.L.M.は現在、国立眼科研究所からのK08助成金(EY033420)によってサポートされています。HFTの研究に連邦資金は使用されていません。さらなる支援は、Dry AMDのためのJames Grosfeld Initiativeと、次の民間ドナーであるBarbara DunnとDee & Dickson Brownからのものです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm cell culture dish | Corning | #353003 | Others also work |
| 24-well Transwells | Corning | #3470 | |
| Anti-LC3 antibody | Cell Signaling Technology | #4801S | 1:1000 dilution |
| Anti-rhodopsin antibody 1D4 | Abcam | #5417 | 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal. |
| Anti-rhodopsin antibody 4D2 | EnCor Biotech | MCA-B630 | 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal. |
| Autofluorescence quencher | Biotium | #23007 | TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher |
| Autofluorescence quencher | Vector Laboratories | SP-8400 | Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit |
| Bodipy 493/503 | Life Technologies | D3922 | |
| Cholesterol esterase | Life Technologies | From A12216 kit | |
| Confocal microscope | Leica | Leica Stellaris SP8 with FALCON module | |
| Dark-adapted bovine retinas | W. L. Lawson Company | Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) | Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com |
| Filipin | Sigma-Aldrich | F4767 | |
| Flow cytometer | Thermo Fisher | Attune NxT | |
| Flow cytometer analysis software | BD | FlowJo | |
| Handheld UV light | Analytik Jena US | UVGL-55 | |
| Human MFG-E8 | Sino Biological | 10853-H08B | |
| Human purified Protein S | Enzyme Research Laboratories | HPS | |
| Laemmli sample buffer | Thermo Fisher | J60015-AD | |
| LDH assay | Promega | J2380 | LDH-Glo Cytotoxicity Assay |
| Mounting media | Invitrogen | P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Nile red | Sigma-Aldrich | #72485 | |
| Polytetrafluoroethylene-coated slides | Tekdon | Customized | Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" - 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide. |
| Protease inhibitors | Cell Signaling Technology | #5872 | |
| Protein assay | Bio-Rad | #5000122 RC DC protein assay | |
| TEER electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter | World Precision Instruments | EVOM3 | |
| Ultraviolet crosslinker device | Analytik Jena US | UVP CL-1000 |
References
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