高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化
Summary
このプロトコルでは、高度に分化および分極されたヒト網膜色素上皮(RPE)培養におけるリポフスチン蓄積モデルと、RPEの総OS消費/分解能力を検出するための改良された外部セグメント(OS)食作用アッセイについて説明します。これらの方法は、以前のリポフスチンモデルおよび古典的なパルスチェイス外セグメント食作用アッセイの限界を克服します。
Abstract
網膜色素上皮(RPE)による視細胞外側セグメントの毎日の食作用は、リポフスチンと呼ばれる細胞内老化色素の蓄積に寄与する。リポフスチンの毒性は、最も一般的な遺伝性網膜変性症であるスターガルト病で十分に確立されていますが、先進国における不可逆的な失明の主な原因である加齢黄斑変性症(AMD)ではより物議を醸しています。ヒトにおけるリポフスチン毒性を決定することは困難であり、Stargardtの動物モデルは毒性が限られている。したがって、in vivoでヒトRPEを模倣するin vitroモデルは、リポフスチンの生成、クリアランス、および毒性をよりよく理解するために必要です。これまでの細胞培養リポフスチンモデルの大部分は、細胞株内にあったか、またはRPEに光受容体外周セグメント全体の断片/先端ではなく、複雑なリポフスチン混合物の単一成分を供給し、より完全で生理学的なリポフスチンモデルを生成します。ここに記載されているのは、高度に分化した初代ヒト出生前RPE(hfRPE)および人工多能性幹細胞(iPSC)由来RPEにおいてリポフスチン様物質(難消化性自己蛍光物質、またはUAMと呼ばれる)の蓄積を誘導する方法である。UAMは、RPEが取り込んだ紫外線処理されたOSフラグメントを食作用によって繰り返し摂食することにより、培養物に蓄積されました。UAMがin vivoでリポフスチンに近似し、異なる主な方法についても説明します。リポフスチン様蓄積のこのモデルに伴い、UAM顆粒の広範な自家蛍光スペクトルを同時抗体染色と区別するためのイメージング方法が導入されています。最後に、RPE食作用能力に対するUAMの影響を評価するために、外側セグメントの断片/ヒントの取り込みと分解を定量化するための新しい方法が導入されました。「総消費能力」と呼ばれるこの方法は、従来の外部セグメント「パルスチェイス」アッセイに固有のRPE食作用能力の潜在的な誤解を克服します。ここで紹介するモデルと技術は、リポフスチンの生成とクリアランス経路、および推定毒性を研究するために使用できます。
Introduction
網膜色素上皮(RPE)は、感光体の外側セグメントの先端または断片の毎日の取り込みおよび分解を含む、上にある光受容体に対する重要なサポートを提供する(このプロトコル全体を通して、略語OSは、外側セグメント全体ではなくOSの先端または断片を表す)。有糸分裂後のRPEにおけるこの毎日の取り込みは、最終的に食性ソソーム能力を過負荷にし、リポフスチンと呼ばれる難消化性の自己蛍光性細胞内物質の蓄積につながります。興味深いことに、いくつかの研究はまた、RPEリポフスチンがOS貪食なしに蓄積できることを実証しています1,2。リポフスチンは、視覚周期レチノイドに由来する架橋付加物を含む多くの成分を有しており、80歳以上のRPE細胞体積のほぼ20%を占めることができる3。
リポフスチンが有毒であるかどうかは熱く議論されています。スターガルト病は、光受容体とRPEの常染色体劣性変性であり、ABCA4の変異が光受容体の外側セグメントに含まれる視覚周期レチノイドの不適切な処理を引き起こします。不適切なレチノイド処理は、異常な架橋と、ビス-レチノイドN-レチニリデン-N-レチニルエタノールアミン(A2E)を含むビス-レチノイド種の形成につながります。研究は、A2E毒性の複数のメカニズムを示しています4,5。リポフスチンは臨床イメージング中の眼底自己蛍光シグナルに寄与し、Stargardtの患者と動物モデルの両方が網膜変性の前に眼底自家蛍光の増加を示し、リポフスチンレベルと毒性との相関関係を示唆しています6,7。しかし、年齢とともに、リポフスチンはRPE変性を引き起こすことなくすべての人間に蓄積します。さらに、RPE変性が高齢患者にのみ起こる加齢黄斑変性症(AMD)では、初期および中間型の疾患を有する患者は、年齢を一致させた非疾患のヒトよりも眼底自己蛍光シグナルが少ない8。これらの臨床所見は、組織学的レベルでも検証されています9,10。
RPEリポフスチン蓄積の動物モデルも、リポフスチン毒性についていくつかの曖昧さを残しています。ABCA4ノックアウトマウスは、色素沈着した背景に網膜変性を示しませんが、アルビノの背景または青色光にさらされた場合に現れます11,12。さらに、ABCA4ノックアウトを介して誘導されるリポフスチンの毒性は、AMD13に見られるように、自然な老化に伴って生じるよりゆっくりと蓄積するリポフスチンとは異なる可能性があります。
リポフスチン蓄積のin vitroモデルは、RPEの健康に対するリポフスチン蓄積の影響を研究する代替手段を提供します。このようなモデルは、単一のレチノイド成分の給餌からOSの給餌まで、リポフスチン成分を操作することを可能にし、動物RPEではなくヒトでの研究を可能にする。過去数十年で、培養中のRPEリポフスチンをモデル化するための複数の方法が開発されてきました。他のグループとともに、ボールトン博士のグループは、4〜85歳のドナーからの継代4〜7個のヒト初代RPE細胞で最大3か月間、ウシOSを毎日給餌しました14。あるいは、オートファジーの阻害は、継代3〜7初代ヒトRPE培養物15におけるリポフスチン蓄積ももたらしている。しかし、高度に分化した継代1、初代ヒト出生前RPE(hfRPE)培養における亜致死的リソソーム阻害は、毎日OSを繰り返し添加してもリポフスチンを誘導できなかった16。
より還元主義的なアプローチとして、他の人は単一のリポフスチン成分、特にビスレチノイドA2E 4,17を培養物に与えました。このような研究は、個々のリポフスチン成分に対する毒性の潜在的な直接的なメカニズムを定義するという点で貴重であり、例えば、リソソームコレステロールおよびセラミド恒常性18を示唆する。同時に、A2E19の毒性については議論があり、それを細胞に直接供給することは、光受容体OSの食作用を伴うリポフスチン蓄積の典型的な経路を回避する。リポフスチンの全成分をRPE培養物に送達しようとして、ボールトンおよびマーシャルは、ヒトの目からリポフスチンを精製し、これを胎児および高齢のヒトドナーの両方に由来する継代4〜7ヒト一次RPE培養物に供給した20。この方法は革新的ですが、繰り返し実験するための限られたリポフスチン源を表しています。
RPE培養物へのOSの反復給餌は多くの系でリポフスチンを産生するが、高度に分化した初代RPE培養ではそうしない16。光酸化OSは、生体内のリポフスチン形成中に自然に起こるビスレチノイド形成のような架橋反応を誘導します。これは、高度に分化し、リポフスチン蓄積に耐性を有するものであっても、RPE培養系におけるリポフスチン様顆粒形成を加速することができる16。ここでは、高分化型hfRPEおよびヒトiPSC-RPEにおけるリポフスチン様顆粒蓄積を誘導する方法が紹介され、Wihlmarkの公開プロトコル21から改変される。この方法は、生体内のリポフスチン生成に対して起こるのと同じソース(視細胞OS)および経路(ファゴリソソームOS取り込み)を用いてリポフスチン様顆粒を誘導するという利点を有する。さらに、インビボでヒトRPEを複製するために、高度に分化され、複数の研究で検証されたヒトRPE培養で行われます22、23、24。 これらのリポフスチン様顆粒は、難消化性自己蛍光物質(UAM)と呼ばれ、UAMをin vivoリポフスチンと比較するこのプロトコルのデータと考察を提供します。 高度に分化したヒトRPEにおけるUAMを含む培養物の構築と評価の方法とともに、RPE OSの食作用を評価するための最新の方法も紹介されています。OS食作用を定量化するための複数の優れたパルスチェイス法が導入されており、ウェスタンブロッティング、免疫細胞化学、FACS25,26,27などが含まれています。しかし、OSパルスチェイスの早い段階では、OSの取り込み不良につながる条件と、内部化されたOSの急速な劣化を促進する条件が混同される可能性があります。ここで紹介する方法は、RPEによって完全に消費/低下された導入OSの総量(「総消費容量」)を測定し、このあいまいさを排除するのに役立ちます。「総消費容量」法によるOS貪食率への影響など、これらのプロトコルを活用したリポフスチン毒性に関する知見は、生体内でのリポフスチンの毒性を明らかにするために利用されることが期待されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
RPEリポフスチンは何十年にもわたって研究されてきましたが、その毒性は議論されています2,9,16,42。動物モデル11からのリポフスチンの毒性についての曖昧さを考えると、ヒトRPEを用いたin vitroモデルは貴重です。さまざまなin vitroリポフスチン蓄積モデルが記載さ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、硝子体網膜外科財団(VRSF)、ファイト・フォー・サイト(FFS)、および国際網膜研究財団(IRRF)からの助成金によって部分的にサポートされています。J.M.L.M.は現在、国立眼科研究所からのK08助成金(EY033420)によってサポートされています。HFTの研究に連邦資金は使用されていません。さらなる支援は、Dry AMDのためのJames Grosfeld Initiativeと、次の民間ドナーであるBarbara DunnとDee & Dickson Brownからのものです。
Materials
| 100 mm cell culture dish | Corning | #353003 | Others also work |
| 24-well Transwells | Corning | #3470 | |
| Anti-LC3 antibody | Cell Signaling Technology | #4801S | 1:1000 dilution |
| Anti-rhodopsin antibody 1D4 | Abcam | #5417 | 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal. |
| Anti-rhodopsin antibody 4D2 | EnCor Biotech | MCA-B630 | 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal. |
| Autofluorescence quencher | Biotium | #23007 | TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher |
| Autofluorescence quencher | Vector Laboratories | SP-8400 | Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit |
| Bodipy 493/503 | Life Technologies | D3922 | |
| Cholesterol esterase | Life Technologies | From A12216 kit | |
| Confocal microscope | Leica | Leica Stellaris SP8 with FALCON module | |
| Dark-adapted bovine retinas | W. L. Lawson Company | Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) | Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com |
| Filipin | Sigma-Aldrich | F4767 | |
| Flow cytometer | Thermo Fisher | Attune NxT | |
| Flow cytometer analysis software | BD | FlowJo | |
| Handheld UV light | Analytik Jena US | UVGL-55 | |
| Human MFG-E8 | Sino Biological | 10853-H08B | |
| Human purified Protein S | Enzyme Research Laboratories | HPS | |
| Laemmli sample buffer | Thermo Fisher | J60015-AD | |
| LDH assay | Promega | J2380 | LDH-Glo Cytotoxicity Assay |
| Mounting media | Invitrogen | P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Nile red | Sigma-Aldrich | #72485 | |
| Polytetrafluoroethylene-coated slides | Tekdon | Customized | Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" - 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide. |
| Protease inhibitors | Cell Signaling Technology | #5872 | |
| Protein assay | Bio-Rad | #5000122 RC DC protein assay | |
| TEER electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter | World Precision Instruments | EVOM3 | |
| Ultraviolet crosslinker device | Analytik Jena US | UVP CL-1000 |
References
- Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
- Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
- Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
- Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
- Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
- Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease–correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
- Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
- Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
- Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
- Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
- Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
- Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
- Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
- Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
- Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
- Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
- Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
- Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
- Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
- Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
- Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
- Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, 95-108 (2019).
- Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, 63-71 (2018).
- Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
- Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
- Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
- Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
- Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
- Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
- Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
- Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch’s membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
- Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
- Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
- Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
- Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
- Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
- Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
- Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
- Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
- Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
- Law, A. -. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
- Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
- Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
- Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
- Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
- Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
- Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
- Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. , 51-60 (2014).
