Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Lipofuszin-Akkumulationsmodell in hochdifferenzierten und polarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) und einen verbesserten Phagozytose-Assay des äußeren Segments (OS), um die gesamte OS-Verbrauchs-/Abbaukapazität des RPE zu bestimmen. Diese Methoden überwinden die Einschränkungen bisheriger Lipofuszin-Modelle und klassischer Puls-Chase-Phagozytose-Assays im äußeren Segment.

Abstract

Die tägliche Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente durch das retinale Pigmentepithel (RPE) trägt zur Akkumulation eines intrazellulären Alterungspigments bei, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Die Toxizität von Lipofuszin ist bei Morbus Stargardt, der häufigsten erblichen Netzhautdegeneration, gut belegt, ist aber bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, umstrittener. Die Bestimmung der Lipofuszin-Toxizität beim Menschen war schwierig, und Tiermodelle von Stargardt weisen eine begrenzte Toxizität auf. Daher werden In-vitro-Modelle benötigt, die humanes RPE in vivo nachahmen, um die Bildung, Clearance und Toxizität von Lipofuszin besser zu verstehen. Die meisten bisherigen Liofuszin-Modelle in Zellkulturen wurden in Zelllinien oder mit einer einzigen Komponente der komplexen Lipofuszinmischung gefüttert, anstatt mit Fragmenten/Spitzen des gesamten äußeren Segments des Photorezeptors, wodurch ein vollständigeres und physiologischeres Lipofuszin-Modell entsteht. Hier wird eine Methode beschrieben, um die Akkumulation von Lipofuscin-ähnlichem Material (unverdauliches Autofluoreszenzmaterial oder UAM) in hochdifferenzierten primären humanen pränatalen RPE (hfRPE) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten RPE zu induzieren. UAM, akkumuliert in Kulturen durch wiederholte Fütterung von mit ultraviolettem Licht behandelten OS-Fragmenten, die vom RPE über Phagozytose aufgenommen wurden. Die wichtigsten Möglichkeiten, wie sich UAM in vivo Lipofuszin annähert und von diesem unterscheidet, werden ebenfalls diskutiert. Begleitend zu diesem Modell der Lipofuscin-ähnlichen Akkumulation werden bildgebende Verfahren zur Unterscheidung des breiten Autofluoreszenzspektrums von UAM-Granula von gleichzeitiger Antikörperfärbung vorgestellt. Um den Einfluss von UAM auf die RPE-Phagozytosekapazität zu bewerten, wurde schließlich eine neue Methode zur Quantifizierung der Aufnahme und des Abbaus von Fragmenten/Spitzen des äußeren Segments eingeführt. Diese Methode, die als “Total Consumptive Capacity” bezeichnet wird, überwindet mögliche Fehlinterpretationen der RPE-Phagozytose-Kapazität, die klassischen “Pulse-Chase”-Assays im äußeren Segment innewohnen. Die hier vorgestellten Modelle und Techniken können verwendet werden, um die Entwicklung und Clearance von Lipofuszinen sowie die mutmaßliche Toxizität zu untersuchen.

Introduction

Das retinale Pigmentepithel (RPE) bietet eine wichtige Unterstützung für die darüber liegenden Photorezeptoren, einschließlich der täglichen Aufnahme und des Abbaus von Photorezeptorspitzen oder -fragmenten (in diesem Protokoll steht die Abkürzung OS eher für OS-Spitzen oder -Fragmente als für ganze äußere Segmente). Diese tägliche Aufnahme des postmitotischen RPE überlastet schließlich die phagolysosomale Kapazität und führt zur Ansammlung von unverdaulichem, autofluoreszierendem intrazellulärem Material, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Interessanterweise haben mehrere Studien auch gezeigt, dass RPE-Lipofuszin auch ohne OS-Phagozytose akkumulieren kann ^1,2. Lipofuszin besteht aus vielen Komponenten, einschließlich vernetzter Addukte, die von Retinoiden des visuellen Zyklus abgeleitet sind, und kann bei Personen über 80 Jahren fast 20 % des RPE-Zellvolumens einnehmen³.

Ob Lipofuszin toxisch ist, wurde heiß diskutiert. Morbus Stargardt ist eine autosomal-rezessive Degeneration der Photorezeptoren und des RPE, bei der eine Mutation in ABCA4 eine fehlerhafte Verarbeitung von Retinoiden des visuellen Zyklus auslöst, die in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren enthalten sind. Eine unsachgemäße Verarbeitung von Retinoiden führt zu einer fehlerhaften Vernetzung und Bildung von Bis-Retinoid-Spezies, einschließlich des Bis-Retinoid-N-Retinyliden-N-Retinylethanolamins (A2E). Studien haben mehrere Mechanismen für die A2E-Toxizität gezeigt ^4,5. Lipofuszin trägt zu den Autofluoreszenzsignalen des Fundus während der klinischen Bildgebung bei, und sowohl Stargardts Patienten als auch Tiermodelle zeigen eine erhöhte Fundus-Autofluoreszenz vor der Netzhautdegeneration, was auf eine Korrelation zwischen Lipofuszinspiegeln und Toxizität hindeutet ^6,7. Mit zunehmendem Alter reichert sich Lipofuszin jedoch bei allen Menschen an, ohne eine RPE-Degeneration auszulösen. Darüber hinaus haben bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), bei der die RPE-Degeneration nur bei älteren Patienten auftritt, diejenigen mit frühen und intermediären Formen der Krankheit weniger Fundus-Autofluoreszenzsignale als altersgleiche nicht erkrankte Menschen⁸. Diese klinischen Befunde wurden auch auf histologischer Ebene verifiziert ^9,10.

Tiermodelle zur Akkumulation von RPE-Lipofuszin haben auch einige Unklarheiten über die Toxizität von Lipofuszin hinterlassen. Die ABCA4-Knockout-Maus zeigt auf einem pigmentierten Untergrund keine Netzhautdegeneration, während dies auf einem Albino-Hintergrund oder bei blauem Licht der Fall ist^11,12. Darüber hinaus unterscheidet sich die Toxizität von Lipofuszin, das durch ABCA4-Knockout abgeleitet wird, wahrscheinlich von dem langsamer akkumulierenden Lipofuszin, das bei natürlicher Alterung auftritt, wie es bei AMD¹³ zu beobachten ist.

In-vitro-Modelle der Lipofuszin-Akkumulation bieten eine Alternative zur Untersuchung der Auswirkungen der Lipofuszin-Akkumulation auf die RPE-Gesundheit. Solche Modelle ermöglichen die Manipulation von Lipofuszin-Komponenten, von der Fütterung einzelner Retinoid-Komponenten bis hin zur Fütterung von OS, und ermöglichen die Untersuchung von RPE beim Menschen statt beim Tier. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Methoden entwickelt, um RPE-Lipofuszin in Kultur zu modellieren. Zusammen mit anderen Gruppen fütterte die Gruppe von Dr. Boulton bis zu drei Monate lang täglich Rinder-OS mit menschlichen primären RPE-Zellen von Spendern im Alter von 4 bis 85 Jahren¹⁴. Alternativ hat die Hemmung der Autophagie auch zu einer Akkumulation von Lipofuszin in den Passagen 3 bis 7 primärer humaner RPE-Kulturen geführt¹⁵. Die subletale lysosomale Hemmung in hochdifferenzierten, primären humanen pränatalen RPE-Kulturen (hfRPE) der Passage 1 konnte jedoch selbst bei wiederholter täglicher Zugabe von OS kein Lipofuscin induzieren¹⁶.

Als reduktionistischeren Ansatz haben andere Kulturen mit einzelnen Lipofuszin-Komponenten gefüttert, insbesondere mit dem Bis-Retinoid A2E ^4,17. Solche Studien sind insofern wertvoll, als sie mögliche direkte Toxizitätsmechanismen für einzelne Lipofuszin-Komponenten definieren, die beispielsweise lysosomales Cholesterin und Ceramid-Homöostase beinhalten¹⁸. Gleichzeitig wird die Toxizität von A2E¹⁹ diskutiert, und die direkte Verfütterung an Zellen umgeht den typischen Weg der Lipofuszin-Akkumulation, der die Phagozytose des Photorezeptor-OS beinhaltet. In dem Versuch, alle Bestandteile von Lipofuszin in RPE-Kulturen zu bringen, reinigten Boulton und Marshall Lipofuszin aus dem menschlichen Auge und fütterten es an die Passage 4 bis 7 menschlicher primärer RPE-Kulturen, die sowohl von fötalen als auch von älteren menschlichen Spendern stammten²⁰. Obwohl diese Methode innovativ ist, stellt sie eine begrenzte Lipofuszinquelle für wiederholte Experimente dar.

Während wiederholte Fütterungen von OS an RPE-Kulturen in vielen Systemen Lipofuszin produzieren, ist dies in hochdifferenzierten primären RPE-Kulturen nicht der Fall¹⁶. Photooxidierendes OS induziert Vernetzungsreaktionen wie die Bildung von Bis-Retinoiden, die auf natürliche Weise während der Lipofuszin-Bildung in vivo auftreten. Dies kann die Bildung von Lipofuscin-ähnlichen Granula in RPE-Kultursystemen beschleunigen, selbst in solchen, die hochdifferenziert und resistent gegen die Akkumulation von Lipofuszin sind¹⁶. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Induktion von Lipofuscin-ähnlicher Granulaakkumulation in hochdifferenziertem hfRPE und humanem iPSC-RPE vorgestellt, modifiziert von Wihlmarks veröffentlichtem Protokoll²¹. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie Lipofuscin-ähnliche Granula induziert, die die gleiche Quelle (Photorezeptor-OS) und den gleichen Signalweg (phagolysosomale OS-Aufnahme) verwenden, wie es bei der Lipofuszinogenese in vivo der Fall ist. Darüber hinaus wird es an humanen RPE-Kulturen durchgeführt, die hochdifferenziert und in mehreren Studien validiert wurden, um humanes RPE in vivo zu replizieren ^22,23,24. Diese Lipofuscin-ähnlichen Granulate werden als unverdauliches autofluoreszierendes Material (UAM) bezeichnet und liefern Daten und Diskussionen in diesem Protokoll, in dem UAM mit In-vivo-Lipofuscin verglichen wird. Neben Methoden zum Aufbau und zur Evaluierung von UAM-beladenen Kulturen in hochdifferenzierten humanen RPE wird auch eine aktualisierte Methode zur Beurteilung der RPE-OS-Phagozytose vorgestellt. Es wurden mehrere hervorragende Pulse-Chase-Methoden zur Quantifizierung der OS-Phagozytose eingeführt, darunter Western Blotting, Immunzytochemie und FACS^25,26,27. Zu Beginn der Pulsjagd des Betriebssystems können jedoch Bedingungen, die zu einer schlechten Aufnahme des Betriebssystems führen, mit Bedingungen verwechselt werden, die einen schnellen Abbau des internalisierten Betriebssystems fördern. Die hier vorgestellte Methode misst die Gesamtmenge des eingeführten Betriebssystems, die vollständig durch die RPE (“Total Consumptive Capacity”) verbraucht/abgebaut wird, und trägt so dazu bei, diese Mehrdeutigkeit zu beseitigen. Es wird erwartet, dass Erkenntnisse über die Toxizität von Lipofuszin unter Verwendung dieser Protokolle, einschließlich der Auswirkungen auf die OS-Phagozytoseraten unter Verwendung der “Total Consumptive Capacity”-Methode, verwendet werden, um die Toxizität von Lipofuszin in vivo zu beleuchten.

Protocol

Das vorliegende Protokoll, das den Erwerb und die Verwendung von menschlichem Gewebe vorsieht, wurde vom Institutional Review Board der University of Michigan geprüft und genehmigt (HUM00105486). 1. Präparation von photooxidierten äußeren Segmentspitzen und -fragmenten HINWEIS: Die an Dunkelheit angepasste Rindernetzhaut wurde gekauft und auf Eis versandt (siehe Materialtabelle). Von diesen Netzhäuten wurden die OS nach einem zuvor veröffentlich…

Representative Results

Der Aufbau für die Photooxidation des OS ist in Abbildung 1Ai demonstriert. Die mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger ermöglichen es, ein großes Volumen an OS in Lösung pro offenem Rechteck zu laden, ohne sich auf den Rest des Objektträgers auszubreiten. Der Objektträger mit OS befindet sich in einer sterilen Petrischale mit abgenommenem Deckel, und eine UV-Lampe wird über den Objektträger gelegt, wie in Abbildung 1Aii gezeigt. Alternativ…

Discussion

Während RPE-Lipofuszin seit Jahrzehnten untersucht wird, ist seine Toxizität umstritten 2,9,16,42. Angesichts der Unklarheit über die Toxizität von Lipofuszin aus Tiermodellen¹¹ sind In-vitro-Modelle mit humanem RPE wertvoll. Es wurde eine Reihe von In-vitro-Lipofuszin-Akkumulationsmodellen beschrieben, aber keines hat sowohl OS-Fütterung als auch hochreife…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000