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Biology

Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Lipofuszin-Akkumulationsmodell in hochdifferenzierten und polarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen (RPE) und einen verbesserten Phagozytose-Assay des äußeren Segments (OS), um die gesamte OS-Verbrauchs-/Abbaukapazität des RPE zu bestimmen. Diese Methoden überwinden die Einschränkungen bisheriger Lipofuszin-Modelle und klassischer Puls-Chase-Phagozytose-Assays im äußeren Segment.

Abstract

Die tägliche Phagozytose der äußeren Photorezeptorsegmente durch das retinale Pigmentepithel (RPE) trägt zur Akkumulation eines intrazellulären Alterungspigments bei, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Die Toxizität von Lipofuszin ist bei Morbus Stargardt, der häufigsten erblichen Netzhautdegeneration, gut belegt, ist aber bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), der Hauptursache für irreversible Erblindung in den Industrieländern, umstrittener. Die Bestimmung der Lipofuszin-Toxizität beim Menschen war schwierig, und Tiermodelle von Stargardt weisen eine begrenzte Toxizität auf. Daher werden In-vitro-Modelle benötigt, die humanes RPE in vivo nachahmen, um die Bildung, Clearance und Toxizität von Lipofuszin besser zu verstehen. Die meisten bisherigen Liofuszin-Modelle in Zellkulturen wurden in Zelllinien oder mit einer einzigen Komponente der komplexen Lipofuszinmischung gefüttert, anstatt mit Fragmenten/Spitzen des gesamten äußeren Segments des Photorezeptors, wodurch ein vollständigeres und physiologischeres Lipofuszin-Modell entsteht. Hier wird eine Methode beschrieben, um die Akkumulation von Lipofuscin-ähnlichem Material (unverdauliches Autofluoreszenzmaterial oder UAM) in hochdifferenzierten primären humanen pränatalen RPE (hfRPE) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleiteten RPE zu induzieren. UAM, akkumuliert in Kulturen durch wiederholte Fütterung von mit ultraviolettem Licht behandelten OS-Fragmenten, die vom RPE über Phagozytose aufgenommen wurden. Die wichtigsten Möglichkeiten, wie sich UAM in vivo Lipofuszin annähert und von diesem unterscheidet, werden ebenfalls diskutiert. Begleitend zu diesem Modell der Lipofuscin-ähnlichen Akkumulation werden bildgebende Verfahren zur Unterscheidung des breiten Autofluoreszenzspektrums von UAM-Granula von gleichzeitiger Antikörperfärbung vorgestellt. Um den Einfluss von UAM auf die RPE-Phagozytosekapazität zu bewerten, wurde schließlich eine neue Methode zur Quantifizierung der Aufnahme und des Abbaus von Fragmenten/Spitzen des äußeren Segments eingeführt. Diese Methode, die als "Total Consumptive Capacity" bezeichnet wird, überwindet mögliche Fehlinterpretationen der RPE-Phagozytose-Kapazität, die klassischen "Pulse-Chase"-Assays im äußeren Segment innewohnen. Die hier vorgestellten Modelle und Techniken können verwendet werden, um die Entwicklung und Clearance von Lipofuszinen sowie die mutmaßliche Toxizität zu untersuchen.

Introduction

Das retinale Pigmentepithel (RPE) bietet eine wichtige Unterstützung für die darüber liegenden Photorezeptoren, einschließlich der täglichen Aufnahme und des Abbaus von Photorezeptorspitzen oder -fragmenten (in diesem Protokoll steht die Abkürzung OS eher für OS-Spitzen oder -Fragmente als für ganze äußere Segmente). Diese tägliche Aufnahme des postmitotischen RPE überlastet schließlich die phagolysosomale Kapazität und führt zur Ansammlung von unverdaulichem, autofluoreszierendem intrazellulärem Material, das als Lipofuscin bezeichnet wird. Interessanterweise haben mehrere Studien auch gezeigt, dass RPE-Lipofuszin auch ohne OS-Phagozytose akkumulieren kann 1,2. Lipofuszin besteht aus vielen Komponenten, einschließlich vernetzter Addukte, die von Retinoiden des visuellen Zyklus abgeleitet sind, und kann bei Personen über 80 Jahren fast 20 % des RPE-Zellvolumens einnehmen3.

Ob Lipofuszin toxisch ist, wurde heiß diskutiert. Morbus Stargardt ist eine autosomal-rezessive Degeneration der Photorezeptoren und des RPE, bei der eine Mutation in ABCA4 eine fehlerhafte Verarbeitung von Retinoiden des visuellen Zyklus auslöst, die in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren enthalten sind. Eine unsachgemäße Verarbeitung von Retinoiden führt zu einer fehlerhaften Vernetzung und Bildung von Bis-Retinoid-Spezies, einschließlich des Bis-Retinoid-N-Retinyliden-N-Retinylethanolamins (A2E). Studien haben mehrere Mechanismen für die A2E-Toxizität gezeigt 4,5. Lipofuszin trägt zu den Autofluoreszenzsignalen des Fundus während der klinischen Bildgebung bei, und sowohl Stargardts Patienten als auch Tiermodelle zeigen eine erhöhte Fundus-Autofluoreszenz vor der Netzhautdegeneration, was auf eine Korrelation zwischen Lipofuszinspiegeln und Toxizität hindeutet 6,7. Mit zunehmendem Alter reichert sich Lipofuszin jedoch bei allen Menschen an, ohne eine RPE-Degeneration auszulösen. Darüber hinaus haben bei der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), bei der die RPE-Degeneration nur bei älteren Patienten auftritt, diejenigen mit frühen und intermediären Formen der Krankheit weniger Fundus-Autofluoreszenzsignale als altersgleiche nicht erkrankte Menschen8. Diese klinischen Befunde wurden auch auf histologischer Ebene verifiziert 9,10.

Tiermodelle zur Akkumulation von RPE-Lipofuszin haben auch einige Unklarheiten über die Toxizität von Lipofuszin hinterlassen. Die ABCA4-Knockout-Maus zeigt auf einem pigmentierten Untergrund keine Netzhautdegeneration, während dies auf einem Albino-Hintergrund oder bei blauem Licht der Fall ist11,12. Darüber hinaus unterscheidet sich die Toxizität von Lipofuszin, das durch ABCA4-Knockout abgeleitet wird, wahrscheinlich von dem langsamer akkumulierenden Lipofuszin, das bei natürlicher Alterung auftritt, wie es bei AMD13 zu beobachten ist.

In-vitro-Modelle der Lipofuszin-Akkumulation bieten eine Alternative zur Untersuchung der Auswirkungen der Lipofuszin-Akkumulation auf die RPE-Gesundheit. Solche Modelle ermöglichen die Manipulation von Lipofuszin-Komponenten, von der Fütterung einzelner Retinoid-Komponenten bis hin zur Fütterung von OS, und ermöglichen die Untersuchung von RPE beim Menschen statt beim Tier. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Methoden entwickelt, um RPE-Lipofuszin in Kultur zu modellieren. Zusammen mit anderen Gruppen fütterte die Gruppe von Dr. Boulton bis zu drei Monate lang täglich Rinder-OS mit menschlichen primären RPE-Zellen von Spendern im Alter von 4 bis 85 Jahren14. Alternativ hat die Hemmung der Autophagie auch zu einer Akkumulation von Lipofuszin in den Passagen 3 bis 7 primärer humaner RPE-Kulturen geführt15. Die subletale lysosomale Hemmung in hochdifferenzierten, primären humanen pränatalen RPE-Kulturen (hfRPE) der Passage 1 konnte jedoch selbst bei wiederholter täglicher Zugabe von OS kein Lipofuscin induzieren16.

Als reduktionistischeren Ansatz haben andere Kulturen mit einzelnen Lipofuszin-Komponenten gefüttert, insbesondere mit dem Bis-Retinoid A2E 4,17. Solche Studien sind insofern wertvoll, als sie mögliche direkte Toxizitätsmechanismen für einzelne Lipofuszin-Komponenten definieren, die beispielsweise lysosomales Cholesterin und Ceramid-Homöostase beinhalten18. Gleichzeitig wird die Toxizität von A2E19 diskutiert, und die direkte Verfütterung an Zellen umgeht den typischen Weg der Lipofuszin-Akkumulation, der die Phagozytose des Photorezeptor-OS beinhaltet. In dem Versuch, alle Bestandteile von Lipofuszin in RPE-Kulturen zu bringen, reinigten Boulton und Marshall Lipofuszin aus dem menschlichen Auge und fütterten es an die Passage 4 bis 7 menschlicher primärer RPE-Kulturen, die sowohl von fötalen als auch von älteren menschlichen Spendern stammten20. Obwohl diese Methode innovativ ist, stellt sie eine begrenzte Lipofuszinquelle für wiederholte Experimente dar.

Während wiederholte Fütterungen von OS an RPE-Kulturen in vielen Systemen Lipofuszin produzieren, ist dies in hochdifferenzierten primären RPE-Kulturen nicht der Fall16. Photooxidierendes OS induziert Vernetzungsreaktionen wie die Bildung von Bis-Retinoiden, die auf natürliche Weise während der Lipofuszin-Bildung in vivo auftreten. Dies kann die Bildung von Lipofuscin-ähnlichen Granula in RPE-Kultursystemen beschleunigen, selbst in solchen, die hochdifferenziert und resistent gegen die Akkumulation von Lipofuszin sind16. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Induktion von Lipofuscin-ähnlicher Granulaakkumulation in hochdifferenziertem hfRPE und humanem iPSC-RPE vorgestellt, modifiziert von Wihlmarks veröffentlichtem Protokoll21. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie Lipofuscin-ähnliche Granula induziert, die die gleiche Quelle (Photorezeptor-OS) und den gleichen Signalweg (phagolysosomale OS-Aufnahme) verwenden, wie es bei der Lipofuszinogenese in vivo der Fall ist. Darüber hinaus wird es an humanen RPE-Kulturen durchgeführt, die hochdifferenziert und in mehreren Studien validiert wurden, um humanes RPE in vivo zu replizieren 22,23,24. Diese Lipofuscin-ähnlichen Granulate werden als unverdauliches autofluoreszierendes Material (UAM) bezeichnet und liefern Daten und Diskussionen in diesem Protokoll, in dem UAM mit In-vivo-Lipofuscin verglichen wird. Neben Methoden zum Aufbau und zur Evaluierung von UAM-beladenen Kulturen in hochdifferenzierten humanen RPE wird auch eine aktualisierte Methode zur Beurteilung der RPE-OS-Phagozytose vorgestellt. Es wurden mehrere hervorragende Pulse-Chase-Methoden zur Quantifizierung der OS-Phagozytose eingeführt, darunter Western Blotting, Immunzytochemie und FACS25,26,27. Zu Beginn der Pulsjagd des Betriebssystems können jedoch Bedingungen, die zu einer schlechten Aufnahme des Betriebssystems führen, mit Bedingungen verwechselt werden, die einen schnellen Abbau des internalisierten Betriebssystems fördern. Die hier vorgestellte Methode misst die Gesamtmenge des eingeführten Betriebssystems, die vollständig durch die RPE ("Total Consumptive Capacity") verbraucht/abgebaut wird, und trägt so dazu bei, diese Mehrdeutigkeit zu beseitigen. Es wird erwartet, dass Erkenntnisse über die Toxizität von Lipofuszin unter Verwendung dieser Protokolle, einschließlich der Auswirkungen auf die OS-Phagozytoseraten unter Verwendung der "Total Consumptive Capacity"-Methode, verwendet werden, um die Toxizität von Lipofuszin in vivo zu beleuchten.

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Protocol

Das vorliegende Protokoll, das den Erwerb und die Verwendung von menschlichem Gewebe vorsieht, wurde vom Institutional Review Board der University of Michigan geprüft und genehmigt (HUM00105486).

1. Präparation von photooxidierten äußeren Segmentspitzen und -fragmenten

HINWEIS: Die an Dunkelheit angepasste Rindernetzhaut wurde gekauft und auf Eis versandt (siehe Materialtabelle). Von diesen Netzhäuten wurden die OS nach einem zuvor veröffentlichten Protokollgereinigt 23.

  1. Vernetzung des äußeren Segments mit einer UV-Lampe
    1. Tauchen Sie die mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger (siehe Materialtabelle) 10 Minuten lang vollständig in 70%iges Ethanol in einer Biosicherheitswerkbank ein, um die Objektträger zu sterilisieren. Lassen Sie die Objektträger in einer sterilen 100-mm-Zellkulturschale an der Luft trocknen.
    2. Legen Sie jeden Objektträger in eine neue 100-mm-Zellkulturschale und geben Sie 200 μl serumhaltige Zellkulturmedien (welches Medium auch immer typischerweise für die vorliegenden RPE-Kulturen verwendet wird) in jedes Rechteck und legen Sie dann ein tragbares 254-nm-UV-Licht (siehe Materialtabelle) auf die 100-mm-Zellkulturschale (ohne Deckel) mit dem Kolben direkt zum Objektträger. und 20 Minuten einwirken lassen. Die für diese Studie konkret verwendeten Medien und die spezifischen Produktnummern für die Bestandteile des Mediums wurden bereits veröffentlicht 22,23. Dieses Medium wird in diesem Protokoll als "RPE-Medien" bezeichnet.
      Anmerkungen: Die UV-Behandlung des Mediums blockiert die Glasoberfläche und verhindert, dass das OS bei den nächsten Schritten klebt.
    3. Gefrorene Aliquots von OS bei 37 °C auftauen (in der Hand oder im Wasserbad). Die Menge des benötigten Betriebssystems hängt von der Anwendung ab. Im Allgemeinen kann man bis zu 500 μL von 2 x 108 OS/mL pro Rechteck auf dem Objektträger behandeln.
    4. Nach dem Auftauen das OS bei 2400 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur schleudern. Saugen Sie den Überstand in der Biosicherheitswerkbank sofort mit einer Pipette statt mit einem Vakuum ab, um einen versehentlichen Verlust des Pellets zu vermeiden.
    5. Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit sterilem PBS.
      Anmerkungen: Behalten Sie das Volumen und die erwartete Konzentration im Auge. Wenn Sie z. B. das Pellet aus einem 1-ml-Röhrchen mit 1 x 108 OS/ml mit 500 μl PBS resuspendieren, erhalten Sie 2 x 108 OS/ml. Das maximale Volumen und die maximale Konzentration pro Rechteck auf dem mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger beträgt 500 μl von 2 x 108 OS/ml.
    6. Saugen Sie das Medium von den Objektträgern ab und geben Sie bis zu 500 μl 2 x 108 OS/ml PBS-Lösung auf jedes Rechteck des Objektträgers. Platzieren Sie das tragbare UV-Licht über der Zellkulturschale (ohne Deckel), wobei die Glühbirne direkt zum Betriebssystem zeigt. Setzen Sie die OS-Lösung 40 Minuten lang 254 nm Licht aus.
      Anmerkungen: Decken Sie während der 40-minütigen Exposition die UV-Lampe und die Schüssel mit einem Handtuch oder einem saugfähigen Pad ab, schließen Sie den Flügel der Biosicherheitswerkstatt und schalten Sie das Gebläse aus. Dadurch wird verhindert, dass eine nennenswerte Verdunstung auftritt. Wenn die in diesem Protokoll verwendete UV-Lampe einem Forscher nicht zur Verfügung steht, gibt es zwei Alternativen, um sicherzustellen, dass die angemessene Menge an Vernetzung erreicht wird. Die erste besteht darin, die in Schritt 1.2 beschriebene quantitative UV-Exposition entweder mit der in Schritt 1.2 beschriebenen Vorrichtung oder mit einer anderen Vorrichtung zu befolgen, die die gleiche quantitative Strahlungsexposition wie die in 1.2 beschriebene Vorrichtung liefern kann. Eine andere Alternative besteht darin, das OS für eine gewisse Zeit UV-Bestrahlung auszusetzen, die den Grad der Vernetzung auf der Coomassie-Färbung induziert, der in Abbildung 1C zu sehen ist.
    7. Sammeln Sie die behandelte OS PBS-Lösung in sterilen Mikrozentrifugenröhrchen, waschen Sie das Rechteck des beschichteten Objektträgers erneut mit 200-500 μl PBS (2-3x) und sammeln Sie jede Wäsche im Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn Sie fertig sind, schauen Sie sich den Objektträger unter einem Gewebekulturraummikroskop an, um sicherzustellen, dass fast das gesamte OS aus dem Objektträger entfernt wurde.
    8. Drehen Sie die OS PBS-Lösung bei 2400 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur herunter, saugen Sie das PBS in der Biosicherheitswerkbank mit einer Pipette ab und resuspendieren Sie es in 500-μl-Standardmedien, die für RPE-Kulturen verwendet werden (z. B. "RPE-Medien" im Sinne von Abschnitt 1.1.2). Das Resuspensionsvolumen kann basierend auf der gewünschten Konzentration des photooxidierten OS (OxOS) eingestellt werden.
    9. Geben Sie 10 μl der Suspension in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, verdünnen Sie 50-100x mit mehr Zellkulturmedien und zählen Sie die OS mit einem Hämozytometer.
    10. Basierend auf der Anzahl der Gesamtüberlebenden ist die OxOS-Suspension auf eine endgültige Bestandskonzentration zu verdünnen. Für die Fütterung hochreifer RPE-Kulturen in 24-Well-Transwells (Oberfläche von 0,33cm2; siehe Materialtabelle) wird eine Endmedienkonzentration von 2 x 107 OS/ml empfohlen.
      1. Um dies zu erreichen, verteilen Sie das OxOS in 25-μl-Aliquots mit einer Konzentration von 5,6 x 107 OS/ml, die in Standard-RPE-Nährmedien suspendiert sind. Nach dem Auftauen eines 25-μl-Aliquots wird das gesamte Aliquot mit 45 μl Standard-RPE-Nährmedien gemischt, wobei ein endgültiges Medienvolumen von 70 μl und eine OS-Konzentration von 2 x 107 OS/ml für jede OxOS-Transwell-Fütterung erreicht wird.
    11. Vor der Aliquotierung des OxOS werden phagozytoseüberbrückende Liganden (Protein S und MFG-E8, siehe Materialtabelle) hinzugefügt, die die Aufnahme des OS und die Akkumulation von Lipofuszin erleichtern. Die Arbeitskonzentrationen der verbrückenden Liganden in einem 24-Well-Transwell betragen 4 μg/ml für humanes gereinigtes Protein S und 1,5 μg/ml für humanes rekombinantes MFG-E8. So beträgt für 25 μL Aliquots von OxOS bei 5,6 x 107 OS/ml die Stammkonzentration für Protein S 11,2 μg/ml und für MFG-E8 4,2 μg/ml.
      HINWEIS: Die Brückenligandenkonzentrationen wurden für hfRPE-Kulturen auf 24-Well-Transwells optimiert, mit einer ungefähren Zellzahl von 320.000 Zellen pro 0,33cm2-Well . Möglicherweise müssen die Ligandenkonzentrationen für andere RPE-Typen und Zelldichten angepasst werden, da Liganden, die über die Verfügbarkeit von Phagozytoserezeptoren hinausgehen, paradoxerweise die Aufnahme des OS blockieren können28.
    12. Die Aliquots in flüssigem Stickstoff einfrieren.
      HINWEIS: Mehrfaches Einfrieren und Auftauen wirkt sich sehr nachteilig auf die Integrität des Betriebssystems aus.
  2. Außensegmentvernetzung mit einem UV-Vernetzer
    HINWEIS: Befolgen Sie Schritt 1.1, mit Ausnahme der folgenden Schritte, die die Schritte 1.1.2 bzw. 1.1.6 ersetzen:
    1. (ersetzt Schritt 1.1.2) Legen Sie jeden Objektträger in eine neue 100-mm-Zellkulturschale und geben Sie 200 μl serumhaltige Zellkulturmedien (z. B. -"RPE-Medien" oder einen anderen Ersatz) in jedes Rechteck, legen Sie dann die Objektträger in ein Ultraviolett-Vernetzergerät (siehe Materialtabelle) und behandeln Sie sie mit 254 nm UV bei einer Strahlungsexposition von 3-6 J/cm2 , um die Glasoberfläche zu blockieren und ein Anhaften des OS während der nächsten Schritte zu verhindern.
    2. (ersetzt Schritt 1.1.6) Saugen Sie das Medium von den Objektträgern ab und geben Sie bis zu 500 μl 2 x 108 OS/ml in sterilem PBS auf jedes Rechteck des Objektträgers. Legen Sie die Objektträger in den UV-Vernetzer, stellen Sie die Strahlungsbelichtung nach Bedarf ein (3-9 J/cm2) und behandeln Sie sie bei 254 nm.
      HINWEIS: Die erforderliche Strahlungsexposition kann sorgfältig bestimmt werden, indem die Strahlungsexposition zwischen 3-9 J/cm2 titriert wird, bis der Grad der Autofluoreszenz und der Proteinvernetzung (wie in Abbildung 1B und Abbildung 1C zu sehen) erreicht ist.
      VORSICHT: Der Umgang mit dem Betriebssystem außerhalb einer Biosicherheitswerkbank kann zu einer Kontamination führen. Nachdem Sie das OS dem UV-Vernetzer ausgesetzt haben, sammeln Sie das OS mit sterilen Pipettenspitzen, überführen Sie es in sterile Mikrozentrifugenröhrchen und führen Sie alle weiteren Schritte in der Biosicherheitshaube durch.
  3. Charakterisierung von oxidiertem OS
    1. Quantifizierung des Autofluoreszenz-Emissionsspektrums durch Bildgebung
      1. Geben Sie 20-50 μl Stammlösung aus unbehandeltem OS und OxOS in zwei separate Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 2400 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, Pellet in gepuffertem (z. B. PBS) 4%igem Paraformaldehyd resuspendieren und 15 min bei Raumtemperatur fixieren.
      2. Nach der Fixierung wie oben beschrieben, mit 2 x PBS waschen (zwischen den Wäschen nach unten schleudern) und dann in weniger als 30 μl PBS resuspendieren.
      3. Geben Sie einige Mikroliter der Resuspension auf einen Objektträger, fügen Sie Eindeckmedien (siehe Materialtabelle) und schließlich ein Deckglas hinzu.
      4. Abbildung von OxOS auf einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle).
        HINWEIS: Die OxOS-Autofluoreszenz kann durch einen breiten Bereich von Laserwellenlängen angeregt werden, aber in der Regel wird eine 405-nm- oder 488-nm-Laserlinie verwendet. Die Emission ist ähnlich breit gefächert, aber ein typischer GFP/FITC-Anregungs-/Emissionsfilteraufbau ist ausreichend, um Autofluoreszenz zu betrachten.
      5. Um das OxOS-Emissionsspektrum zu messen, verwenden Sie λ-Scanning an einem konfokalen Mikroskop. Typische λ-Scan-Einstellungen umfassen die Anregung mit 405 nm oder 488 nm und die Detektion von Emissionen, die von 10 nm rotverschoben von der Laseranregungslinie bis zu etwa 800 nm reichen, mit einer λ-Schrittweite von 10 nm. Jedes Mikroskopiesystem hat seine eigenen Anweisungen, wie der λ-Modus zu verwenden ist, und der Leser muss sich auf das Handbuch beziehen, um sein spezifisches Konfokalsystem zu finden.
    2. Alternativ kann die Autofluoreszenz mittels Durchflusszytometrie quantifiziert werden.
      1. 2 x 10 7 unbehandelte OS und separat 2 x 107 OxOS in Mikrozentrifugenröhrchen abschleudern und in 1 ml PBS resuspendieren.
        Anmerkungen: Eine Fixierung ist nicht erforderlich, wenn die Durchflusszytometrie direkt nach dem Auftauen durchgeführt wird.
      2. Laden Sie unbehandelte OS- und OxOS-Proben auf das Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitenstreuung (SSC) im FSC-SSC-Streudiagramm auf eine akzeptable Streuung an. Verwenden Sie PBS als Kontrolle, um kontaminierende kleine Partikel auszuschließen. Beachten Sie, dass Betriebssysteme erheblich kleiner als Zellen sind.
      3. Verwenden Sie den Standard-FITC-Kanal des Durchflusszytometers für die Autofluoreszenzquantifizierung. Zählen Sie mindestens 10.000 Ereignisse. Verwenden Sie den Pulsflächenwert des FITC-Histogramms, um die Fluoreszenzintensität darzustellen.
        HINWEIS: Für die vorliegende Studie werden alle Daten mit einer Durchflusszytometer-Analysesoftware (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.
    3. Beurteilen Sie den Grad der Vernetzung in OxOS
      1. Schleudern Sie 2 x 10 7 unbehandelte OS und separat 2 x 107 OxOS in Mikrozentrifugenröhrchen ab. Entfernen Sie den Überstand und lysieren Sie das Pellet direkt, indem Sie 1,2x Laemmli-Probenpuffer hinzufügen (genug, um es abzudecken; siehe Materialtabelle). Vortex, 30 min bei Raumtemperatur halten, 10 min bei Raumtemperatur gleich oder größer als 12000 x g herunterdrehen und Überstand auffangen.
        HINWEIS: Die Beurteilung des Grades der Proteinvernetzung in OxOS gibt einen Eindruck von der Angemessenheit der UV-Behandlung. Es wird ein Vergleich zwischen unbehandeltem OS und OxOS durchgeführt, und eine adäquate Vernetzung tritt auf, wenn die monomere Rhodopsinbande, die die Coomassie-Färbung dominiert (Abbildung 1C, Pfeil), gerade noch wahrnehmbar ist, wobei Aggregate höherer Ordnung und ein Proteinabstrich an der Oberseite des Gels entstehen.
        VORSICHT: Wenn Sie den Probenpuffer zum Lysieren des OS verwenden, erhitzen Sie die Lyselösung anschließend nicht, da dies eine Rhodopsin-Aggregation auslösen kann. Vermeiden Sie es auch, das lysierte Betriebssystem zu kühlen, bis es für die Lagerung bereit ist, da dies SDS auslöst. Nicht verwendete Lysate können bei -20 °C aufbewahrt werden. Achten Sie beim Wiederauftauen darauf, dass die Lysate vor der Verwendung vollständig bei Raumtemperatur aufgetaut sind.
      2. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit einem Proteinassay, der gegenüber hohen SDS- und Reduktionsmittelkonzentrationen tolerant ist29. In der Materialtabelle finden Sie Vorschläge zu geeigneten Proteinassay-Reagenzien, und befolgen Sie das Herstellerprotokoll für diese Reagenzien.
      3. Führen Sie unbehandelte OS- und OxOS-Proben durch SDS-PAGE-Elektrophorese30 auf einem 4%-15%igen Gradientengel unter Verwendung von Standard-Tris-Glycin-SDS-Puffer durch. Das Gel wird bei 80 V betrieben, bis die Proben in den Stapel gelangen, dann bei 120 V für 50-60 Minuten bei Raumtemperatur.
      4. Färben Sie das Gel mit Coomassie-Blau unter Verwendung der Standardprotokolle31. Die Coomassie-Färbung wird die Angemessenheit der durch die UV-Behandlung induzierten Vernetzung demonstrieren.

2. Aufbau von Lipofuscin-ähnlichen Granula (UAM) in RPE-Kulturen

  1. OxOS-Fütterungen: Menge, Häufigkeit und Phagozytose-überbrückende Liganden
    HINWEIS: Die Fütterung erfolgt an humanen iPSC-RPE- oder hfRPE-Kulturen an Passage 1, die nach dem vom Bharti-Labor (für iPSC-RPE)32 beschriebenen Protokoll oder unserem zuvor skizzierten Protokoll für hfRPE, adaptiert aus dem Sheldon Miller-Labor22, 23, gezüchtet wurden. Alle folgenden Berechnungen basieren auf der Fütterung von OxOS oder OS in ein 24-Well-Transwell (6,5 mm Durchmesser, 0,33cm2 Wachstumsfläche).
    1. Tauen Sie 25 μl von 5,6 x 107 OxOS/ml bei 37 °C auf und fügen Sie dem OxOS-Aliquot 45 μl Zellkulturmedien hinzu, was zu einem Endvolumen von 70 μl führt.
      HINWEIS: Die in Schritt 1 hergestellten OxOS-Aliquots enthalten die Phagozytose-überbrückenden Liganden MFG-E8 und Protein S. Wenn diese Liganden jedoch vor dem Einfrieren nicht zu den Aliquoten hinzugefügt wurden, können sie in diesem Schritt hinzugefügt werden, wodurch sichergestellt wird, dass die Endkonzentration der Liganden in den Medien, die den Zellen zugeführt werden sollen, 4 μg/ml für Protein S und 1,5 μg/ml für MFG-E8 beträgt. Wie in Schritt 1.1.11 beschrieben, müssen die Konzentrationen von Brückenliganden möglicherweise für andere RPE-Typen oder Zelldichten geändert werden.
    2. Entfernen Sie apikales Medium aus dem Transwell und geben Sie 70 μl 2 x 107 OxOS/ml mit den phagozytoseüberbrückenden Liganden in die apikale Kammer. Nach 24 Stunden entfernen und durch eine neue OxOS-Fütterung ersetzen. Die Fütterung erfolgt täglich an Wochentagen und überspringt Wochenenden, bis 20 Fütterungen abgeschlossen sind (~1 Monat). Wechseln Sie basolaterale Zellkulturmedien (400-550 μL) 2-3x/Woche.
    3. Nach Abschluss von 20 Fütterungen ist der normale Medienwechsel für das Bohrloch wieder aufzunehmen.
      HINWEIS: Es sind mehrere zusätzliche Medienwechsel erforderlich, um klebriges OxOS von der apikalen RPE-Oberfläche abzuwaschen, daher müssen Experimente mit den UAM-beladenen Kulturen mindestens 1-2 Wochen nach Abschluss der OxOS-Fütterung durchgeführt werden.
      ACHTUNG: Es ist wichtig, dass der UAM-Aufbau über OxOS-Feedings ordnungsgemäß kontrolliert wird. Da tägliche Medienwechsel die RPE-Biologie beeinflussen können, werden die folgenden Kontrollvertiefungen empfohlen: Kontrolle 1: Ersetzen Sie die Medien täglich an Wochentagen für die gleiche Anzahl von Fütterungen wie die mit OxOS behandelte Gruppe. Kontrolle 2: Füttern Sie RPE unbehandeltes OS täglich an Wochentagen in der gleichen Konzentration und Menge wie OxOS-Fütterungen für die gleiche Anzahl von Fütterungen.
  2. Überwachung der Gesundheit von Kulturen, die mit Lipofuscin-ähnlichen Granula beladen sind, durch transepitheliale elektrische Widerstands- (TEER) und Zelltod-Assays
    HINWEIS: Während und nach der OxOS-Fütterung kann die Gesundheit von RPE-Kulturen gemessen werden, indem die Integrität der RPE-Tight Junctions und der Zelltod bewertet werden. Es wurde bereits gezeigt, dass die Beurteilung der Tight Junction-Integrität durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) ein empfindlicher Marker für die allgemeine Zellgesundheit ist33. Traditionellere nicht-invasive Marker für den Zelltod, wie z. B. die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH), können ebenfalls verwendet werden.
    1. TEER durchführen
      HINWEIS: TEER wird mit einem TEER-Messgerät (Trans epithelial Electric Resistance) und einer TEER-Elektrode getestet, wobei in der Regel den Anweisungen des Herstellers gefolgt wird (siehe Materialtabelle).
      1. Um die TEER-Elektrode zu sterilisieren, verwenden Sie einen in 70 % Ethanol getränkten Abstreifer, um die Elektrode zu reinigen, und tauchen Sie dann die Spitzen der Elektrodensonde 10 Minuten lang in 70 % Ethanol ein.
      2. Lassen Sie die Elektrode vollständig trocknen und tauchen Sie die Elektrode dann in sterile Medien.
      3. Entfernen Sie die Sonde aus dem sterilen Medium und führen Sie die beiden Sonden der TEER-Elektrode in die apikalen und basolateralen Kammern eines kultivierten Transwells ein. Die längere Sondenspitze passt in die basolaterale Kammer.
        HINWEIS: Es ist einfach, den Boden der apikalen Kammer mit der TEER-Elektrode ohne Übung abzukratzen, und ein solches Schaben verändert die TEER-Messwerte dramatisch, wenn die konfluente RPE-Monoschicht gestört wird. Daher wird Anfängern empfohlen, vor dem Testen an experimentellen RPE-Kulturen an unwichtigen Transwells zu üben. Des Weiteren sollte der Experimentator, nachdem jede Platte mit RPE-Kulturen getestet wurde, unter einem Standard-Gewebekulturmikroskop prüfen, ob die RPE-Monoschicht abgekratzt wurde.
      4. Sobald die apikalen und basolateralen Sonden im Transwell angebracht sind, drücken Sie die Lesetaste oder treten Sie auf den Fußschalter des Messgeräts, um den TEER aufzuzeichnen. Waschen Sie die Elektrodensonde zwischen Platten oder Zellgruppen mit sterilen Medien. Wenn eine Infektion ein großes Problem darstellt, sterilisieren Sie es zwischen den Platten erneut.
      5. Berechnen Sie TEER, indem Sie den Widerstandswert vom Messgerät nehmen, den Wert eines leeren Transwells mit Medien, aber ohne Zellen subtrahieren (im Allgemeinen 100-110 Ω für ein 24-Well-Transwell mit einer Oberfläche von 0,33cm2 ) und dann mit der Oberfläche des Transwell multiplizieren.
        HINWEIS: TEER-Werte müssen normalisiert auf die Zelloberfläche gemeldet werden. Typische Werte für gesunde hfRPE-Kulturen liegen zwischen 350 und 1100 Ωcm2. Die TEER-Werte steigen mit sinkender Temperatur. Wenn also Kulturen aus einem 37 °C-Inkubator in eine Raumtemperaturhaube gebracht werden, steigen die TEER-Werte tendenziell über die gesamte Platte an. Um sich vor dieser Variabilität zu schützen, arbeiten Sie entweder schnell (falls vorhanden) oder warten Sie 10-15 Minuten, bis sich die Plattentemperatur mit der Raumtemperatur eingependelt hat.
    2. Führen Sie einen LDH-Freisetzungstest durch
      HINWEIS: Die Freisetzung von LDH in den Zellkulturüberstand erfolgt während des Zelltods und wird mit einem Standardkit gemessen (siehe Materialtabelle).
      1. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wird der Überstand oberhalb der Zellen entnommen und mit Standardmedien auf 1:100 verdünnt.
      2. Induzieren Sie die mögliche Gesamtfreisetzung von LDH, die für die Normalisierung aller Werte aus Schritt 2.2.2.1 wichtig ist, durch Zugabe von 2 μL 10% Triton X-100 zu den 100 μL apikalen Medien aus Kontrollzellen in einem 24-Well-Transwell. Nachdem das Triton/Zell-Überstandsgemisch 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert wurde, mischen Sie das Medium über den nun lysierten Zellen und sammeln Sie, um die mögliche Gesamtfreisetzung von LDH zu messen.
      3. Sobald die Überstände gesammelt wurden, führen Sie den Assay gemäß den Standardanweisungen des Herstellers durch und messen Sie die Lumineszenz nach einer 30-minütigen Inkubation mit der Pufferlösung des Kits.
        HINWEIS: Alle LDH-Werte sind auf die mögliche Gesamtmenge der LDH-Freisetzung normalisiert.
  3. Charakterisierung des lipofuscinartigen Granulaspektrums und der Zusammensetzung
    1. Erfassung von Autofluoreszenzquantifizierung und -spektren
      1. Fixieren Sie UAM-beladene Kulturen mit 4% PFA bei Raumtemperatur für 15 Minuten, gefolgt von einer PBS-Wäsche 5x.
      2. Bewahren Sie eine kleine Menge PBS in der apikalen Kammer auf und drehen Sie das Transwell dann auf den Kopf. Schneiden Sie mit einem Präpariermikroskop und einer Rasierklinge die halbporöse Membran aus dem Transwell und wenden Sie Schneidkraft an der Verbindungsstelle zwischen Membran und Transwell an.
        Anmerkungen: Achten Sie darauf, wie nah der Schnitt an der Lippe des Transwell gemacht wird, da die Transwell-Membran dazu neigt, sich zu verziehen und zu knittern, wenn die Schnitte nicht gleichmäßig sind.
      3. Sobald die Transwell-Membran durchtrennt ist, legen Sie sie sofort mit einer Pinzette auf einen Objektträger, wobei Sie darauf achten sollten, dass Teile der Transwell-Membran nicht mit Zellen berührt werden. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem Task-Tuch und vermeiden Sie es, die Zellen zu berühren. Fügen Sie Eindeckmaterial und ein Deckglas hinzu. Stellen Sie sicher, dass Sie den Überblick behalten, welche Seite des Transwell "mit der rechten Seite nach oben" ist, wenn Sie das Transwell eindecken.
      4. Erfassen Sie die Autofluoreszenzintensität und die Spektren mit den gleichen Einstellungen und Verfahren wie in Schritt 1.3.1.4 und Schritt 1.3.1.5.
        HINWEIS: Bei der Bildgebung von UAM ist ein wichtiger Störfaktor, dass OxOS autofluoreszierend sind und oft tage- und manchmal sogar wochenlang nach Abschluss der OxOS-Fütterung an der apikalen Oberfläche des RPE haften. Daher muss bei der Quantifizierung von UAM eine Methode angewendet werden, um sicherzustellen, dass die gemessene Autofluoreszenz von UAM und nicht von OxOS stammt. Die einfachste Methode ist die Kofärbung von Lipofuszinkulturen mit einem Rhodopsin-Antikörper. Beispielsweise kann der Anti-Rhodopsin-Antikörper 4D2 in einer Verdünnung von 1:1000 und mit einem Standardprotokoll für die PFA-Fixierung der Immunzytochemie34 verwendet werden. Der Sekundärantikörper für Rhodopsin sollte ein dunkelroter Farbstoff-konjugierter Antikörper sein (z.B. mit einem Anregungsmaximum nahe 647 nm), da UAM- und OxOS-Autofluoreszenz in dieser Wellenlänge tendenziell am schwächsten ist. Konfokale Bilder können dann sequentiell in zwei Kanälen aufgenommen werden, wobei die UAM- und OxOS-Autofluoreszenz mit einem 405-nm-Laser und die Emission von 415 nm bis 550 nm angeregt werden, während Rest-Rhodopsin, das auf unverdautes OxOS hinweist, mit Standard-Bildgebungsparametern für den Fernröte-Farbstoff in einem separaten Kanal angeregt werden kann. Nach der Aufnahme kann der Rhodopsinkanal als subtraktive Maske in einem Programm wie ImageJ verwendet werden, um die Autofluoreszenz zu entfernen, die von klebrigem verbleibendem OxOS stammt, so dass nur die UAM-Autofluoreszenz zur Quantifizierung übrig bleibt.
        VORSICHT: Selbst Betriebssysteme, die nicht photooxidiert sind, weisen eine gewisse Autofluoreszenz auf, und selbst bei gründlichem Waschen haften einige Betriebssysteme und OxOS an der RPE-Oberfläche. Ohne die Erzeugung einer subtraktiven Maske mittels Rhodopsin-Immunfärbung, wie im obigen HINWEIS vorgeschlagen, ist eine genaue Quantifizierung der UAM-Autofluoreszenzwerte in Kulturen, die mit OxOs oder Standard-OS gefüttert wurden, nicht möglich.
    2. Gleichzeitige Detektion von Lipofuscin-ähnlichen Granula und anderen Immunfluoreszenzmarkern
      HINWEIS: Wie in Schritt 2.3.1 beschrieben, schränkt das breite Autofluoreszenzspektrum von Lipofuszin die Auswahl für die Fluoreszenz-Co-Färbung ein. Die folgenden Methoden können in Betracht gezogen werden, um die Co-Färbung zu erleichtern.
      1. Verwenden Sie einen dunkelroten Fluorophor. Die Autofluoreszenz von Lipofuszin ist im nahen Infrarot schwach. Daher kann die Verwendung eines dunkelroten Farbstoffs für die Fluoreszenzdetektion eines interessierenden Antigens in Kombination mit sorgfältigen Anpassungen der Kanaleinstellungen an einem konfokalen Mikroskop in der Regel Autofluoreszenz von Co-Färbefluoreszenz unterscheiden.
      2. Nutzen Sie den langen Fluoreszenz-Emissionsschweif von Lipofuscin.
        HINWEIS: Da Lipofuszin ein sehr breites Fluoreszenzemissionsspektrum hat, kann es oft bei einer niedrigen nm-Wellenlänge (z. B. 405-nm-Laser) angeregt werden und die Emission wird immer noch im orange/roten Teil des Spektrums (z. B. 585-635 nm) detektiert. Diese einzigartige Kombination aus Anregungs- und Emissionswellenlängen kann oft um einen anderen Co-färbenden Fluorophor herum zugeschnitten werden.
        1. Detektieren Sie das interessierende Antigen mit einem Fluorophor mit einer maximalen Anregung von etwa 488 nm und einer Emissionsdetektion bei 500-530 nm. Aufbau eines separaten Kanals für die Autofluoreszenzdetektion mit 405 nm Anregung und 585-635 nm Emission. Dieser zweite Kanal detektiert nur UAM, während der erste Kanal das interessierende Antigen plus Lipofuscin detektiert.
        2. Verwenden Sie mit einem Freeware-Programm wie ImageJ diesen zweiten reinen UAM-Kanal als subtraktive Maske, um das UAM-Signal aus dem ersten Kanal zu entfernen (der sowohl das Antigensignal als auch das UAM-Signal enthält).
      3. Nutzen Sie die spektrale Entmischung. Die meisten modernen konfokalen Mikroskope verfügen über eine spektrale Entmischungsoption. Dies ermöglicht es, das Spektrum einer Probe nur mit UAM und einer anderen Probe nur mit dem interessierenden Co-Färbungsfluorophor zu erfassen. Die experimentelle Probe, die sowohl UAM als auch den Co-Färbungs-Fluorophor enthält, kann dann aufgenommen und linearen Entmischungsmethoden unterzogen werden, um zu berechnen, wie viel Prozent des Signals aus Autofluoreszenz im Vergleich zur Co-Färbung stammen.
        HINWEIS: Umfassende Anleitungen zur spektralen Entmischung sind mit den meisten modernen konfokalen Mikroskopen verfügbar.
      4. Nutzen Sie die Bildgebung mit Fluoreszenzlebensdauer. Während das Emissionsspektrum zwischen UAM und einem Co-färbenden Fluorophor von Interesse ähnlich sein kann, ist es wahrscheinlich, dass sich ihre Fluoreszenzlebensdauer erheblich unterscheidet. Im Allgemeinen weist UAM eine kürzere Fluoreszenzlebensdauer auf als die meisten spezifischen Fluorophore. Mit dem Zugang zu einem konfokalen Mikroskop, das eine lebenslange Bildgebung ermöglicht, kann man Fluoreszenzsignale erfassen, um diejenigen zu erkennen, die länger als die typische Lebensdauer von Lipofuszin sind.
        HINWEIS: Im Allgemeinen reduziert die Lebensdauer der Gate-Fluoreszenz bei Signalen, die länger als 2 ns sind, die UAM-Kontamination erheblich, obwohl das Signal dadurch nicht vollständig eliminiert wird.
      5. Verwendung eines Autofluoreszenz-Suppressors. Traditionell wird Sudan Black verwendet, um die Autofluoreszenz vor der spezifischen Immunfluoreszenzfärbung zu löschen35. Mehrere kommerziell erhältliche Autofluoreszenz-Quencher-Produkte berichten, dass sie die Ergebnisse von Sudan Black verbessert haben, und diese Produkte sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die Autofluoreszenzlöschung zerstört natürlich die Fähigkeit, Lipofuscin nachzuweisen.
    3. Bestimmung der Zusammensetzung von Lipofuscin-ähnlichen Granulaten
      1. Beurteilung neutraler Lipide
        1. Fixieren Sie UAM-beladenes RPE und kontrollieren Sie die Vertiefungen (mit unbehandeltem OS gefüttert) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur in 4 % PFA und waschen Sie sie 5x lang mit PBS.
        2. Färbung für neutrale Lipide mit entweder 10 μg/ml Nilrot oder 3,33 μg/ml Bodipy 493/503 in einer 3%igen BSA-PBS-Lösung bei Raumtemperatur für 1 h, gefolgt von Waschen mit PBS für 5 min 3x.
        3. Schneiden Sie Transwell aus und montieren Sie es wie in Schritt 2.3.1.2 und 2.3.1.3 und das Bild. Verwenden Sie im Allgemeinen die folgenden Anregungs- und Emissionsbandbreiten für die Bildgebung: Nilrot - ex 543 nm, em 620-700 nm und Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Beurteilung von verestertem und nicht verestertem Cholesterin
        1. Befolgen Sie Schritt 2.3.3.1.1
        2. Filipin ist ein fluoreszierender Farbstoff, der nicht verestertes Cholesterin, aber kein verestertes Cholesterin erkennt36. Um die Menge an Gesamtcholesterin (nicht verestert und verestert) im UAM zu bestimmen, wird die Probe zunächst mit Cholesterinesterase vorbehandelt, um verestertes Cholesterin in unverestertes Cholesterin umzuwandeln. Behandeln Sie die Zellen mit 20 U/ml Cholesterinesterase in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,2) (siehe Materialtabelle) bei 37 °C für 3,5 h, gefolgt von Waschen mit PBS für 5 min 3x.
        3. Mit 50 μg/ml Filipin (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur 1 h in PBS färben und 3x mit PBS 5 min waschen. Halten Sie die Proben abgedeckt und vor Licht geschützt, da philippinische Photobleichmittel leicht sind.
          HINWEIS: Wenn nur unverestertes Cholesterin quantifiziert werden soll, kann die Cholesterinesterase in Schritt 2.3.3.2.2 übersprungen werden. Wenn die Menge an verestertem Cholesterin quantifiziert werden soll, kann sie aus der Differenz zwischen dem Gesamtcholesterin und dem unveresterten Cholesterin in der Probe abgeleitet werden.
        4. Schneiden Sie Transwell aus und montieren Sie es wie in den Schritten 2.3.1.2 und 2.3.1.3 und das Bild.
          HINWEIS: Bei der Bildgebung von Filipin bleicht es sehr schnell aus. Man muss die Intensität und Dauer der Anregung minimieren und damit rechnen, dass es sogar zu einer gewissen Photobleichung kommen kann, wenn man die Probe durch das Okular betrachtet. Daher sollte man bei der Bildgebung: (1) nach einem geeigneten Bereich für die Aufnahme mit einem anderen Fluoreszenzkanal als dem Filipin-Kanal suchen, (2) Filipin auf einem Weitfeldmikroskop statt mit einem konfokalen Mikroskop abbilden (um die Intensität der Lichtexposition zu begrenzen) und (3) die wiederholte Abbildung eines Bereichs vermeiden. Im Allgemeinen werden die folgenden Anregungs- und Emissionsbandbreiten für die Abbildung von Filipin verwendet - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Bewertung der Auswirkungen von Lipofuscin-ähnlichen Granula auf die RPE-Phagozytose: Gesamtkonsumkapazität

HINWEIS: Die Gründe für die Messung der OS-Phagozytose über das OS-Puls-Only-Protokoll unten werden im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" detailliert beschrieben. Die Methode, die als "Total Consumptive Capacity" bezeichnet wird, vermeidet Unklarheiten über die Effizienz der Phagozytose, die bei herkömmlichen OS-Pulse-Chase-Phagozytose-Assays auftreten können. Die Assays werden auf 24-Well-Transwell-Platten unter Verwendung von 50 μl Medien mit 4 x 106 OS/ml durchgeführt.

  1. Berechnen Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Vertiefungen und tauen Sie dann eine geeignete Menge regulären OS auf, drehen Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2400 x g herunter und resuspendieren Sie sie in Standard-RPE-Zellkulturmedien auf 4 x 106 OS/ml. Fügen Sie überbrückende Liganden hinzu, um die Phagozytoseraten zu erleichtern.
    HINWEIS: Die Endkonzentration der Brückenliganden in den zu fütternden Medien beträgt 4 μg/ml für Protein S und 1,5 μg/ml für MFG-E8. Wie in Schritt 1.1.11 beschrieben, müssen die Konzentrationen von Brückenliganden möglicherweise für andere RPE-Typen oder Zelldichten geändert werden.
  2. Entfernen Sie apikales Medium und fügen Sie 50 μL 4 x 106 OS/ml hinzu, idealerweise mit entsprechenden Konzentrationen an brückenbildenden Liganden.
  3. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von OS (z. B. - 0 h, 1 h, 4 h und 24 h) werden 16,67 μL 4x Laemmli-Probenpuffer mit Proteaseinhibitoren hinzugefügt, um beide Zellen und den darüber liegenden OS-haltigen Überstand zu lysieren. Verwenden Sie eine P-200-Pipette, um die Transwell-Oberfläche zu zerkratzen, und achten Sie darauf, die Transwell-Membran nicht zu durchstechen oder die Membran vom Transwell zu lösen, und sammeln Sie den kombinierten Zellüberstand und das Zelllysat zusammen. Wirbeln, herunterschleudern und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um eine gründliche Denaturierung zu ermöglichen.
    VORSICHT: Trotz der Verwendung von Probenpuffer zur Lyse des OS sollte die Lyselösung anschließend nicht erhitzt werden, da dies eine Rhodopsin-Aggregation auslösen kann. Vermeiden Sie es auch, das lysierte OS bis zur Lagerung abzukühlen, da dies Protein ausfällt. Frieren Sie unbenutzte Lysate bei -20 °C ein und stellen Sie sicher, dass die Lysate vor der Verwendung vollständig aufgetaut sind.
  4. Führen Sie Lysate auf SDS PAGE mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 1.3.3 aus und laden Sie gleiche Mengen an Lysaten pro Well. GAPDH, β-Aktin oder ein anderes Housekeeping-Protein sollten verwendet werden, um die Zellzahl zu normalisieren, da die Phagozytoseraten von der Zellzahl abhängen.
  5. Sondieren Sie Western-Blots mit Antikörpern gegen den N- oder C-Terminus von Rhodopsin. Verwenden Sie die standardmäßigen Western-Blotting-Bedingungen, und Antikörperverdünnungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.
    HINWEIS: Unterhalb des Rhodopsin-Hauptbandes befinden sich mehrere Rhodopsin-Fragmente. Diese Fragmente stellen teilweise verdautes Rhodopsin dar, ein Prozess, der vor der Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom32,33 beginnt. Eine Erhöhung der Anzahl von Rhodopsin-Fragmenten im UAM-beladenen RPE im Vergleich zum Kontroll-RPE könnte auf einen nachgeschalteten Defekt der Phagolysosomenkapazität auf der Ebene der Phagosom-Lysosom-Fusion, der lysosomalen Ansäuerung und/oder der abbauenden Enzymfunktion hinweisen 16,34,35.

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Representative Results

Der Aufbau für die Photooxidation des OS ist in Abbildung 1Ai demonstriert. Die mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger ermöglichen es, ein großes Volumen an OS in Lösung pro offenem Rechteck zu laden, ohne sich auf den Rest des Objektträgers auszubreiten. Der Objektträger mit OS befindet sich in einer sterilen Petrischale mit abgenommenem Deckel, und eine UV-Lampe wird über den Objektträger gelegt, wie in Abbildung 1Aii gezeigt. Alternativ kann der Objektträger in eine UV-Vernetzervorrichtung eingelegt werden, wie in Abbildung 1AIII gezeigt. Nach der Photooxidation nimmt die OS-Autofluoreszenz signifikant zu, wie sowohl durch Mikroskopie als auch durch Durchflusszytometrie beurteilt wird (Abbildung 1B). Der Grad der Proteinvernetzung nach Photooxidation kann mit SDS-PAGE mit einer Coomassie-Färbung beurteilt werden, die als Umwandlung der dominanten Proteinbande (monomeres Rhodopsin) in Aggregate höherer Ordnung und Abstrich dargestellt wird (Abbildung 1C). Der Vergleich der Photooxidation mit einer tragbaren UV-Lampe (Abbildung 1Aii) mit dem UV-Vernetzer (Abbildung 1Aiii) zeigt, dass die tragbare UV-Lampe OxOS mit genauso viel Autofluoreszenz erzeugt wie eine 3 J/cm2-Behandlung mit dem UV-Vernetzer (Abbildung 1B) und genauso viel Proteinvernetzung wie eine 6 J/cm2-Behandlung mit dem UV-Vernetzer (Abbildung 1C)). Wenn die UV-Lampe, die einem Forscher zur Verfügung steht, von der in diesem Protokoll verwendeten abweicht, empfehlen wir, die Belichtungszeit zu titrieren, um einen Grad der Vernetzung zu erreichen, der in der UV-Lampenspur in Abbildung 1C zu sehen ist. Das Autofluoreszenzspektrum von OxOS ist im Vergleich zum Spektrum des unbehandelten OS sowohl in der proteinisolierten Fraktion des OS als auch in der lipidisolierten Fraktion von OS16 leicht blauverschoben.

Das Ausmaß des UAM-Aufbaus in RPE-Kulturen hängt von der Anzahl der OxOS-Fütterungen ab (Abbildung 2A), und 20 Fütterungen über einen Zeitraum von ca. 4 Wochen ergeben eine robuste Menge an UAM-Akkumulation. Um die UAM-Autofluoreszenz von der Autofluoreszenz von Rest-OxOS zu unterscheiden, die auch Tage bis Wochen nach dem Abwaschen an der apikalen Oberfläche des RPE haften bleiben, färben wir mit einem Rhodopsin-Antikörper, der mit einem dunkelroten Farbstoff nachgewiesen wird. Indem wir diesen Rhodopsin-Fluoreszenzkanal als Maske verwenden, können wir die OxOS-Autofluoreszenz vom UAM-Kanal subtrahieren, wodurch sichergestellt wird, dass wir die Autofluoreszenz von UAM nur wirklich quantifizieren16. Unter Verwendung der oben beschriebenen Färbeprotokolle weist akkumuliertes UAM in diesem Modell reichlich neutrale Lipide auf, wie durch Nilrot-Färbung16 bewertet wurde, ähnlich wie natives Lipofuscin. Wir finden jedoch wenig bis gar keine veresterte oder unveresterte Cholesterinansammlung (Abbildung 2B), was mit der fehlenden Cholesterinanreicherung übereinstimmt, die wir in nativem Lipofuszin aus gesunden Augen sehen (Daten nicht gezeigt).

Die Verfolgung von Fluoreszenzmarkern von Interesse gleichzeitig mit Lipofuszin ist aufgrund des sehr breiten Fluoreszenzemissionsspektrums von Lipofuszin schwierig. Im obigen Methodenabschnitt werden verschiedene Methoden beschrieben, um dieses Problem zu lösen. Das in Schritt 2.3.2.1 beschriebene Verfahren macht sich die geringe Autofluoreszenz-Emissionsintensität für Lipofuszin im Fernrot zunutze. In Abbildung 2Ci wird die Kolokalisation von UAM und dem Autophagiemarker LC3 durch Färbung von LC3 mit einem Alexa 647-Farbstoff untersucht. Trotz eines gewissen Durchscheinens von UAM in den LC3-Kanal ist es offensichtlich, wo sich Lipofuszin und LC3 in diesen Bildern befinden. Bei dem in Schritt 2.3.2.2 beschriebenen Verfahren erlauben die sehr langen Fluoreszenzemissionsspektren von Lipofuszin den Entwurf eines Emissionskanals, der nur Fluoreszenz von Lipofuszin enthält. In Abbildung 2Cii wird UAM mit einem 488-nm-Laser angeregt, während die Emission sowohl bei 500-535 nm als auch bei 600-645 nm detektiert wird. Die Probe wird mit LC3 co-gefärbt und mit dem Farbstoff Alexa 488 detektiert. Der Alexa-488-Kanal (Anregung: 488 nm, Emission: 500-535 nm) enthält sowohl LC3- als auch UAM-Signale. Der zweite Kanal mit 488 nm Anregung und 600-645 nm Emission enthält jedoch nur UAM. Dieser zweite Kanal kann als Maske verwendet werden, die auf den Alexa 488/LC3-Kanal angewendet wird, um unerwünschtes UAM-Signal vom LC3-Signal zu subtrahieren. Bei dem in Schritt 2.3.2.4 beschriebenen Verfahren ermöglicht die kürzere Fluoreszenzlebensdauer von autofluoreszierendem Lipofuszin, das Lipofuszin von der Co-Färbefluoreszenz zu unterscheiden. In Abbildung 2Ciii werden alle Fluoreszenzsignale, die vor 2 ns bei einem Photonenzähldetektor ankommen, eliminiert, wodurch ein Großteil des UAM-Autofluoreszenzsignals ausgeblendet wird, während das Co-Färbungssignal von LC3 weitgehend erhalten bleibt. Eine Kombination von Methoden kann erforderlich sein, um Lipofuszin von Co-Färbefluoreszenz zu unterscheiden, wenn eine starke Kolokalisation des Lipofuszins und des Co-färbenden Fluorophors vorliegt.

Da mehrere Studien einen Einfluss der RPE-Lipofuszin-Akkumulation auf die OS-Phagozytoseraten 5,36,37,38,39 postuliert haben, wurde die OS-Phagozytosekapazität in UAM-beladenen Kulturen untersucht. Typische Phagozytose-Assays beinhalten eine kurze Inkubation von Zellen mit OS ("Puls"), gefolgt von einem Abwaschen des ungebundenen OS und dem Austausch von Medien ohne OS für eine "Chase"-Periode. Während der Jagd, wenn OS abgebaut werden, kommt es zu einem Verlust von Rhodopsin, dem am häufigsten vorkommenden Protein im OS, innerhalb des RPE. Zu verschiedenen Zeitpunkten während der Jagd wird das OS-freie Medium entfernt, gefolgt von der Zelllyse und SDS-PAGE für Rhodopsin, das in den RPE-Lysaten verbleibt. Da die OS-Pulsperiode jedoch sowohl aus der Aufnahme als auch aus dem Abbau des OS besteht, können RPE mit hoher Aufnahme und Degradation ("phagozytoseeffiziente" Zellen) zu Beginn der Chase-Periode die gleichen Rhodopsinspiegel aufweisen wie RPE mit geringer Aufnahme und Degradation ("phagozytoseineffiziente" Zellen). Dies wird in der Studie von Zhang et al.23 schematisch dargestellt. Um diese Mehrdeutigkeit zu überwinden, wurde hier ein "Pulse-Only"-Assay verwendet. Bei dieser Methode wird das OS auf RPE gepulst, aber nicht abgewaschen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von OS werden das Medium und das Zelllysat zusammen gesammelt. Das Medium enthält unverdautes OS und das Zelllysat enthält eine Kombination aus intaktem OS auf der Zelloberfläche, teilweise verdautem OS, das internalisiert wurde, und vollständig verdautem OS, das es erfolgreich durch das Lysosom geschafft hat. Zur Kontrolle werden die Zellen dem OS ausgesetzt, aber dann werden das Zelllysat und der OS-haltige Überstand sofort gesammelt. Diese Kontrolle gibt Aufschluss darüber, wie viel Gesamtrhodopsin in die Zellen eingebracht wurde. Da das Lysat plus Überstand an verschiedenen Stellen nach der Einführung des Betriebssystems gesammelt wird, kann man beurteilen, für welchen Anteil des gesamten Rhodopsinsignals verschwunden ist, und dies als Marker für die Menge aller eingeführten/startenden OS verwenden, die jetzt vollständig abgebaut sind. Die Anzeige für diesen Assay wird als "Total Consumptive Capacity" bezeichnet, da sie die gesamte Degradation des Betriebssystems genau misst und nicht den oben beschriebenen verwirrenden Interpretationen eines Pulse-Chase-Experiments unterliegt.

Abbildung 3A und ergänzende Abbildung 1 zeigen einen Western-Blot mit verbleibendem Rhodopsin unter Verwendung des Assays zur Gesamtverbrauchskapazität. Die Menge des OS, die den Zellen zugeführt wird, wird durch die Rhodopsin-Bande bei 0 h gemessen. Die Hauptrhodopsin-Bande wird zwischen den Kontroll- und UAM-beladenen RPE-Proben mit gleicher Effizienz abgebaut (einzelner Pfeil bei 4 h und 24 h). Es gibt jedoch einen Unterschied zwischen den Gruppen, wenn man sich teilweise abgebaute Rhodopsinfragmente ansieht, die unterhalb des Hauptrhodopsinbandes erscheinen. Die Unterschiede in der Fragmenthäufigkeit deuten auf eine reduzierte lysosomale Kapazität in der UAM-Gruppe hin, da proteolytisch gespaltene Rhodopsinfragmente bei normaler lysosomaler Funktion schnell abgebaut werden sollten. Eine erhöhte Abundanz dieser Fragmente ohne erhöhte Abundanz des Hauptrhodopsin-Fragments deutet auf subtilere Defekte in der lysosomalen Abbaukapazität in den UAM-beladenen Kulturen hin. Frühere Studien deuten darauf hin, dass Lipofuszin tatsächlich Defekte in der OS-Phagozytose induzieren kann44, aber keine frühere Studie hat die Auswirkungen von Lipofuszin speziell auf Rhodopsinfragmente untersucht, was eine genauere Bestimmung der Dysfunktion auf die Endstadien des phagolysosomalen Abbaus ermöglicht. Abbildung 3B zeigt das Western-Blot der Rhodopsin-Hauptbande plus Rhodopsin-Fragmente unter Verwendung von zwei verschiedenen Anti-Rhodopsin-Antikörpern. Der Antikörper 4D2 erkennt den N-Terminus von Rhodopsin, und N-terminale Fragmente sind der letzte Teil von Rhodopsin, der im Lysosom abgebaut wird. Im Gegensatz dazu erkennt der Antikörper 1D4 den C-Terminus von Rhodopsin, der bereits vor der Phagosom-Lysosom-Fusion abgebaut wird. Wenn man also versteht, welche Fragmente mit welchem Antikörper färben, erhält man ein Gefühl für Rhodopsin-Verarbeitungsdefekte, die prälysosomal vs. lysosomal sind 32,40,41.

Figure 1
Abbildung 1: Behandlung und Charakterisierung des photooxidierten äußeren Segments (OxOS). (A ) Darstellung des OS auf einem mit Polytetrafluorethylen beschichteten Objektträger ( i), der entweder mit einer 254-nm-UV-Handlampe ( ii ) oder einem UV-Vernetzer (iii) behandelt wurde. (B ) Im Vergleich zum unbehandelten (normalen) OS (RegOS) wies das behandelte OS (OxOS) eine erhöhte Autofluoreszenz auf, wie die konfokale Bildgebung (links) (Maßstabsbalken = 10 μm) und die Durchflusszytometrie (rechts) zeigten. Die Autofluoreszenzintensität von OxOS, das mit der tragbaren UV-Lampe behandelt wurde, war ähnlich wie die mit dem UV-Vernetzer behandelte OS bei einer Strahlungsexposition von 3 J/cm2 (Fehlerbalken = S.E.M.). (C) SDS-PAGE, die die durch UV-Bestrahlung induzierte Vernetzung von OS-Proteinen demonstriert. Die OxOS-Vernetzung über die tragbare UV-Lampe ähnelte der OS-Vernetzung, die mit dem UV-Vernetzer bei einer Strahlungsbelichtung von 6 J/cm2 behandelt wurde. Monomeres Rhodopsin ist mit einem Pfeil markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Bildgebung von OxOS-induzierten Lipofuscin-ähnlichen Granula in hfRPE-Kulturen. (A) Autofluoreszierende Granula (grün), die durch OxOS induziert wurden, akkumulierten nach 20 Fütterungen signifikant mehr als nach 5 Fütterungen. Restliche OxOS-Färbung mit Rhodopsin-Antikörper (magenta). Maßstabsbalken = 10 μm. (B) Die durch OxOS induzierte UAM (grün) war nicht mit freiem Cholesterin oder Cholesterinester angereichert, wie durch Filipinfärbung (rot) festgestellt wurde. Scele-Balken = 10 μm. (C) Bildgebende Verfahren zur Fluoreszenz-Co-Färbung in Gegenwart von Lipofuscin. (i) Verwendung von dunkelrotem Fluorophor (Alexa 647) zur Färbung des Autophagiemarkers LC3 (magenta), wodurch das Durchscheinen von UAM minimiert wird. Reines UAM (grün) abgebildet mit einem standardmäßigen grünen Kanal-Anregungs- und Emissionsfilter-Setup. Maßstabsbalken = 2 μm. (ii) Die Verwendung von ratiometrischer Bildgebung hilft bei der Entschlüsselung der UAM-Autofluoreszenz aus LC3-Färbungen, die mit Alexa 488 markiert sind. Die Anregung beträgt 488 nm, der grüne Kanal-Emissionsbandpass 500-535 nm und der rote Kanal-Emissionsbandpass 600-645 nm. Der rote Kanal kann als subtraktive Maske angewendet werden, um das LC3-Signal vom grünen Kanal zu isolieren. Maßstabsbalken = 5 μm. (iii) Da die Fluoreszenzlebensdauer von Lipofuscin/UAM in der Regel kürzer ist als die spezifischer Farbstoffe, kann die UAM-Autofluoreszenz reduziert werden, indem Fluoreszenzsignale, die in weniger als 2 ns an einem Photonenzähldetektor ankommen, herausgeschnitten werden. Das obere Bild ist ohne Gating. Das untere Bild ist mit Gating, wobei nur Fluoreszenzsignale mit einer Lebensdauer von mehr als 2 ns erhalten bleiben. Es gibt eine größere relative Reduzierung des UAM-Signals im Vergleich zu einem spezifischen LC3-Signal (beschriftet mit Alexa 488) zwischen den oberen und unteren Bildern. Maßstabsbalken = 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: "Total Consumptive Capacity"-Methode zur Messung der OS-Phagozytose. (A) Gesamtes verbleibendes Rhodopsin-Protein sowohl im Zelllysat als auch im Überstand nach Einführung des OS in die RPE-Kultur, wie mittels Western Blot untersucht. Nach Fütterung des regulären OS in 50 μL Medien wurden sowohl das konditionierte Medium/der Überstand als auch die Zellen nach 0, 4 und 24 h zusammen lysiert. Der 0-h-Zeitpunkt dient als Kontrolle, der die Gesamtmenge des Betriebssystems angibt, das jedem Transwell zugeführt wird. Die intakte Rhodopsin-Bande (einzelner Pfeil) unterschied sich nicht zwischen Kontroll- und UAM-beladenen RPE-Zellen, was auf keinen großen Effekt von UAM auf die RPE-Phagozytose hindeutet. Die Spaltprodukte von Rhodopsin, die durch die Doppelpfeile angezeigt werden, waren jedoch in der UAM-Gruppe höher, was auf eine leichte degradative Dysfunktion im phagolysosomalen System hindeutet. Gleiche GAPDH-Werte deuten darauf hin, dass die Zellzahl zwischen den Vertiefungen, die die Phagozytoseraten beeinflussen kann, gleich war. (B) Verschiedene Rhodopsin-Antikörper erkennen unterschiedliche Abbaufragmente. 4D2 erkennt den N-Terminus von Rhodopsin, der bis zu den letzten Schritten des lysosomalen Abbaus intakt ist. Die Fragmente, die er erkennt, sind daher klein (Doppelpfeile). Im Gegensatz dazu erkennt 1D4 den C-Terminus von Rhodopsin, der früher im phagolysosomalen Prozess abgebaut wird. Dieser Antikörper erkennt also Rhodopsin-Fragmente mit höherem Molekulargewicht (Doppelpfeile). Beide Antikörper erkennen intaktes Rhodopsin (einzelner Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Unbearbeiteter Blot entsprechend Abbildung 3A. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Während RPE-Lipofuszin seit Jahrzehnten untersucht wird, ist seine Toxizität umstritten 2,9,16,42. Angesichts der Unklarheit über die Toxizität von Lipofuszin aus Tiermodellen11 sind In-vitro-Modelle mit humanem RPE wertvoll. Es wurde eine Reihe von In-vitro-Lipofuszin-Akkumulationsmodellen beschrieben, aber keines hat sowohl OS-Fütterung als auch hochreife und differenzierte humane RPE-Kulturen verwendet. Diese Kombination stellt ein ideales Modell dar, da die OS-Fütterung die Methode zur Lipofuszin-Akkumulation in vivo rekapituliert und hochreife humane RPE-Kulturen das RPE-Verhalten in vivo am besten replizieren. Interessanterweise wurde bei der Verwendung hochdifferenzierter hfRPE-Kulturen festgestellt, dass die routinemäßige OS-Exposition nicht ausreichte, um Lipofuscin-ähnliches Material zu induzieren, selbst nach wiederholten Fütterungen16. Somit beschleunigt dieses Protokoll den Lipofuszin-Akkumulationsprozess, indem es OS (OxOS) auf kontrollierte Weise photooxidiert. Die Verfütterung von OxOS sowohl an humane iPSC-RPE- als auch an hfRPE-Kulturen führte zu einer robusten Akkumulation von Lipofuscin-ähnlichen Granula, die als unverdauliches autofluoreszierendes Material (UAM) bezeichnet wird. Die UAM-Akkumulation ermöglicht die Modellierung von Lipofuszin in Kultursystemen, die gesundes menschliches RPE in vivo nachahmen 22,23,29,43,44. Sowohl in einer früheren Veröffentlichung als auch in dieser Studie zeigt eine umfassende Charakterisierung von UAM im Vergleich zu nativem Lipofuszin von gesunden älteren Erwachsenen sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschiede. UAM ahmt die Ultrastruktur von Lipofuszin in vivo nach, einschließlich der Tendenz, dass Lipofuszin-Granulate mit Melanin-Granulaten zu Melanolipofuszin16 verschmelzen. Sowohl UAM als auch Lipofuszin enthalten erhebliche neutrale Lipide, kein Rhodopsin und keine signifikante Anreicherung von Cholesterin (Abbildung 2A,B aus unserer früheren Veröffentlichung16, Abbildung 2A,B oben und unveröffentlichte Daten). Wir verglichen auch die Größe und das Spektrum der nativen Lipofuszin-Granula mit denen von UAM (Abbildung 3 aus unserer früheren Veröffentlichung16). UAM-Granulate sind im Vergleich zu nativem Lipofuscin zunächst etwas größer und blauverschoben, aber über signifikante Zeiträume in Kultur verdichten sich die UAM zu einer kleineren Größe und Rotverschiebung in ihrem Emissionsspektrum und werden dem Größen- und Spektrenprofil von nativem Lipofuscin viel ähnlicher.

Das OxOS UAM-Modell wurde für eine Reihe von Anwendungen verwendet, einschließlich der Auswirkungen von Autophagie-Induktoren auf die Verhinderung und Entfernung von Lipofuszin-Granula50 und der Auswirkungen von Lipofuszin auf die RPE-Polarität und den Stoffwechsel16. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Granula in kultiviertem RPE mehr als ein Jahr lang persistieren, was es ermöglicht, die Entwicklung von Lipofuszin-Spektren, Morphologie und Verhalten über längere Zeiträume zu untersuchen16. Weitere Anwendungen für das Modell sind die Untersuchung der Lipofuszin-Akkumulation bei der Komplementaktivierung51, der lysosomalen Stabilität und Entzündungsreaktionen 52 sowie der mitochondrialen Kompromittierung53.

Dieses Protokoll besteht aus einigen wichtigen Schritten. Zunächst müssen RPE-Kulturen hochdifferenziert und ausgereift sein. Die OxOS-Fütterung sollte erst beginnen, nachdem RPE mindestens 8 Wochen lang auf Transwells behandelt wurde und alle Eigenschaften erhalten hat, die für hochreifes RPE charakteristisch sind (die von Finnemann et al. ausgearbeiteten 5 'P's - polygonal in der Morphologie, postmitotisch, pigmentiert, polarisiert und phagozytisch54). Zweitens sind OS sehr zerbrechlich und sollten beim Pipettieren mit Vorsicht behandelt werden. Übermäßiges Pipettieren oder Einfrieren und Auftauen brechen das OS auseinander. Schließlich ist das Verhältnis von OS zu Gesamt-UV-Flux-Exposition entscheidend für die Erzeugung von OxOS, die intakt bleiben, aber dennoch UAM induzieren können. Dieses Verhältnis wurde in diesem Protokoll verfeinert. Zu viel UV-Licht für eine bestimmte Anzahl von Betriebssystemen verursacht eine übermäßige Vernetzung und zerstört kritische chemische Strukturen im Betriebssystem. Zu wenig UV-Licht für eine bestimmte Anzahl von Betriebssystemen wird UAM in Kultur nicht induzieren.

Modifikationen des Protokolls beinhalten hauptsächlich die Änderung der OxOS-Fütterungsdauer oder -konzentration. Empirisch ergeben 20 Fütterungen über einen Zeitraum von ca. 4 Wochen eine robuste Menge an UAM-Akkumulation. Darüber hinausgehende Fütterungen können schrittweise zur UAM-Akkumulation beitragen, während weniger Fütterungen wahrscheinlich nur sporadische UAM-Akkumulation verursachen. Die Anzahl der Fütterungen kann je nach Zweck, Bedarf und Ressourcen des Experiments und des Experimentators angepasst werden. In weniger differenzierten RPE-Kulturen (höhere Passagenzahl, Zelllinien oder Kulturen, die epithelial-mesenchymale Übergangseigenschaften aufweisen) sind weniger Fütterungen und niedrigere OxOS-Konzentrationen für eine robuste UAM-Induktion erforderlich.

Das Protokoll weist mehrere Einschränkungen auf. Die Verwendung einer tragbaren UV-Lampe zur Photooxidation des OS verhindert eine genaue Quantifizierung der gesamten Strahlungsexposition, die an OS abgegeben wird. Die Photooxidation des OS mit der Handlampe wurde in dieser Studie jedoch mit einem viel teureren (aber quantitativen) UV-Vernetzer in Abbildung 1 korreliert, um Parameter für die Strahlenexposition zu liefern. Es wird empfohlen, dass die Experimentatoren die Dauer der UV-Exposition ändern, bis das Crosslinking/Rhodopsin-Schmiermuster das in der UV-Lampensäule des Western-Blots in Abbildung 1C nachahmt.

Eine zweite Einschränkung der Methode besteht darin, dass ihr wahrscheinlich viele der Merkmale der Lipofuszin-Akkumulation in vivo fehlen. Tatsächlich werden die Lipofuscin-ähnlichen Granulate in diesem Protokoll als unverdauliches autofluroeszentes Material (UAM) bezeichnet, um diese Unterscheidung zu verdeutlichen. Das photooxidierende OS rekapituliert einen Teil der natürlichen chemischen Vernetzung, die in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren in Krankheitszuständen stattfindet, aber die Vernetzung ist im UAM-Modell stark beschleunigt und wahrscheinlich unspezifischer. Darüber hinaus stellt das UAM-Modell trotz fast einmonatiger OxOS-Fütterung immer noch eine "akute" Exposition gegenüber Lipofuscin-induzierendem OS dar, verglichen mit den Jahrzehnten, die es dauert, bis sich Lipofuszin beim Menschen anreichert. Bei längerer Akkumulation von Lipofuszin in Kultur kann es zu weniger phänotypischen Effekten kommen. Da UAM-Granulate jedoch mehr als ein Jahr in dem hier vorgestellten Kultursystem verbleiben, besteht die Möglichkeit, ihre langfristigen Auswirkungen auf die Gesundheit von RPEzu untersuchen 16.

Eine Einschränkung der hier vorgestellten "Total Consumptive Capacity"-Methode zur Beurteilung der RPE-Phagozytosekapazität besteht darin, dass nicht unterschieden werden kann, ob Phagozytosedefekte auf die Bindung des Betriebssystems oder auf die Aufnahme oder den Abbau zurückzuführen sind. Wenn das Ziel des Phagozytose-Assays ein mechanistischer Einblick in die Dysfunktion bestimmter Schritte des Phagozytose-Prozesses ist, sind herkömmliche OS-Pulse-Chase-Assays besser geeignet. Die Messung der "Gesamtverbrauchskapazität" sollte verwendet werden, wenn das Ziel lediglich darin besteht, die OS-Phagozytosekompetenz der RPE-Kultur unter Kontrolle im Vergleich zu experimentellen Bedingungen eindeutig zu messen.

Zusammenfassend wird ein Protokoll für die Lipofuscin-ähnliche Granulaakkumulation in hochdifferenzierten humanen RPE-Kulturen vorgestellt. Diese Methode führt den physiologischen Prozess der Lipofuszin-Akkumulation - wiederholte Fütterung von photooxidiertem OS - mit RPE-Kulturmodellen zusammen, von denen in wiederholten Studien gezeigt wurde, dass sie humanes RPE in vivo stark rekapitulieren. Die resultierenden Kulturen, die mit Lipofuscin-ähnlichen Granulaten beladen sind, können für unzählige Anwendungen verwendet werden, die von der Bewertung der Auswirkungen von Lipofuszin auf die RPE-Biologie bis hin zu Tests von kleinen Molekülen, Genen und Signalwegen, die für die Modulation der Lipofuszin-Akkumulation wichtig sind, reichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse der Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), von Fight for Sight (FFS) und der International Retinal Research Foundation (IRRF) unterstützt. J.M.L.M. wird derzeit durch ein K08-Stipendium des National Eye Institute (EY033420) unterstützt. Für die HFT-Forschung wurden keine Bundesmittel verwendet. Weitere Unterstützung kommt von der James Grosfeld Initiative for Dry AMD und den folgenden privaten Spendern: Barbara Dunn und Dee &; Dickson Brown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

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References

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Biologie Heft 194 Lipofuscin Retinales Pigmentepithel (RPE) Photorezeptorspitzen oder -fragmente (OS) Phagozytose Morbus Stargardt Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) Unverdauliches Autofluoreszenzmaterial (UAM)
Verbesserte Lipofuszin-Modelle und Quantifizierung der Phagozytosekapazität des äußeren Segments in hochpolarisierten humanen retinalen Pigmentepithelkulturen
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Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

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