Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Dit protocol beschrijft een lipofuscine accumulatiemodel in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheel (RPE) culturen en een verbeterde buitensegment (OS) fagocytosetest om het totale OS-verbruik / degradatievermogen van de RPE te detecteren. Deze methoden overwinnen de beperkingen van eerdere lipofuscinemodellen en klassieke pulse-chase buitenste segment fagocytose-assays.

Abstract

De dagelijkse fagocytose van fotoreceptor buitenste segmenten door het retinale pigmentepitheel (RPE) draagt bij aan de accumulatie van een intracellulair verouderingspigment genaamd lipofuscine. De toxiciteit van lipofuscine is goed ingeburgerd bij de ziekte van Stargardt, de meest voorkomende erfelijke retinale degeneratie, maar is meer controversieel bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid in de ontwikkelde wereld. Het bepalen van lipofuscine toxiciteit bij mensen is moeilijk geweest, en diermodellen van Stargardt's hebben beperkte toxiciteit. In vitro modellen die menselijke RPE in vivo nabootsen, zijn dus nodig om de generatie, klaring en toxiciteit van lipofuscine beter te begrijpen. De meeste celkweek-lipofuscinemodellen tot nu toe waren in cellijnen of hadden betrekking op het voeden van RPE met een enkel onderdeel van het complexe lipofuscinemengsel in plaats van fragmenten / tips van het hele buitenste segment van de fotoreceptor, wat een completer en fysiologischer lipofuscinemodel genereert. Hier wordt een methode beschreven om de accumulatie van lipofuscine-achtig materiaal (onverteerbaar autofluorescentiemateriaal of UAM genoemd) te induceren in sterk gedifferentieerde primaire menselijke prenatale RPE (hfRPE) en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) afgeleide RPE. UAM geaccumuleerd in culturen door herhaalde voedingen van met ultraviolet licht behandelde OS-fragmenten die door de RPE via fagocytose worden opgenomen. De belangrijkste manieren waarop UAM in vivo lipofuscine benadert en verschilt, worden ook besproken. Bij dit model van lipofuscine-achtige accumulatie worden beeldvormingsmethoden geïntroduceerd om het brede autofluorescentiespectrum van UAM-korrels te onderscheiden van gelijktijdige antilichaamkleuring. Ten slotte is, om de impact van UAM op de RPE-fagocytosecapaciteit te beoordelen, een nieuwe methode geïntroduceerd voor het kwantificeren van de opname en afbraak van fragmenten in het buitenste segment/tips. Deze methode, die "Total Consumptive Capacity" wordt genoemd, overwint mogelijke verkeerde interpretaties van RPE-fagocytosecapaciteit die inherent zijn aan klassieke "pulse-chase" -testen in het buitenste segment. De hier geïntroduceerde modellen en technieken kunnen worden gebruikt om lipofuscinegeneratie- en klaringsroutes en vermeende toxiciteit te bestuderen.

Introduction

Het retinale pigmentepitheel (RPE) biedt kritische ondersteuning voor bovenliggende fotoreceptoren, inclusief de dagelijkse opname en afbraak van fotoreceptor buitenste segmentpunten of fragmenten (in dit protocol staat de afkorting OS voor OS-tips of fragmenten in plaats van hele buitenste segmenten). Deze dagelijkse opname in de post-mitotische RPE overbelast uiteindelijk de fagolysosomale capaciteit en leidt tot de opbouw van onverteerbaar, autofluorescerend intracellulair materiaal, lipofuscine genaamd. Interessant is dat verschillende studies ook hebben aangetoond dat RPE-lipofuscine zich kan ophopen zonder OS-fagocytose 1,2. Lipofuscine heeft veel componenten, waaronder cross-linked adducten afgeleid van visuele cyclus retinoïden, en kan bijna 20% van het RPE-celvolume innemen voor mensen ouder dan 80 jaar3.

Of lipofuscine giftig is, is fel bediscussieerd. De ziekte van Stargardt is een autosomaal recessieve degeneratie van de fotoreceptoren en RPE waarbij een mutatie in ABCA4 een onjuiste verwerking van visuele cyclus retinoïden in de buitenste segmenten van de fotoreceptor veroorzaakt. Onjuiste retinoïde verwerking leidt tot afwijkende cross-linking en vorming van bis-retinoïde soorten, waaronder de bis-retinoïde N-retinylideen-N-retinylethanolamine (A2E). Studies hebben meerdere mechanismen voor A2E-toxiciteit 4,5 aangetoond. Lipofuscine draagt bij aan fundus autofluorescentiesignalen tijdens klinische beeldvorming, en zowel de patiënten van Stargardt als de diermodellen vertonen een verhoogde fundus autofluorescentie voorafgaand aan retinale degeneratie, wat een correlatie suggereert tussen lipofuscinespiegels en toxiciteit 6,7. Met de leeftijd hoopt lipofuscine zich echter op bij alle mensen zonder een RPE-degeneratie te veroorzaken. Verder, in leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), waar RPE-degeneratie alleen voorkomt bij oudere patiënten, hebben degenen met vroege en intermediaire vormen van de ziekte minder fundus autofluorescentiesignalen dan leeftijdsgematchte niet-zieke mensen8. Deze klinische bevindingen zijn geverifieerd op histologisch niveauen 9,10.

Diermodellen van RPE lipofuscine accumulatie hebben ook enige onduidelijkheid over lipofuscine toxiciteit gelaten. De ABCA4 knock-out muis geeft geen retinale degeneratie weer op een gepigmenteerde achtergrond, terwijl dit wel het geval is op een albino achtergrond of bij blootstelling aan blauw licht11,12. Verder verschilt de toxiciteit van lipofuscine afgeleid via ABCA4 knock-out waarschijnlijk van de langzamer accumulerende lipofuscine die optreedt bij natuurlijke veroudering, zoals gezien in AMD13.

In vitro modellen van lipofuscine accumulatie bieden een alternatief voor het bestuderen van de effecten van lipofuscine accumulatie op RPE gezondheid. Dergelijke modellen maken het mogelijk om lipofuscinecomponenten te manipuleren, van het voeden van enkele retinoïde componenten tot het voeden van OS, en maken onderzoek mogelijk in menselijke in plaats van dierlijke RPE. In de afgelopen decennia zijn er meerdere methoden ontwikkeld om RPE lipofuscine in cultuur te modelleren. Samen met andere groepen voedde de groep van Dr. Boulton dagelijks runder-OS gedurende maximaal drie maanden op passage 4 tot 7 menselijke primaire RPE-cellen van donoren van 4 tot 85 jaar oud14. Als alternatief heeft remming van autofagie ook geleid tot lipofuscineaccumulatie in passages 3 tot 7 primaire menselijke RPE-culturen15. Subletale lysosomale remming in sterk gedifferentieerde, passage 1, primaire humane prenatale RPE (hfRPE) culturen slaagde er echter niet in lipofuscine te induceren, zelfs niet met de herhaalde toevoeging van OS op dagelijkse basis16.

Als een meer reductionistische benadering hebben anderen enkele lipofuscinecomponenten aan culturen gevoerd, met name de bis-retinoïde A2E 4,17. Dergelijke studies zijn waardevol omdat ze potentiële directe mechanismen van toxiciteit voor individuele lipofuscinecomponenten definiëren, die bijvoorbeeld lysosomale cholesterol en ceramidehomeostase impliceren18. Tegelijkertijd is er discussie over de toxiciteit van A2E19, en het rechtstreeks aan cellen voeren omzeilt de typische route voor lipofuscine-accumulatie, waarbij fagocytose van fotoreceptor OS betrokken is. In een poging om alle componenten van lipofuscine aan RPE-culturen te leveren, zuiverden Boulton en Marshall lipofuscine uit menselijke ogen en voedden dit aan passage 4 tot 7 menselijke primaire RPE-culturen afgeleid van zowel foetale als oudere menselijke donoren20. Hoewel innovatief, vertegenwoordigt deze methode een beperkte lipofuscinebron voor herhaalde experimenten.

Hoewel herhaalde voedingen van OS aan RPE-culturen lipofuscine produceren in veel systemen, lukt dit niet in sterk gedifferentieerde primaire RPE-culturen16. Foto-oxiderend OS induceert cross-linking reacties zoals bis-retinoïde vorming die van nature optreedt tijdens lipofuscinevorming in vivo. Dit kan de vorming van lipofuscine-achtige korrels in RPE-kweeksystemen versnellen, zelfs die welke sterk gedifferentieerd zijn en resistent zijn tegen lipofuscine-accumulatie16. Hier wordt een methode geïntroduceerd om lipofuscine-achtige korrelaccumulatie te induceren in sterk gedifferentieerde hfRPE en menselijke iPSC-RPE, aangepast van Wihlmark's gepubliceerde protocol21. Deze methode heeft het voordeel dat lipofuscine-achtige korrels worden geïnduceerd die dezelfde bron (fotoreceptor OS) en route (fagolysosomale OS-opname) gebruiken als voor lipofuscinogenese in vivo. Verder wordt het gedaan op menselijke RPE-culturen die sterk gedifferentieerd en gevalideerd zijn in meerdere studies om menselijke RPE in vivo te repliceren 22,23,24. Deze lipofuscine-achtige korrels worden onverteerbaar autofluorescent materiaal (UAM) genoemd en bieden gegevens en discussie in dit protocol waarin UAM wordt vergeleken met in vivo lipofuscine. Samen met methoden voor het bouwen en evalueren van met UAM beladen culturen in sterk gedifferentieerde menselijke RPE, wordt ook een bijgewerkte methode geïntroduceerd om RPE OS-fagocytose te beoordelen. Er zijn meerdere uitstekende puls-chase methoden geïntroduceerd voor het kwantificeren van OS fagocytose, waaronder Western blotting, immunocytochemie en FACS25,26,27. Vroeg in de OS-puls-chase kunnen omstandigheden die leiden tot een slechte os-opname echter worden samengevoegd met omstandigheden die een snelle degradatie van geïnternaliseerd besturingssysteem bevorderen. De hier gepresenteerde methode meet de totale hoeveelheid geïntroduceerd besturingssysteem die volledig wordt verbruikt / afgebroken door de RPE ("Total Consumptive Capacity"), waardoor deze ambiguïteit wordt geëlimineerd. Er wordt verwacht dat inzichten over lipofuscinetoxiciteit met behulp van deze protocollen, inclusief effecten op OS-fagocytosesnelheden met behulp van de "Total Consumptive Capacity" -methode, zullen worden gebruikt om licht te werpen op de toxiciteit van lipofuscine in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het huidige protocol met betrekking tot de verwerving en het gebruik van menselijk weefsel werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Michigan (HUM00105486).

1. Bereiding van foto-geoxideerde buitenste segmentpunten en fragmenten

OPMERKING: Aan het donker aangepaste netvliezen van runderen werden gekocht en op ijs verzonden (zie materiaaltabel). Van deze netvliezen werden OS gezuiverd volgens een eerder gepubliceerd protocol23.

  1. Buitenste segment cross-linking met een UV-lamp
    1. Dompel polytetrafluorethyleen-gecoate dia's (zie materiaaltabel) volledig onder in 70% ethanol gedurende 10 minuten in een bioveiligheidskast om de dia's te steriliseren. Laat de glaasjes aan de lucht drogen in een steriele celkweekschaal van 100 mm.
    2. Plaats elke dia in een nieuwe celkweekschaal van 100 mm en voeg 200 μl serumbevattende celkweekmedia (ongeacht het medium dat gewoonlijk wordt gebruikt voor de RPE-culturen bij de hand) toe aan elke rechthoek en plaats vervolgens een handheld 254 nm UV-licht (zie materiaaltabel) op de 100 mm celkweekschaal (zonder deksel) met een lamp direct naar de dia gericht, en belicht gedurende 20 min. De media die specifiek voor deze studie zijn gebruikt en de specifieke productnummers voor de componenten van de media zijn eerder gepubliceerd22,23. Deze media wordt in dit protocol "RPE-media" genoemd.
      OPMERKING: UV-behandeling van de media blokkeert het glasoppervlak en voorkomt dat het besturingssysteem blijft plakken tijdens de volgende stappen.
    3. Ontdooi bevroren aliquots OS bij 37 °C (in de hand of via een waterbad). De hoeveelheid besturingssysteem die nodig is, is afhankelijk van de toepassing. Over het algemeen kan men tot 500 μL van 2 x 108 OS/ml per rechthoek op de dia behandelen.
    4. Eenmaal ontdooid, draait u het besturingssysteem op 2400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het supernatant onmiddellijk op in de bioveiligheidskast met behulp van een pipet in plaats van een vacuüm om onbedoeld verlies van de pellet te voorkomen.
    5. Resuspendeer de pellet voorzichtig met steriele PBS.
      OPMERKING: Houd het geresuspendeerde volume en de verwachte concentratie bij. Bijv. het resuspenderen van de pellet uit een buis van 1 ml van 1 x 10 8 OS/ml met 500 μL PBS levert 2 x 108 OS/ml op. Het maximale volume en de maximale concentratie per rechthoek op de met polytetrafluorethyleen gecoate dia is 500 μL van 2 x 108 OS/ml.
    6. Zuig de media van de dia's en plaats tot 500 μL 2 x 108 OS/ml PBS-oplossing op elke rechthoek van de dia. Plaats het handheld UV-licht boven de celkweekschaal (zonder deksel) met de lamp direct naar het besturingssysteem gericht. Stel de OS-oplossing gedurende 40 minuten bloot aan 254 nm licht.
      OPMERKING: Bedek tijdens de blootstelling van 40 minuten de UV-lamp en de schotel met een handdoek of absorberend kussen, sluit de vleugel van de bioveiligheidskast en schakel de blower uit. Dit voorkomt significante verdamping. Als de UV-lamp die in dit protocol wordt gebruikt niet beschikbaar is voor een onderzoeker, zijn er twee alternatieven om ervoor te zorgen dat de juiste hoeveelheid cross-linking wordt bereikt. De eerste is om de kwantitatieve UV-blootstelling te volgen die wordt beschreven in stap 1.2, hetzij met het apparaat dat wordt beschreven in stap 1.2, hetzij met een ander apparaat dat dezelfde kwantitatieve stralingsblootstelling kan bieden als het genoemde apparaat in 1.2. Een ander alternatief is om OS bloot te stellen aan UV-straling gedurende een tijd die de mate van cross-linking op de Coomassie-vlek induceert die te zien is in figuur 1C.
    7. Verzamel de behandelde OS PBS-oplossing in steriele microcentrifugebuizen, was de rechthoek van de gecoate dia opnieuw met 200-500 μL PBS (2-3x) en verzamel elke wasbeurt in de microcentrifugebuis. Als u klaar bent, bekijkt u de dia onder een microscoop van een weefselkweekruimte om te bevestigen dat bijna alle besturingssystemen van de dia zijn verwijderd.
    8. Draai de OS PBS-oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 2400 x g , zuig de PBS in de bioveiligheidskast af met een pipettor en resuspensie in standaardmedia van 500 μL die zullen worden gebruikt voor RPE-culturen (bijv. "RPE-media" zoals gedefinieerd in paragraaf 1.1.2). Het resuspensievolume kan worden aangepast op basis van de gewenste foto-geoxideerde OS (OxOS) concentratie.
    9. Plaats 10 μL van de suspensie in een nieuwe microcentrifugebuis, verdun 50-100x met meer celkweekmedia en tel OS's met een hemocytometer.
    10. Verdun op basis van de OS-telling de OxOS-suspensie tot een uiteindelijke voorraadconcentratie. Voor het voeren van hoogrijpe RPE-culturen in 24-well Transwells (oppervlakte van 0,33 cm 2; zie materiaaltabel) wordt een uiteindelijke mediaconcentratie van2 x 107 OS/ml aanbevolen.
      1. Om dit te bereiken, verdeelt u de OxOS in 25 μL aliquots met een concentratie van 5,6 x 107 OS / ml, gesuspendeerd in standaard RPE-kweekmedia. Na het ontdooien van een aliquot van 25 μL, mengt u het gehele aliquot met 45 μL standaard RPE-kweekmedia, wat een eindmediavolume van 70 μL en een OS-concentratie van 2 x 107 OS/ml oplevert voor elke OxOS Transwell-voeding.
    11. Voordat u de OxOS aliquoteert, voegt u fagocytose-overbruggingsliganden toe (Protein S en MFG-E8, zie tabel met materialen), die de opname van OS en de accumulatie van lipofuscine vergemakkelijken. De werkconcentraties van overbruggingsliganden in een 24-well Transwell zijn 4 μg/ml voor menselijk gezuiverd proteïne S en 1,5 μg/ml voor humaan recombinant MFG-E8. Dus, voor 25 μL aliquots van OxOS bij 5,6 x 107 OS / ml, is de voorraadconcentratie voor Protein S 11,2 μg / ml en voor MFG-E8 is 4,2 μg / ml.
      OPMERKING: De overbruggingsligandconcentraties werden geoptimaliseerd voor hfRPE-culturen op 24-well Transwells, met een geschat celgetal van 320.000 cellen per 0,33 cm2-put . Liganconcentraties moeten mogelijk worden aangepast voor andere RPE-typen en celdichtheden, omdat liganden die meer aanwezig zijn dan de beschikbaarheid van fagocytosereceptoren paradoxaal genoeg de opname van OS kunnen blokkeren28.
    12. Vries de aliquots in vloeibare stikstof in.
      OPMERKING: Meerdere vries-dooien zijn zeer schadelijk voor de integriteit van het besturingssysteem.
  2. Crosslinking van het buitenste segment met een UV-crosslinker-apparaat
    OPMERKING: Volg stap 1.1, met uitzondering van de onderstaande stappen, die respectievelijk stap 1.1.2 en 1.1.6 vervangen:
    1. (vervangt stap 1.1.2) Plaats elke dia in een nieuwe celkweekschaal van 100 mm en voeg 200 μl serumbevattende celkweekmedia (bijv. "RPE-media" of een ander substituut) toe aan elke rechthoek, plaats vervolgens dia's in een ultraviolet Crosslinker-apparaat (zie materiaaltabel), behandel met 254 nm UV bij een stralingsblootstelling van 3-6 J / cm2 om het glasoppervlak te blokkeren en te voorkomen dat het besturingssysteem tijdens de volgende stappen blijft plakken.
    2. (vervangt stap 1.1.6) Zuig de media van de dia's en plaats tot 500 μL van 2 x 108 OS/ml in steriele PBS op elke rechthoek van de dia. Plaats dia's in het Ultraviolet Crosslinker-apparaat, stel de stralingsblootstelling van de behandeling indien nodig in (3-9 J/cm2) en behandel op 254 nm.
      OPMERKING: De benodigde stralingsblootstelling kan zorgvuldig worden bepaald door de stralingsblootstelling tussen 3-9 J/cm2 te titreren totdat de mate van autofluorescentie en eiwitverknoping (zoals te zien in figuur 1B en figuur 1C) is bereikt.
      LET OP: Het hanteren van OS buiten een bioveiligheidskast kan leiden tot verontreiniging. Na blootstelling van het besturingssysteem aan het UV Crosslinker-apparaat, verzamelt u het besturingssysteem met steriele pipetpunten, brengt u het over naar steriele microcentrifugebuizen en voert u alle verdere stappen in de bioveiligheidskap uit.
  3. Karakterisering van geoxideerd besturingssysteem
    1. Kaliseer autofluorescentie-emissiespectrum door beeldvorming
      1. Breng 20-50 μL stamoplossing van onbehandeld OS en OxOS in twee afzonderlijke microcentrifugebuizen. Centrifugeer op 2400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, resuspendien pellet in gebufferde (bijv. PBS) 4% paraformaldehyde en fixeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
      2. Na fixatie, spin naar beneden zoals hierboven, wassen met PBS x 2 (draaien tussen wasbeurten) en resuspendeerde vervolgens in minder dan 30 μL PBS.
      3. Plaats een paar microliter van de resuspensie op een microscoopglaasje, voeg bevestigingsmedia toe (zie Materiaaltabel) en tot slot een coverslip.
      4. Afbeelding OxOS op een confocale microscoop (zie Materiaaltabel).
        OPMERKING: OxOS autofluorescentie kan worden geëxciteerd door een breed scala aan lasergolflengten, maar een laserlijn van 405 nm of 488 nm wordt meestal gebruikt. De emissie is even breed, maar een typische GFP/FITC excitatie/emissiefilteropstelling is voldoende om autofluorescentie te bekijken.
      5. Om het OxOS-emissiespectrum te meten, gebruikt u λ-scanning op een confocale microscoop. Typische λ-scaninstellingen omvatten excitatie met 405 nm of 488 nm en detectie van emissie die varieert van 10 nm roodverschoven van de laserexcitatielijn helemaal tot ongeveer 800 nm, met een λ stapgrootte van 10 nm. Elk microscopiesysteem heeft zijn eigen aanwijzingen voor het gebruik van de λ-modus en de lezer moet de handleiding raadplegen voor hun specifieke confocale.
    2. Als alternatief kunt u autofluorescentie kwantificeren door middel van flowcytometrie.
      1. Spin 2 x 10 7 onbehandelde OS en afzonderlijk 2 x 107 OxOS in microcentrifugebuizen en resuspensie in 1 ml PBS.
        OPMERKING: Fixatie is niet vereist als flowcytometrie direct na het ontdooien wordt uitgevoerd.
      2. Laad onbehandelde OS- en OxOS-monsters op de flowcytometer (zie materiaaltabel). Pas forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) aan naar een acceptabele spread in de FSC-SSC scatter grafiek. Gebruik PBS als controle om vervuilende kleine deeltjes uit te sluiten. Merk op dat OS aanzienlijk kleiner zijn dan cellen.
      3. Gebruik het standaard FITC-kanaal van de flowcytometer voor autofluorescentiekwantificering. Tel minstens 10.000 evenementen. Gebruik de waarde van het pulsgebied van het FITC-histogram om de fluorescentie-intensiteit weer te geven.
        OPMERKING: Voor deze studie worden alle gegevens geanalyseerd met behulp van flowcytometeranalysesoftware (zie materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Beoordeel de mate van cross-linking in OxOS
      1. Spin down 2 x 10 7 onbehandelde OS en afzonderlijk 2 x 107 OxOS in microcentrifuge buizen. Verwijder supernatant en lyseer direct pellet door 1,2x Laemmli Sample Buffer toe te voegen (genoeg om te bedekken; zie tabel met materialen). Vortex, gedurende 30 minuten op kamertemperatuur bewaren, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij gelijk of groter dan 12000 x g draaien en supernatant verzamelen.
        OPMERKING: Het beoordelen van de mate van eiwitverknoping in OxOS geeft een idee van de adequaatheid van de UV-behandeling. Er wordt een vergelijking gemaakt tussen onbehandeld OS en OxOS, en adequate cross-linking treedt op wanneer de monomere rhodopsineband die de Coomassie-kleuring domineert (figuur 1C, pijl) net waarneembaar is, met opkomst van aggregaten van hogere orde en een eiwituitstrijkje aan de bovenkant van de gel.
        LET OP: Wanneer u Sample Buffer gebruikt om het besturingssysteem te lyseren, verwarm de lysisoplossing vervolgens niet, omdat dit rhodopsine-aggregatie kan veroorzaken. Vermijd ook het koelen van het gelyseerde besturingssysteem totdat het klaar is voor opslag, omdat dit SDS zal neerslaan. Ongebruikte lysaten kunnen bij -20 °C bewaard worden. Als u opnieuw ontdooit, zorg er dan voor dat de lysaten voor gebruik volledig zijn ontdooid bij kamertemperatuur.
      2. Kwantificeer de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittest die tolerant is voor hoge SDS- en reductiemiddelconcentraties29. Zie de materiaaltabel voor suggesties voor geschikte eiwittestreagentia en volg het protocol van de fabrikant voor deze reagentia.
      3. Voer onbehandelde OS- en OxOS-monsters uit met SDS-PAGE-elektroforese30 op een 4% -15% gradiëntgel, met behulp van standaard tris-glycine SDS-buffer. Gel wordt uitgevoerd op 80 V totdat monsters in de stapel komen en vervolgens op 120 V gedurende 50-60 minuten bij kamertemperatuur.
      4. Bevlek de gel met Coomassie blauw met behulp van standaardprotocollen31. De Coomassie-kleuring zal de adequaatheid van cross-linking geïnduceerd door UV-behandeling aantonen.

2. Het bouwen van lipofuscine-achtige korrels (UAM) in RPE-culturen

  1. OxOS-voedingen: hoeveelheid, frequentie en fagocytose overbruggende liganden
    OPMERKING: Voedingen vinden plaats op menselijke iPSC-RPE- of hfRPE-culturen in passage 1, gekweekt volgens het protocol dat is uiteengezet door het Bharti-lab (voor iPSC-RPE)32 of ons eerder geschetste protocol voor hfRPE, aangepast van het Sheldon Miller-lab22,23. Alle onderstaande berekeningen zijn gebaseerd op het voeren van OxOS of OS naar één 24-well Transwell (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 groeigebied).
    1. Ontdooi 25 μL van 5,6 x 107 OxOS/ml bij 37 °C en voeg 45 μL celkweekmedia toe aan het OxOS-aliquot, wat resulteert in een eindvolume van 70 μL.
      OPMERKING: OxOS-aliquots bereid in stap 1 bevatten fagocytose-overbruggingsliganden MFG-E8 en Protein S. Als die liganden echter niet vóór de bevriezing aan de aliquoten zijn toegevoegd, kunnen ze in deze stap worden toegevoegd, zodat de uiteindelijke concentratie van de liganden in de media die cellen moeten worden gevoed 4 μg / ml voor proteïne S en 1, 5 μg / ml voor MFG-E8 is. Zoals vermeld in stap 1.1.11, moeten de concentraties van overbruggingsliganden mogelijk worden gewijzigd voor andere RPE-typen of celdichtheden.
    2. Verwijder apicale media van Transwell en voeg 70 μL van 2 x 107 OxOS / ml met de fagocytose overbruggende liganden toe aan de apicale kamer. Na 24 uur verwijderen en vervangen door een nieuwe OxOS-voeding. Het voeren vindt dagelijks plaats tijdens weekdagen, waarbij weekenden worden overgeslagen, totdat 20 voedingen zijn voltooid (~ 1 maand). Verander basolaterale celkweekmedia (400-550 μL) 2-3x/week.
    3. Na voltooiing van 20 voedingen, hervat u de normale mediaveranderingen voor de put.
      OPMERKING: Er zijn verschillende extra mediaveranderingen nodig om kleverige OxOS van het RPE-apicale oppervlak af te spoelen, dus experimenten met de met UAM beladen culturen moeten ten minste 1-2 weken na het beëindigen van de OxOS-voedingen worden uitgevoerd.
      LET OP: Het is belangrijk om goede controles te hebben voor UAM-opbouw via OxOS-voedingen. Aangezien dagelijkse mediaveranderingen de RPE-biologie kunnen beïnvloeden, worden de volgende controleputten aanbevolen: Controle 1: Vervang media dagelijks tijdens weekdagen voor hetzelfde aantal voedingen als de met OxOS behandelde groep. Controle 2: Voer RPE onbehandeld OS dagelijks gedurende weekdagen in dezelfde concentratie en hetzelfde volume als OxOS-voedingen, voor hetzelfde aantal voedingen.
  2. Monitoring van de gezondheid van culturen beladen met lipofuscine-achtige korrels door middel van trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER) en celdoodtests
    OPMERKING: Tijdens en na OxOS-voedingen kan de gezondheid van RPE-culturen worden gemeten door de integriteit van RPE tight-junction en celdood te beoordelen. Eerder is aangetoond dat de beoordeling van de integriteit van de tight-junction, via het meten van trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER), een gevoelige marker is voor de algemene celgezondheid33. Meer traditionele niet-invasieve markers van celdood, zoals afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH), kunnen ook worden gebruikt.
    1. TEER uitvoeren
      OPMERKING: TEER wordt getest met een transepitheelmeter (TEER) en TEER-elektrode, meestal volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
      1. Om de TEER-elektrode te steriliseren, gebruikt u een taakwisser gedrenkt in 70% ethanol om de elektrode te reinigen en dompelt u vervolgens de uiteinden van de elektrodesonde gedurende 10 minuten onder in 70% ethanol.
      2. Laat de elektrode volledig drogen en dompel de elektrode vervolgens onder in steriele media.
      3. Verwijder de sonde uit steriele media en plaats de twee sondes van de TEER-elektrode in de apicale en basolaterale kamers van een gekweekte Transwell; De langere sondepunt past in de basolaterale kamer.
        OPMERKING: Het is gemakkelijk om de bodem van de apicale kamer met de TEER-elektrode zonder oefening te schrapen, en dergelijk schrapen zal de TEER-metingen drastisch veranderen als de confluente RPE-monolaag wordt verstoord. Daarom wordt aanbevolen dat beginners oefenen op niet-belangrijke Transwells voordat ze testen op experimentele RPE-culturen. Verder moet de experimentator, nadat elke plaat met RPE-culturen is getest, controleren op het schrapen van de RPE-monolaag onder een standaard weefselkweekmicroscoop.
      4. Zodra de apicale en basolaterale sondes op hun plaats zijn in de Transwell, drukt u op de leesknop of stapt u op de voetschakelaar van de meter om de TEER op te nemen. Was de elektrodesonde tussen platen of groepen cellen met steriele media. Als infectie een grote zorg is, resteriliseer dan tussen de platen.
      5. Bereken TEER door de weerstandsaflezing van de meter te nemen, de waarde van een lege Transwell af te trekken met media maar geen cellen (over het algemeen 100-110 Ω voor een 24-well Transwell met 0,33 cm2 oppervlak) en vervolgens te vermenigvuldigen met het oppervlak van de Transwell.
        OPMERKING: TEER-waarden moeten genormaliseerd worden gerapporteerd aan het celoppervlak. Typische waarden voor gezonde hfRPE-culturen variëren van 350-1100 Ωcm2. TEER-waarden nemen toe naarmate de temperatuur daalt. Dus bij het verwijderen van culturen van een incubator van 37 °C naar een kap op kamertemperatuur, zullen de TEER-waarden de neiging hebben om over de hele plaat te stijgen. Om u tegen deze variabiliteit te beschermen, werkt u snel (indien ervaren) of wacht u 10-15 minuten voordat de plaattemperatuur in evenwicht is met de kamertemperatuur.
    2. Voer de LDH-releasetest uit
      OPMERKING: Afgifte van LDH in celkweeksupernatant vindt plaats tijdens celdood en wordt gemeten met een standaardkit (zie tabel met materialen).
      1. Verzamel het supernatant van boven de cellen na een incubatie van 24 uur en verdun tot 1:100 met behulp van standaardmedia.
      2. Induceer de totale mogelijke LDH-afgifte, wat belangrijk is voor het normaliseren van alle waarden uit stap 2.2.2.1, door toevoeging van 2 μL 10% triton X-100 aan de 100 μL apicale media van controlecellen in een 24-well Transwell. Na het incuberen van het triton/cel supernatant mengsel gedurende 15 minuten bij 37 °C, mengt u de media boven de nu gelyseerde cellen en verzamelt u om de totale mogelijke LDH-afgifte te meten.
      3. Zodra supernatanten zijn verzameld, voert u de test uit met behulp van standaardinstructies van de fabrikant, waarbij de luminescentie wordt gemeten na een incubatie van 30 minuten met behulp van de bufferoplossing van de kit.
        OPMERKING: Alle LDH-waarden zijn genormaliseerd tot de totale mogelijke hoeveelheid LDH-afgifte.
  3. Karakterisering van lipofuscine-achtig korrelspectrum en samenstelling
    1. Het verkrijgen van autofluorescentiekwantificering en spectra
      1. Fixeer UAM-beladen culturen met 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, gevolgd door PBS-was 5x.
      2. Houd een kleine hoeveelheid PBS in de apicale kamer en draai de Transwell vervolgens ondersteboven. Snijd met behulp van een ontleedmicroscoop en een scheermesje het semi-poreuze membraan uit de Transwell en oefen snijkracht uit op de kruising van het membraan en Transwell.
        OPMERKING: Blijf consistent over hoe dicht bij de lip van de Transwell de snede is gemaakt, omdat het Transwell-membraan de neiging heeft om te kromtrekken en te rimpelen wanneer snijwonden niet consistent zijn.
      3. Zodra het Transwell-membraan is gesneden, plaatst u het onmiddellijk op een microscoopglaasje met behulp van een tang, waarbij u voorzichtig moet zijn om te voorkomen dat delen van het Transwell-membraan met cellen worden aangeraakt. Verwijder overtollige PBS met een taakveeg, terwijl u de cellen niet aanraakt. Voeg montagemedia en een coverslip toe. Zorg ervoor dat u bijhoudt welke kant van de Transwell "rechtsboven" is bij het afdekken van de Transwell.
      4. Verkrijg de autofluorescentie-intensiteit en spectra met behulp van dezelfde instellingen en procedures als stap 1.3.1.4 en stap 1.3.1.5.
        OPMERKING: Bij het in beeld brengen van UAM is een belangrijke confounder dat OxOS autofluorescent zijn en vaak dagen en soms zelfs weken na voltooiing van de OxOS-voeding aan het RPE-apicale oppervlak blijven kleven. Als gevolg hiervan moet bij het kwantificeren van UAM een methode worden gebruikt om ervoor te zorgen dat gemeten autofluorescentie afkomstig is van UAM en niet van OxOS. De eenvoudigste methode is om lipofuscineculturen samen te kleuren met een rhodopsine-antilichaam. Anti-rhodopsine-antilichaam 4D2 kan bijvoorbeeld worden gebruikt bij een verdunning van 1:1000 en met een standaard PFA-fixatie immunocytochemisch protocol34. Het secundaire antilichaam voor rhodopsine moet een verrood kleurstof-geconjugeerd antilichaam zijn (bijvoorbeeld met een excitatiemaxima in de buurt van 647 nm), omdat UAM en OxOS-autofluorescentie meestal het zwakst zijn in deze golflengte. Confocale beelden kunnen vervolgens sequentieel worden verkregen in twee kanalen, waarbij de UAM- en OxOS-autofluorescentie worden opgewekt met een 405 nm-laser en emissie van 415 nm tot 550 nm, terwijl resterende rhodopsine, wat wijst op onverteerde OxOS, kan worden geëxciteerd met standaard verrode kleurstofbeeldvormingsparameters in een apart kanaal. Na de acquisitie kan het rhodopsinekanaal worden gebruikt als een subtractief masker in een programma zoals ImageJ om autofluorescentie afkomstig van kleverige resterende OxOS te verwijderen, waardoor alleen UAM-autofluorescentie achterblijft om te kwantificeren.
        LET OP: Zelfs besturingssystemen die niet foto-geoxideerd zijn, vertonen enige autofluorescentie, en zelfs met rigoureus wassen blijven sommige besturingssystemen en OxOS aan het RPE-oppervlak kleven. Dus, zonder het genereren van een subtractief masker met behulp van rhodopsine immunostaining, zoals gesuggereerd in de bovenstaande OPMERKING, is nauwkeurige kwantificering van UAM-autofluorescentieniveaus in culturen gevoed met OxOs of standaard OS niet mogelijk.
    2. Voer gelijktijdige detectie uit van lipofuscine-achtige korrels en andere immunofluorescentiemarkers
      OPMERKING: Zoals beschreven in stap 2.3.1, beperkt het brede autofluorescentiespectrum van lipofuscine de keuzes voor fluorescentie co-kleuring. De volgende methoden kunnen worden overwogen om co-kleuring te vergemakkelijken.
      1. Gebruik een verrode fluorofoor. Autofluorescentie van lipofuscine is zwak in het nabij-infrarood. Dus, het gebruik van een verrode kleurstof voor fluorescentiedetectie van een antigeen van belang, gecombineerd met zorgvuldige aanpassingen van kanaalinstellingen op een confocale microscoop, kan autofluorescentie meestal onderscheiden van co-kleuring fluorescentie.
      2. Profiteer van de lange fluorescentie-emissiestaart van lipofuscine.
        OPMERKING: Aangezien lipofuscine een zeer breed fluorescentie-emissiespectrum heeft, kan het vaak worden geëxciteerd bij een lage nm-golflengte (bijv. 405 nm laser) en wordt emissie nog steeds gedetecteerd in het oranje / rode deel van het spectrum (bijv. 585-635nm). Deze unieke combinatie van excitatie- en emissiegolflengten kan vaak worden aangepast rond een andere co-kleuring fluorofoor.
        1. Detecteer het antigeen van belang met behulp van een fluorofoor met piekexcitatie rond 488 nm, met emissiedetectie bij 500-530 nm. Stel een apart kanaal in voor autofluorescentiedetectie met 405 nm excitatie en 585-635 nm emissie. Dit tweede kanaal detecteert alleen UAM, terwijl het eerste kanaal het antigeen van belang plus lipofuscine detecteert.
        2. Gebruik met behulp van een free-ware programma zoals ImageJ dit tweede UAM-only kanaal als een subtractief masker om het UAM-signaal van het eerste kanaal te verwijderen (dat zowel het antigeensignaal als het UAM-signaal bevat).
      3. Gebruik spectrale ontmenging. De meeste moderne confocale microscopen bevatten een spectrale ontmengingsoptie. Hierdoor kan men het spectrum van een monster verwerven met alleen UAM en een ander monster met alleen de co-kleuring fluorofoor van belang. Het experimentele monster, dat zowel UAM als de co-kleuring fluorofoor bevat, kan vervolgens worden verkregen en onderworpen aan lineaire ontmengingsmethoden om te berekenen welk percentage van het signaal afkomstig is van autofluorescentie versus co-kleuring.
        OPMERKING: Uitgebreide handleidingen voor spectrale ontmenging zijn beschikbaar met de meeste moderne confocale microscopen.
      4. Maak gebruik van fluorescentie lifetime imaging. Hoewel het emissiespectrum tussen UAM en een co-kleuring fluorofoor van belang vergelijkbaar kan zijn, is het waarschijnlijk dat hun fluorescentielevensduur aanzienlijk verschilt. Over het algemeen vertoont UAM een kortere fluorescentielevensduur dan de meeste specifieke fluoroforen. Met toegang tot een confocale microscoop die levenslange beeldvorming mogelijk maakt, kan men fluorescentiesignalen gaten om die te detecteren die langer zijn dan de typische levensduur van lipofuscine.
        OPMERKING: Over het algemeen vermindert gating fluorescentielevensduur tot signalen langer dan 2 ns de UAM-verontreiniging aanzienlijk, hoewel het signaal niet volledig wordt geëlimineerd.
      5. Gebruik van een autofluorescentieonderdrukker. Traditioneel wordt Sudan Black gebruikt om autofluorescentie te doven voorafgaand aan specifieke immunofluorescentiekleuring35. Verschillende in de handel verkrijgbare autofluorescentie quencher producten rapporteren om de resultaten van Sudan Black te verbeteren, en deze producten zijn gedetailleerd in de Tabel van Materialen. Autofluorescentie doven zal natuurlijk het vermogen om lipofuscine te detecteren vernietigen.
    3. Bepaal de samenstelling van lipofuscine-achtige korrels
      1. Beoordeel neutrale lipiden
        1. Bevestig met UAM beladen RPE en controleputten (gevoed met onbehandeld OS) in 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en was met PBS 5x.
        2. Kleuring voor neutrale lipiden met 10 μg / ml Nile Red of 3,33 μg / ml Bodipy 493/503 in een 3% BSA PBS-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, gevolgd door wassen met PBS gedurende 5 minuten 3x.
        3. Knip Transwell uit en monteer ze zoals in stap 2.3.1.2 en 2.3.1.3 en afbeelding. Gebruik in het algemeen de volgende excitatie- en emissiebandbreedtes voor beeldvorming: Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm en Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Beoordeel veresterd en niet-veresterd cholesterol
        1. Volg stap 2.3.3.1.1
        2. Filipine is een fluorescerende kleurstof die niet-veresterd cholesterol herkent, maar geen veresterd cholesterol36. Dus, om te beoordelen op de hoeveelheid totaal cholesterol (niet-veresterd en veresterd) in de UAM, moet u het monster eerst voorbehandelen met cholesterolesterase om veresterd cholesterol om te zetten in niet-veresterd cholesterol. Behandel de cellen met 20 E/ml cholesterolesterase in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,2) (zie Materiaaltabel) bij 37 °C gedurende 3,5 uur, gevolgd door wassen met PBS gedurende 5 min 3x.
        3. Bevlek met 50 μg/ml filipin (zie materiaaltabel) in PBS bij kamertemperatuur gedurende 1 uur en was met PBS gedurende 5 min 3x. Houd monsters bedekt, uit de buurt van licht, omdat filipine fotobleaches gemakkelijk.
          OPMERKING: Als alleen niet-veresterd cholesterol moet worden gekwantificeerd, kan het cholesterolesterase in stap 2.3.3.2.2 worden overgeslagen. Als de hoeveelheid veresterd cholesterol moet worden gekwantificeerd, kan dit worden afgeleid uit het verschil tussen het totale cholesterol en het niet-veresterde cholesterol in het monster.
        4. Knip Transwell uit en monteer ze zoals in stap 2.3.1.2 en 2.3.1.3 en afbeelding.
          OPMERKING: Bij het fotograferen van filipin, fotobleaches zeer snel. Men moet de intensiteit en duur van de excitatie minimaliseren en verwachten dat er zelfs fotobleking kan optreden bij het bekijken van het monster door de oculairen. Daarom moet men bij beeldvorming: (1) zoeken naar een geschikt gebied om af te beelden met behulp van een ander fluorescentiekanaal dan het filipinkanaal, (2) filipin op een breedveld in plaats van een confocale microscoop (om de intensiteit van de blootstelling aan licht te beperken), en (3) herhaalde beeldvorming van een gebied vermijden. Gebruik in het algemeen de volgende excitatie- en emissiebandbreedtes voor het afbeelden van filipin - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Beoordeling van de effecten van lipofuscine-achtige korrels op RPE-fagocytose: totale consumptieve capaciteit

OPMERKING: De reden voor het meten van OS-fagocytose via het OS-pulsprotocol hieronder wordt beschreven in de sectie representatieve resultaten. De methode, die "Total Consumptive Capacity" wordt genoemd, vermijdt onduidelijkheden over fagocytose-efficiëntie die kunnen ontstaan met traditionele OS-puls-chase fagocytose-assays. Assays worden uitgevoerd op 24-well Transwell-platen met behulp van 50 μL media met 4 x 106 OS / ml.

  1. Bereken het aantal putten dat nodig is voor het experiment en ontdooi vervolgens een geschikte hoeveelheid regulier besturingssysteem, draai af bij 2400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en resuspensie in standaard RPE-celkweekmedia tot 4 x 106 OS / ml. Voeg overbruggingsliganden toe om fagocytosesnelheden te vergemakkelijken.
    OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de overbruggingsliganden in de media die moeten worden gevoed met cellen is 4 μg / ml voor proteïne S en 1, 5 μg / ml voor MFG-E8. Zoals vermeld in stap 1.1.11, moeten de concentraties van overbruggingsliganden mogelijk worden gewijzigd voor andere RPE-typen of celdichtheden.
  2. Verwijder apicale media en voeg 50 μL 4 x 106 OS/ml toe, idealiter met de juiste concentraties van overbruggingsliganden.
  3. Voeg op verschillende tijdstippen na toevoeging van het besturingssysteem (bijv. - 0 uur, 1 uur, 4 uur en 24 uur) 16,67 μL 4x Laemmli-monsterbuffer met proteaseremmers toe om beide cellen en het bovenliggende OS-bevattende supernatant te lyseren. Gebruik een P-200-pipet om het Transwell-oppervlak te krassen, zorg ervoor dat u het Transwell-membraan niet doorboort of het membraan losmaakt van de Transwell en verzamel het gecombineerde celsupernatant plus cellysaat samen. Vortex, spin down en laat 30 minuten op kamertemperatuur staan voor een grondige denaturatie.
    LET OP: Ondanks het gebruik van Sample Buffer om het besturingssysteem te lyseren, moet u de lysisoplossing vervolgens niet verwarmen, omdat dit rhodopsine-aggregatie kan veroorzaken. Vermijd ook het afkoelen van het gelyseerde besturingssysteem totdat het klaar is voor opslag, omdat dit eiwit zal neerslaan. Vries ongebruikte lysaten in bij -20 °C en zorg ervoor dat lysaten voor gebruik volledig zijn ontdooid.
  4. Voer lysaten uit op SDS PAGE met dezelfde instellingen als in stap 1.3.3, waarbij gelijke volumes lysaten per put worden geladen. GAPDH, β-actine of een ander huishoudeiwit moet worden gebruikt om het celaantal te normaliseren, omdat fagocytosesnelheden afhankelijk zijn van het celnummer.
  5. Sonde Western vlekken met antilichamen tegen de N- of C-terminus van rhodopsine. Gebruik standaard westerse blottingcondities en antilichaamverdunningen worden vermeld in de materiaaltabel.
    OPMERKING: Onder de hoofdband van rhodopsine bevinden zich meerdere rhodopsinefragmenten. Deze fragmenten vertegenwoordigen gedeeltelijk verteerd rhodopsine, een proces dat begint voorafgaand aan de fusie van het fagosoom met het lysosoom32,33. Een toename van het aantal rhodopsinefragmenten in de met UAM beladen RPE in vergelijking met controle-RPE zou kunnen wijzen op een stroomafwaarts defect in fagolysosoomcapaciteit, op het niveau van fagosoom-lysosoomfusie, lysosomale verzuring en/of degradatieve enzymfunctie 16,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De set-up voor foto-oxidatie van OS wordt gedemonstreerd in figuur 1Ai. De met polytetrafluorethyleen gecoate dia's maken het mogelijk om een groot volume OS in oplossing per open rechthoek te laden zonder zich over de rest van de dia te verspreiden. De plaat met OS bevindt zich in een steriele petrischaal met het deksel eraf en een UV-lamp wordt over de dia geplaatst zoals weergegeven in figuur 1Aii. Als alternatief kan de dia in een UV Crosslinker-apparaat worden geplaatst, zoals weergegeven in figuur 1Aiii. Na foto-oxidatie neemt os-autofluorescentie aanzienlijk toe, zoals beoordeeld door zowel microscopie als flowcytometrie (figuur 1B). De mate van eiwitverknoping na foto-oxidatie kan worden beoordeeld door SDS-PAGE met een Coomassie-kleuring, weergegeven als een omzetting van de dominante eiwitband (monomere rhodopsine) in hogere orde aggregaten en uitstrijkjes (figuur 1C). Een vergelijking van foto-oxidatie met een draagbare UV-lamp (figuur 1Aii) versus het UV Crosslinker-apparaat (figuur 1Aiii) toont aan dat de draagbare UV-lamp OxOS produceert met evenveel autofluorescentie als een 3 J / cm 2-behandeling van het UV Crosslinker-apparaat (figuur 1B), en evenveel eiwitverknoping als een 6 J / cm2-behandeling van het UV Crosslinker-apparaat (figuur 1C). Als de UV-lamp die beschikbaar is voor een onderzoeker verschilt van de lamp die in dit protocol wordt gebruikt, raden we aan de blootstellingstijd te titreren om een niveau van cross-linking te bereiken dat te zien is in de UV-lampbaan in figuur 1C. Het autofluorescentiespectrum van OxOS is licht blauw verschoven in vergelijking met het spectrum van onbehandeld OS, zowel in de eiwitgeïsoleerde fractie van het OS als in de lipide-geïsoleerde fractie van OS16.

De hoeveelheid UAM-opbouw in RPE-culturen is afhankelijk van het aantal OxOS-voedingen (figuur 2A) en 20 voedingen in de loop van ongeveer 4 weken zorgen voor een robuuste hoeveelheid UAM-accumulatie. Om UAM-autofluorescentie te onderscheiden van autofluorescentie van resterende OxOS die zelfs dagen tot weken na het afwassen aan het RPE-apicale oppervlak blijven kleven, kleuren we met een rhodopsine-antilichaam, gedetecteerd met een verrode kleurstof. Door dit rhodopsinefluorescentiekanaal als masker te gebruiken, kunnen we OxOS-autofluorescentie van het UAM-kanaal aftrekken, zodat we autofluorescentie echt kwantificeren van UAM slechts16. Met behulp van kleuringsprotocollen die hierboven zijn beschreven, heeft geaccumuleerde UAM in dit model overvloedige neutrale lipiden, zoals beoordeeld door Nile Red-kleuring16, vergelijkbaar met inheemse lipofuscine. We vinden echter weinig tot geen veresterde of niet-veresterde cholesterolaccumulatie (figuur 2B), wat consistent is met het gebrek aan cholesterolaccumulatie dat we zien bij inheemse lipofuscine uit gezonde ogen (gegevens niet getoond).

Het volgen van fluorescerende markers van belang gelijktijdig met lipofuscine autofluorescentie is moeilijk, gezien het zeer brede fluorescentie-emissiespectrum van lipofuscine. In het bovenstaande gedeelte met methoden worden verschillende methoden beschreven om dit probleem op te lossen. De in stap 2.3.2.1 beschreven methode maakt gebruik van de lage autofluorescentie-emissie-intensiteit voor lipofuscine in het verre-rood. In figuur 2Ci wordt de colocalisatie van UAM en de autofagiemarker LC3 beoordeeld door LC3 te kleuren met een Alexa 647-kleurstof. Ondanks enige bloeding van UAM in het LC3-kanaal, is het duidelijk waar lipofuscine en LC3 zich op deze afbeeldingen bevinden. In de in stap 2.3.2.2 beschreven methode maken de zeer lange fluorescentie-emissiespectra van lipofuscine het ontwerp mogelijk van een emissiekanaal dat alleen fluorescentie van lipofuscine bevat. In figuur 2Cii wordt UAM geëxciteerd met een 488 nm-laser, terwijl emissie wordt gedetecteerd bij zowel 500-535 nm als bij 600-645 nm. Het monster is samen gekleurd met LC3, gedetecteerd met Alexa 488-kleurstof. Het Alexa 488-kanaal (excitatie: 488 nm, emissie: 500-535 nm) bevat zowel LC3- als UAM-signaal. Het tweede kanaal, met 488 nm excitatie en 600-645 nm emissie, bevat echter alleen UAM. Dit tweede kanaal kan worden gebruikt als een masker, toegepast op het Alexa 488 / LC3-kanaal, om ongewenst UAM-signaal van het LC3-signaal af te trekken. In de methode beschreven in stap 2.3.2.4 hierboven, maakt de kortere fluorescentielevensduur van autofluorescent lipofuscine het mogelijk om de lipofuscine te onderscheiden van co-kleuring fluorescentie. In figuur 2Ciii worden alle fluorescentiesignalen die vóór 2 ns bij een fotonenteldetector aankomen, geëlimineerd, waardoor een groot deel van het UAM-autofluorescentiesignaal wordt uitgeschakeld terwijl het co-kleuringssignaal van LC3 grotendeels behouden blijft. Een combinatie van methoden kan nodig zijn om lipofuscine te onderscheiden van co-kleuring fluorescentie als er een sterke co-lokalisatie van de lipofuscine en co-kleuring fluorofoor is.

Aangezien meerdere studies een impact van RPE-lipofuscineaccumulatie op OS-fagocytosepercentages 5,36,37,38,39 hebben gepostuleerd, werd OS-fagocytosecapaciteit in UAM-beladen culturen beoordeeld. Typische fagocytosetests omvatten een korte incubatie van cellen met OS ("puls") gevolgd door afspoeling van ongebonden OS en vervanging van media zonder OS voor een "chase" -periode. Tijdens de achtervolging, als OS worden afgebroken, is er een verlies van rhodopsine, het meest voorkomende eiwit in OS, binnen de RPE. Op verschillende tijdstippen tijdens de achtervolging worden de OS-vrije media verwijderd, gevolgd door cellysis en SDS-PAGE voor rhodopsine die in de RPE-lysaten achterblijft. Omdat de OS-pulsperiode echter bestaat uit zowel opname als afbraak van OS, kan RPE met hoge opname en afbraak ("fagocytose-efficiënte" cellen) vroeg in de achtervolgingsperiode dezelfde rhodopsinespiegels hebben als RPE met lage opname en afbraak ("fagocytose-inefficiënte" cellen). Dit wordt schematisch weergegeven in de studie van Zhang et al23. Om deze dubbelzinnigheid te overwinnen, werd hier een "pulse-only" -test gebruikt. Bij deze methode worden besturingssystemen op RPE gepulseerd, maar niet afgewassen. Op verschillende momenten na toevoeging van het besturingssysteem worden de media en het cellysaat samen verzameld. De media bevat onverteerd OS en het cellysaat bevat een combinatie van intact OS op het celoppervlak, gedeeltelijk verteerd OS dat is geïnternaliseerd en volledig verteerd OS dat met succes door het lysosoom is gekomen. Als controle worden cellen blootgesteld aan OS, maar vervolgens worden het cellysaat en OS-bevattende supernatant onmiddellijk verzameld. Deze controle onthult hoeveel totale rhodopsine in de cellen werd geïntroduceerd. Omdat het lysaat plus supernatant op verschillende punten na de introductie van het besturingssysteem wordt verzameld, kan men beoordelen voor welk deel van het totale rhodopsinesignaal is verdwenen, met behulp van dit als een marker voor de hoeveelheid van alle geïntroduceerde / startende besturingssystemen die nu volledig zijn afgebroken. De uitlezing voor deze test wordt "Total Consumptive Capacity" genoemd, omdat het nauwkeurig alle OS-degradatie meet en niet onderhevig is aan de verwarrende interpretaties van een puls-chase-experiment zoals hierboven beschreven.

Figuur 3A en aanvullende figuur 1 tonen een westerse vlek van resterende rhodopsine met behulp van de Total Consumptive Capacity-test. De hoeveelheid OS die aan cellen wordt gevoerd, wordt gemeten door de rhodopsineband na 0 uur. De belangrijkste rhodopsineband wordt met gelijke efficiëntie afgebroken tussen de controle- en UAM-beladen RPE-monsters (enkele pijl na 4 uur en 24 uur). Er is echter een verschil tussen de groepen bij het kijken naar gedeeltelijk afgebroken fragmenten van rhodopsine, die onder de hoofdropsineband verschijnen. De verschillen in fragmentabundantie impliceren een verminderde lysosomale capaciteit in de UAM-groep, omdat proteolytisch gesplitste fragmenten van rhodopsine snel moeten worden afgebroken met een normale lysosomale functie. Verhoogde abundantie van deze fragmenten zonder verhoogde abundantie van het belangrijkste rhodopsinefragment suggereert subtielere defecten in lysosomaal degradatievermogen in de met UAM beladen culturen. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat lipofuscine inderdaad defecten in OS-fagocytose44 kan induceren, maar geen eerdere studie heeft de effecten van lipofuscine specifiek op rhodopsinefragmenten onderzocht, waardoor de disfunctie nauwkeuriger kan worden vastgesteld in de eindstadia van fagolysosomale afbraak. Figuur 3B toont westerse blotting van de belangrijkste rhodopsineband plus rhodopsinefragmenten met behulp van twee verschillende anti-rhodopsine-antilichamen. Antilichaam 4D2 herkent de N-terminus van rhodopsine en N-terminale fragmenten zijn het laatste deel van rhodopsine dat in het lysosoom wordt afgebroken. Antilichaam 1D4 daarentegen herkent de C-terminus van rhodopsine, die zelfs vóór fagosoom-lysosoomfusie wordt afgebroken. Dus, inzicht in welke fragmenten kleuren met welk antilichaam geeft een gevoel van rhodopsineverwerkingsdefecten die pre-lysosomaal versus lysosomaal 32,40,41 zijn.

Figure 1
Figuur 1: Foto-geoxideerde buitenste segment (OxOS) behandeling en karakterisering. (A) Afbeelding van OS op een met polytetrafluorethyleen gecoat glaasje (i) behandeld met een 254 nm UV-handlamp (ii) of een UV Crosslinker-apparaat (iii). (B) In vergelijking met onbehandeld (regulier) OS (RegOS) had behandeld OS (OxOS) een verhoogde autofluorescentie zoals aangetoond door confocale beeldvorming (links) (schaalbalk = 10 μm) en flowcytometrie (rechts). De autofluorescentie-intensiteit van OxOS behandeld met de handheld UV-lamp was vergelijkbaar met os behandeld met het UV Crosslinker-apparaat bij een stralingsblootstelling van 3 J/cm2 (foutbalk = S.E.M.). (C) SDS-PAGINA die de crosslinking van OS-eiwit geïnduceerd door UV-blootstelling aantoont. OxOS-crosslinking via de handheld UV-lamp was vergelijkbaar met OS behandeld met het UV Crosslinker-apparaat bij een stralingsblootstelling van 6 J / cm2. Monomere rhodopsine wordt gemarkeerd met een pijl. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Imaging OxOS-geïnduceerde lipofuscine-achtige korrels in hfRPE-culturen. (A) Autofluorescente korrels (groen) geïnduceerd door OxOS accumuleerden significant meer na 20 voedingen in vergelijking met 5 voedingen. Resterende OxOS-kleuring met rhodopsine-antilichaam (magenta). Schaalbalk = 10 μm. (B) UAM geïnduceerd door OxOS (groen) was niet verrijkt met vrije cholesterol of cholesterolester, zoals beoordeeld door filipinekleuring (rood). Scele bar = 10 μm. (C) Beeldvormingsmethoden voor fluorescentie co-kleuring in aanwezigheid van lipofuscine. (i) Gebruik van verrode fluorofoor (Alexa 647) om autofagiemarker LC3 (magenta) te kleuren, waardoor UAM-bloedingen worden geminimaliseerd. Pure UAM (groen) afgebeeld met een standaard groene kanaalexcitatie en emissiefilteropstelling. Schaalbalk = 2 μm. (ii) Het gebruik van ratiometrische beeldvorming helpt bij het ontcijferen van UAM-autofluorescentie van LC3-kleuring gelabeld met Alexa 488. Excitatie is 488 nm, green channel emission bandpass is 500-535 nm terwijl red channel emission bandpass 600-645 nm is. Rood kanaal kan worden toegepast als een subtractief masker om LC3-signaal van het groene kanaal te isoleren. Schaalbalk = 5 μm. (iii) Aangezien de fluorescentielevensduur van lipofuscine/UAM doorgaans korter is dan specifieke kleurstoffen, kan UAM-autofluorescentie worden verminderd door fluorescentiesignalen uit te schakelen die in minder dan 2 ns bij een detector voor het tellen van fotonen aankomen. Bovenste afbeelding is zonder gating. Onderste afbeelding is met gating, waarbij alleen fluorescentiesignalen worden bewaard met een levensduur langer dan 2 ns. Er is een grotere relatieve vermindering van het UAM-signaal in vergelijking met het specifieke LC3-signaal (gelabeld met Alexa 488) tussen de bovenste en onderste afbeeldingen. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: "Total Consumptive Capacity" methode voor het meten van OS fagocytose. (A) Totaal resterend rhodopsine-eiwit in zowel cellysaat- als supernatant na introductie van OS in RPE-cultuur, zoals getest door western blot. Na het voeden van reguliere OS in 50 μL media, werden zowel de geconditioneerde media / supernatant als de cellen samen gelyseerd na 0, 4 en 24 uur. Het 0 h-tijdpunt dient als een besturingselement, dat de totale hoeveelheid besturingssysteem aangeeft die aan elke Transwell wordt gevoerd. De intacte rhodopsineband (enkele pijl) was niet verschillend tussen controle- en UAM-beladen RPE-cellen, wat suggereert dat er geen groot effect van UAM op RPE-fagocytose is. De splitsingsproducten van rhodopsine, aangegeven door de dubbele pijlen, waren echter hoger in de UAM-groep, wat wijst op een milde degradatieve disfunctie in het fagolysosomale systeem. Gelijke niveaus van GAPDH geven aan dat het aantal cellen tussen putten, wat de fagocytosesnelheid kan beïnvloeden, gelijk was. (B) Verschillende rhodopsine-antilichamen herkennen verschillende afbraakfragmenten. 4D2 herkent het N-eindpunt van rhodopsine, dat intact is tot de allerlaatste stappen van lysosomale afbraak. De fragmenten die het herkent zijn dan ook klein (dubbele pijlen). 1D4 daarentegen herkent het C-eindpunt van rhodopsine, dat eerder in het fagolysosomale proces wordt afgebroken. Dit antilichaam herkent dus rhodopsinefragmenten met een hoger molecuulgewicht (dubbele pijlen). Beide antilichamen herkennen intact rhodopsine (enkele pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Onbewerkte vlek overeenkomstig figuur 3A. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel RPE lipofuscine al tientallen jaren wordt bestudeerd, wordt de toxiciteit ervan besproken 2,9,16,42. Gezien de onduidelijkheid over de toxiciteit van lipofuscine uit diermodellen11, zijn in vitro modellen met menselijke RPE waardevol. Een reeks in vitro lipofuscine accumulatiemodellen zijn beschreven, maar geen enkele heeft zowel OS-voeding als zeer volwassen en gedifferentieerde menselijke RPE-culturen gebruikt. Deze combinatie vertegenwoordigt een ideaal model, omdat OS-voeding de methode voor lipofuscineaccumulatie in vivo samenvat en hoogvolwassen menselijke RPE-culturen RPE-gedrag het beste in vivo repliceren. Interessant is dat bij het gebruik van sterk gedifferentieerde hfRPE-culturen werd ontdekt dat routinematige blootstelling aan OS onvoldoende was om lipofuscine-achtig materiaal te induceren, zelfs na herhaalde voedingen16. Dit protocol versnelt dus het lipofuscine-accumulatieproces door foto-oxiderend OS (OxOS) op een gecontroleerde manier. Het voeren van OxOS aan zowel menselijke iPSC-RPE- als hfRPE-culturen resulteerde in robuuste accumulatie van lipofuscine-achtige korrels, die onverteerbaar autofluorescent materiaal (UAM) wordt genoemd. UAM-accumulatie maakt het mogelijk om lipofuscine te modelleren in kweeksystemen die gezonde menselijke RPE in vivonabootsen 22,23,29,43,44. In zowel een eerdere publicatie als in deze studie toont uitgebreide karakterisering van UAM in vergelijking met inheemse lipofuscine van gezonde oudere volwassenen zowel overeenkomsten als verschillen. UAM bootst de ultrastructuur van lipofuscine in vivo na, inclusief de neiging van lipofuscinekorrels om te fuseren met melaninekorrels om melanolipofuscinete vormen 16. Zowel UAM als lipofuscine bevatten substantiële neutrale lipiden, geen rhodopsine en geen significante verrijking van cholesterol (figuur 2A, B uit onze eerdere publicatie16, figuur 2A, B hierboven en ongepubliceerde gegevens). We vergeleken ook de grootte en het spectrum van inheemse lipofuscinekorrels met die van UAM (figuur 3 uit onze eerdere publicatie16). UAM-korrels zijn aanvankelijk iets groter en blauw verschoven in vergelijking met inheemse lipofuscine, maar gedurende aanzienlijke perioden in cultuur compacteert de UAM tot een kleinere omvang en roodverschuiving in hun emissiespectrum, waardoor ze veel meer lijken op de grootte en het spectraprofiel van inheemse lipofuscine.

Het OxOS UAM-model is gebruikt voor een reeks toepassingen, waaronder de effecten van autofagie-inductoren op het voorkomen en verwijderen van lipofuscinekorrels50 en de effecten van lipofuscine op RPE-polariteit en metabolisme16. Verder is aangetoond dat deze korrels langer dan een jaar in gekweekte RPE blijven bestaan, waardoor men de evolutie van lipofuscinespectra, morfologie en gedrag over langere perioden kan bestuderen16. Andere toepassingen voor het model zijn de studie van lipofuscineaccumulatie op complementactivatie51, lysosomale stabiliteit en ontstekingsreacties 52 en mitochondriaal compromis53.

Er zijn een paar cruciale stappen in dit protocol. Ten eerste moeten RPE-culturen sterk gedifferentieerd en volwassen zijn. OxOS-voedingen mogen pas beginnen nadat RPE minstens 8 weken op Transwells is geweest en alle eigenschappen heeft verkregen die kenmerkend zijn voor hoogvolwassen RPE (de 5 'P's uitgewerkt door Finnemann et al. - polygonaal in morfologie, postmitotisch, gepigmenteerd, gepolariseerd en fagocytisch54). Ten tweede zijn besturingssystemen zeer kwetsbaar en moeten ze voorzichtig worden behandeld tijdens pipetteren. Overmatig pipetteren of bevriezen zal het besturingssysteem uit elkaar halen. Ten slotte is de verhouding tussen OS en totale UV-fluxblootstelling van cruciaal belang voor het genereren van OxOS die intact blijven maar nog steeds UAM kunnen induceren; Deze verhouding is in dit protocol verfijnd. Te veel UV-licht voor een bepaald aantal besturingssystemen veroorzaakt overmatige cross-linking en vernietigt kritieke chemische structuren in het besturingssysteem. Te weinig UV-licht voor een bepaald aantal besturingssystemen zal geen UAM in cultuur induceren.

Wijzigingen in het protocol omvatten grotendeels het wijzigen van de OxOS-voedingsduur of -concentratie. Empirisch gezien produceren 20 voedingen in de loop van ongeveer 4 weken een robuuste hoeveelheid UAM-accumulatie. Voedingen daarbuiten kunnen stapsgewijs bijdragen aan UAM-accumulatie, terwijl minder voedingen waarschijnlijk slechts sporadische UAM-accumulatie veroorzaken. Het aantal voedingen kan worden aangepast op basis van het doel, de behoeften en de middelen van het experiment en de experimentator. In minder gedifferentieerde RPE-culturen (hoger passagegetal, cellijnen of culturen die epitheliale-mesenchymale overgangseigenschappen vertonen), zijn minder voedingen en lagere OxOS-concentraties nodig voor robuuste UAM-inductie.

Het protocol heeft verschillende beperkingen. Het gebruik van een draagbare UV-lamp voor foto-oxidatie van OS voorkomt nauwkeurige kwantificering van de totale stralingsblootstelling die aan OS wordt geleverd. Foto-oxidatie van OS met behulp van de draagbare lamp werd in deze studie echter gecorreleerd met een veel duurder (maar kwantitatief) UV Crosslinker-apparaat in figuur 1 om parameters voor stralingsblootstelling te helpen bieden. Het wordt aanbevolen dat experimentatoren de duur van de UV-blootstelling wijzigen totdat het cross-linking / rhodopsine-uitstrijkpatroon overeenkomt met dat in de UV-lampkolom van de Western blot in figuur 1C.

Een tweede beperking van de methode is dat het waarschijnlijk veel van de kenmerken van lipofuscine-accumulatie in vivo mist. Inderdaad, in dit protocol worden de lipofuscine-achtige korrels aangeduid als onverteerbaar autofluroessend materiaal (UAM) om dit onderscheid duidelijk te maken. Foto-oxiderende OS vat een deel van de natuurlijke chemische cross-linking samen die plaatsvindt in fotoreceptor buitenste segmenten in ziektetoestanden, maar de cross-linking is sterk versneld en waarschijnlijk meer niet-specifiek in het UAM-model. Verder, ondanks bijna een maand OxOS-voedingen, vertegenwoordigt het UAM-model nog steeds een "acute" blootstelling aan lipofuscine-inducerende OS, vergeleken met de decennia die het duurt voordat lipofuscine zich bij mensen ophoopt. Bij een meer langdurige lipofuscine accumulatie in cultuur, kunnen er minder fenotypische effecten zijn. Niettemin, omdat UAM-korrels langer dan een jaar in het hier gepresenteerde kweeksysteem blijven, is er gelegenheid om hun langetermijneffecten op de RPE-gezondheid te bestuderen16.

Een beperking van de "Total Consumptive Capacity" -methode die hier wordt gepresenteerd om te beoordelen op RPE-fagocytosecapaciteit is dat het niet kan onderscheiden of fagocytosedefecten te wijten kunnen zijn aan OS-binding versus opname versus degradatie. Inderdaad, wanneer het doel van de fagocytosetest mechanistisch inzicht is in disfunctie van specifieke stappen van het fagocytoseproces, zijn traditionele OS-pulse-chase-assays meer geschikt. Meting van "Total Consumptive Capacity" moet worden gebruikt wanneer het doel eenvoudigweg is om de OS-fagocytosecompetentie van de RPE-cultuur onder controle versus experimentele omstandigheden ondubbelzinnig te meten.

Concluderend wordt een protocol gepresenteerd voor lipofuscine-achtige korrelaccumulatie in sterk gedifferentieerde menselijke RPE-culturen. Deze methode combineert het fysiologische proces voor lipofuscine-accumulatie - herhaalde voedingen van foto-geoxideerd OS - met RPE-cultuurmodellen waarvan in herhaalde studies is aangetoond dat ze menselijke RPE in vivo sterk recapituleren. De resulterende culturen beladen met lipofuscine-achtige korrels kunnen worden gebruikt voor talloze toepassingen, variërend van beoordeling van lipofuscine-effecten op RPE-biologie tot tests van kleine moleculen, genen en signaalroutes die belangrijk zijn voor het moduleren van lipofuscine-accumulatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) en de International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. wordt momenteel ondersteund door een K08-subsidie van het National Eye Institute (EY033420). Er werden geen federale fondsen gebruikt voor HFT-onderzoek. Verdere steun komt van het James Grosfeld Initiative for Dry AMD en de volgende particuliere donoren: Barbara Dunn en Dee & Dickson Brown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Tags

Biologie Lipofuscin Retinal Pigment Epitheel (RPE) Photoreceptor Outer Segment Tips or Fragments (OS) Fagocytose Ziekte van Stargardt Leeftijdsgebonden Maculaire Degeneratie (AMD) Onverteerbaar Autofluorescentie Materiaal (UAM)
Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. … More

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter