JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Verbeterde lipofuscinemodellen en kwantificering van de fagocytosecapaciteit van het buitenste segment in sterk gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheelculturen

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65242
, ,
1Kellogg Eye Center,University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program,University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Dit protocol beschrijft een lipofuscine accumulatiemodel in sterk gedifferentieerde en gepolariseerde menselijke retinale pigmentepitheel (RPE) culturen en een verbeterde buitensegment (OS) fagocytosetest om het totale OS-verbruik / degradatievermogen van de RPE te detecteren. Deze methoden overwinnen de beperkingen van eerdere lipofuscinemodellen en klassieke pulse-chase buitenste segment fagocytose-assays.

Abstract

De dagelijkse fagocytose van fotoreceptor buitenste segmenten door het retinale pigmentepitheel (RPE) draagt bij aan de accumulatie van een intracellulair verouderingspigment genaamd lipofuscine. De toxiciteit van lipofuscine is goed ingeburgerd bij de ziekte van Stargardt, de meest voorkomende erfelijke retinale degeneratie, maar is meer controversieel bij leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de belangrijkste oorzaak van onomkeerbare blindheid in de ontwikkelde wereld. Het bepalen van lipofuscine toxiciteit bij mensen is moeilijk geweest, en diermodellen van Stargardt’s hebben beperkte toxiciteit. In vitro modellen die menselijke RPE in vivo nabootsen, zijn dus nodig om de generatie, klaring en toxiciteit van lipofuscine beter te begrijpen. De meeste celkweek-lipofuscinemodellen tot nu toe waren in cellijnen of hadden betrekking op het voeden van RPE met een enkel onderdeel van het complexe lipofuscinemengsel in plaats van fragmenten / tips van het hele buitenste segment van de fotoreceptor, wat een completer en fysiologischer lipofuscinemodel genereert. Hier wordt een methode beschreven om de accumulatie van lipofuscine-achtig materiaal (onverteerbaar autofluorescentiemateriaal of UAM genoemd) te induceren in sterk gedifferentieerde primaire menselijke prenatale RPE (hfRPE) en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) afgeleide RPE. UAM geaccumuleerd in culturen door herhaalde voedingen van met ultraviolet licht behandelde OS-fragmenten die door de RPE via fagocytose worden opgenomen. De belangrijkste manieren waarop UAM in vivo lipofuscine benadert en verschilt, worden ook besproken. Bij dit model van lipofuscine-achtige accumulatie worden beeldvormingsmethoden geïntroduceerd om het brede autofluorescentiespectrum van UAM-korrels te onderscheiden van gelijktijdige antilichaamkleuring. Ten slotte is, om de impact van UAM op de RPE-fagocytosecapaciteit te beoordelen, een nieuwe methode geïntroduceerd voor het kwantificeren van de opname en afbraak van fragmenten in het buitenste segment/tips. Deze methode, die “Total Consumptive Capacity” wordt genoemd, overwint mogelijke verkeerde interpretaties van RPE-fagocytosecapaciteit die inherent zijn aan klassieke “pulse-chase” -testen in het buitenste segment. De hier geïntroduceerde modellen en technieken kunnen worden gebruikt om lipofuscinegeneratie- en klaringsroutes en vermeende toxiciteit te bestuderen.

Introduction

Het retinale pigmentepitheel (RPE) biedt kritische ondersteuning voor bovenliggende fotoreceptoren, inclusief de dagelijkse opname en afbraak van fotoreceptor buitenste segmentpunten of fragmenten (in dit protocol staat de afkorting OS voor OS-tips of fragmenten in plaats van hele buitenste segmenten). Deze dagelijkse opname in de post-mitotische RPE overbelast uiteindelijk de fagolysosomale capaciteit en leidt tot de opbouw van onverteerbaar, autofluorescerend intracellulair materiaal, lipofuscine genaamd. Interessant is dat verschillende studies ook hebben aangetoond dat RPE-lipofuscine zich kan ophopen zonder OS-fagocytose 1,2. Lipofuscine heeft veel componenten, waaronder cross-linked adducten afgeleid van visuele cyclus retinoïden, en kan bijna 20% van het RPE-celvolume innemen voor mensen ouder dan 80 jaar3.

Of lipofuscine giftig is, is fel bediscussieerd. De ziekte van Stargardt is een autosomaal recessieve degeneratie van de fotoreceptoren en RPE waarbij een mutatie in ABCA4 een onjuiste verwerking van visuele cyclus retinoïden in de buitenste segmenten van de fotoreceptor veroorzaakt. Onjuiste retinoïde verwerking leidt tot afwijkende cross-linking en vorming van bis-retinoïde soorten, waaronder de bis-retinoïde N-retinylideen-N-retinylethanolamine (A2E). Studies hebben meerdere mechanismen voor A2E-toxiciteit 4,5 aangetoond. Lipofuscine draagt bij aan fundus autofluorescentiesignalen tijdens klinische beeldvorming, en zowel de patiënten van Stargardt als de diermodellen vertonen een verhoogde fundus autofluorescentie voorafgaand aan retinale degeneratie, wat een correlatie suggereert tussen lipofuscinespiegels en toxiciteit 6,7. Met de leeftijd hoopt lipofuscine zich echter op bij alle mensen zonder een RPE-degeneratie te veroorzaken. Verder, in leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), waar RPE-degeneratie alleen voorkomt bij oudere patiënten, hebben degenen met vroege en intermediaire vormen van de ziekte minder fundus autofluorescentiesignalen dan leeftijdsgematchte niet-zieke mensen8. Deze klinische bevindingen zijn geverifieerd op histologisch niveauen 9,10.

Diermodellen van RPE lipofuscine accumulatie hebben ook enige onduidelijkheid over lipofuscine toxiciteit gelaten. De ABCA4 knock-out muis geeft geen retinale degeneratie weer op een gepigmenteerde achtergrond, terwijl dit wel het geval is op een albino achtergrond of bij blootstelling aan blauw licht11,12. Verder verschilt de toxiciteit van lipofuscine afgeleid via ABCA4 knock-out waarschijnlijk van de langzamer accumulerende lipofuscine die optreedt bij natuurlijke veroudering, zoals gezien in AMD13.

In vitro modellen van lipofuscine accumulatie bieden een alternatief voor het bestuderen van de effecten van lipofuscine accumulatie op RPE gezondheid. Dergelijke modellen maken het mogelijk om lipofuscinecomponenten te manipuleren, van het voeden van enkele retinoïde componenten tot het voeden van OS, en maken onderzoek mogelijk in menselijke in plaats van dierlijke RPE. In de afgelopen decennia zijn er meerdere methoden ontwikkeld om RPE lipofuscine in cultuur te modelleren. Samen met andere groepen voedde de groep van Dr. Boulton dagelijks runder-OS gedurende maximaal drie maanden op passage 4 tot 7 menselijke primaire RPE-cellen van donoren van 4 tot 85 jaar oud14. Als alternatief heeft remming van autofagie ook geleid tot lipofuscineaccumulatie in passages 3 tot 7 primaire menselijke RPE-culturen15. Subletale lysosomale remming in sterk gedifferentieerde, passage 1, primaire humane prenatale RPE (hfRPE) culturen slaagde er echter niet in lipofuscine te induceren, zelfs niet met de herhaalde toevoeging van OS op dagelijkse basis16.

Als een meer reductionistische benadering hebben anderen enkele lipofuscinecomponenten aan culturen gevoerd, met name de bis-retinoïde A2E 4,17. Dergelijke studies zijn waardevol omdat ze potentiële directe mechanismen van toxiciteit voor individuele lipofuscinecomponenten definiëren, die bijvoorbeeld lysosomale cholesterol en ceramidehomeostase impliceren18. Tegelijkertijd is er discussie over de toxiciteit van A2E19, en het rechtstreeks aan cellen voeren omzeilt de typische route voor lipofuscine-accumulatie, waarbij fagocytose van fotoreceptor OS betrokken is. In een poging om alle componenten van lipofuscine aan RPE-culturen te leveren, zuiverden Boulton en Marshall lipofuscine uit menselijke ogen en voedden dit aan passage 4 tot 7 menselijke primaire RPE-culturen afgeleid van zowel foetale als oudere menselijke donoren20. Hoewel innovatief, vertegenwoordigt deze methode een beperkte lipofuscinebron voor herhaalde experimenten.

Hoewel herhaalde voedingen van OS aan RPE-culturen lipofuscine produceren in veel systemen, lukt dit niet in sterk gedifferentieerde primaire RPE-culturen16. Foto-oxiderend OS induceert cross-linking reacties zoals bis-retinoïde vorming die van nature optreedt tijdens lipofuscinevorming in vivo. Dit kan de vorming van lipofuscine-achtige korrels in RPE-kweeksystemen versnellen, zelfs die welke sterk gedifferentieerd zijn en resistent zijn tegen lipofuscine-accumulatie16. Hier wordt een methode geïntroduceerd om lipofuscine-achtige korrelaccumulatie te induceren in sterk gedifferentieerde hfRPE en menselijke iPSC-RPE, aangepast van Wihlmark’s gepubliceerde protocol21. Deze methode heeft het voordeel dat lipofuscine-achtige korrels worden geïnduceerd die dezelfde bron (fotoreceptor OS) en route (fagolysosomale OS-opname) gebruiken als voor lipofuscinogenese in vivo. Verder wordt het gedaan op menselijke RPE-culturen die sterk gedifferentieerd en gevalideerd zijn in meerdere studies om menselijke RPE in vivo te repliceren 22,23,24. Deze lipofuscine-achtige korrels worden onverteerbaar autofluorescent materiaal (UAM) genoemd en bieden gegevens en discussie in dit protocol waarin UAM wordt vergeleken met in vivo lipofuscine. Samen met methoden voor het bouwen en evalueren van met UAM beladen culturen in sterk gedifferentieerde menselijke RPE, wordt ook een bijgewerkte methode geïntroduceerd om RPE OS-fagocytose te beoordelen. Er zijn meerdere uitstekende puls-chase methoden geïntroduceerd voor het kwantificeren van OS fagocytose, waaronder Western blotting, immunocytochemie en FACS25,26,27. Vroeg in de OS-puls-chase kunnen omstandigheden die leiden tot een slechte os-opname echter worden samengevoegd met omstandigheden die een snelle degradatie van geïnternaliseerd besturingssysteem bevorderen. De hier gepresenteerde methode meet de totale hoeveelheid geïntroduceerd besturingssysteem die volledig wordt verbruikt / afgebroken door de RPE (“Total Consumptive Capacity”), waardoor deze ambiguïteit wordt geëlimineerd. Er wordt verwacht dat inzichten over lipofuscinetoxiciteit met behulp van deze protocollen, inclusief effecten op OS-fagocytosesnelheden met behulp van de “Total Consumptive Capacity” -methode, zullen worden gebruikt om licht te werpen op de toxiciteit van lipofuscine in vivo.

Protocol

Het huidige protocol met betrekking tot de verwerving en het gebruik van menselijk weefsel werd beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Michigan (HUM00105486). 1. Bereiding van foto-geoxideerde buitenste segmentpunten en fragmenten OPMERKING: Aan het donker aangepaste netvliezen van runderen werden gekocht en op ijs verzonden (zie materiaaltabel). Van deze netvliezen werden OS gezuiverd volgens een eerder g…

Representative Results

De set-up voor foto-oxidatie van OS wordt gedemonstreerd in figuur 1Ai. De met polytetrafluorethyleen gecoate dia’s maken het mogelijk om een groot volume OS in oplossing per open rechthoek te laden zonder zich over de rest van de dia te verspreiden. De plaat met OS bevindt zich in een steriele petrischaal met het deksel eraf en een UV-lamp wordt over de dia geplaatst zoals weergegeven in figuur 1Aii. Als alternatief kan de dia in een UV Crosslinker-apparaat wor…

Discussion

Hoewel RPE lipofuscine al tientallen jaren wordt bestudeerd, wordt de toxiciteit ervan besproken 2,9,16,42. Gezien de onduidelijkheid over de toxiciteit van lipofuscine uit diermodellen11, zijn in vitro modellen met menselijke RPE waardevol. Een reeks in vitro lipofuscine accumulatiemodellen zijn beschreven, maar geen enkele heeft zowel OS-voeding als z…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) en de International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. wordt momenteel ondersteund door een K08-subsidie van het National Eye Institute (EY033420). Er werden geen federale fondsen gebruikt voor HFT-onderzoek. Verdere steun komt van het James Grosfeld Initiative for Dry AMD en de volgende particuliere donoren: Barbara Dunn en Dee & Dickson Brown.

Materials

100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease–correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch’s membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. , 51-60 (2014).

Tags

Keywords: LipofuscinRetinal Pigment EpitheliumRPEPhagocytosisOuter SegmentsIn Vitro ModelStargardt’s DiseaseAge-related Macular DegenerationAMDToxicity
check_url/65242?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image