JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65242
, ,
1Kellogg Eye Center,University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program,University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE’nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Abstract

Retinal pigment epiteli (RPE) tarafından fotoreseptör dış segmentlerin günlük fagositozu, lipofussin adı verilen hücre içi yaşlanma pigmentinin birikmesine katkıda bulunur. Lipofusin toksisitesi, en yaygın kalıtsal retinal dejenerasyon olan Stargardt hastalığında iyi bilinmektedir, ancak gelişmiş dünyada geri dönüşümsüz körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD) daha tartışmalıdır. İnsanlarda lipofussin toksisitesini belirlemek zor olmuştur ve Stargardt’ın hayvan modelleri sınırlı toksisiteye sahiptir. Bu nedenle, lipofussin üretimini, klirensini ve toksisitesini daha iyi anlamak için insan RPE’sini in vivo olarak taklit eden in vitro modellere ihtiyaç vardır. Bugüne kadar hücre kültürü lipofussin modellerinin çoğunluğu hücre hatlarındaydı veya RPE’yi tüm fotoreseptör dış segmentinin parçaları / uçları yerine karmaşık lipofuscin karışımının tek bir bileşeni ile beslemeyi içeriyordu, bu da daha eksiksiz ve fizyolojik bir lipofuscin modeli oluşturuyordu. Burada tarif edilen, lipofussin benzeri materyalin (sindirilemeyen otofloresan materyal veya UAM olarak adlandırılır) yüksek oranda farklılaşmış primer insan doğum öncesi RPE’sinde (hfRPE) ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı RPE’de birikmesini indükleyen bir yöntemdir. UAM, RPE tarafından fagositoz yoluyla alınan ultraviyole ışıkla işlenmiş OS parçalarının tekrar tekrar beslenmesiyle kültürlerde birikmiştir. UAM’nin lipofuscin in vivo olarak yaklaştığı ve ondan farklı olduğu anahtar yollar da tartışılmaktadır. Bu lipofussin benzeri birikim modeline eşlik ederek, UAM granüllerinin geniş otofloresan spektrumunu eşzamanlı antikor boyamasından ayırt etmek için görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır. Son olarak, UAM’nin RPE fagositoz kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, dış segment fragmanı / uçlarının alımını ve parçalanmasını ölçmek için yeni bir yöntem tanıtılmıştır. “Toplam Tüketim Kapasitesi” olarak adlandırılan bu yöntem, klasik dış segment “nabız kovalamaca” testlerinde bulunan RPE fagositoz kapasitesinin potansiyel yanlış yorumlarının üstesinden gelir. Burada tanıtılan modeller ve teknikler, lipofussin üretimi ve klirens yollarını ve varsayılan toksisiteyi incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Retinal pigment epiteli (RPE), fotoreseptör dış segment uçlarının veya fragmanlarının günlük alımı ve bozulması da dahil olmak üzere üstteki fotoreseptörler için kritik destek sağlar (bu protokol boyunca, OS kısaltması, tüm dış segmentlerden ziyade OS uçları veya fragmanları anlamına gelir). Post-mitotik RPE’deki bu günlük alım sonunda fagolizozomal kapasiteyi aşırı yükler ve lipofussin adı verilen sindirilemeyen, otofloresan hücre içi materyalin birikmesine yol açar. İlginç bir şekilde, birkaç çalışma RPE lipofuscin’in OS fagositoz 1,2 olmadan birikebileceğini de göstermiştir. Lipofuscin, görsel siklus retinoidlerinden türetilen çapraz bağlı adduktlar da dahil olmak üzere birçok bileşene sahiptir ve 80 yaşın üzerindekiler için RPE hücre hacminin yaklaşık% 20’sini işgal edebilir3.

Lipofuscin’in toksik olup olmadığı sıcak bir şekilde tartışılmıştır. Stargardt hastalığı, fotoreseptörlerin ve RPE’nin otozomal resesif dejenerasyonudur ve ABCA4’teki bir mutasyon, fotoreseptör dış segmentlerinde bulunan görme döngüsü retinoidlerinin yanlış işlenmesini tetikler. Yanlış retinoid işleme, bis-retinoid N-retinylidene-N-retinilethanolamine (A2E) dahil olmak üzere bis-retinoid türlerinin anormal çapraz bağlanmasına ve oluşumuna yol açar. Çalışmalar A2E toksisitesi için çoklu mekanizmalar göstermiştir 4,5. Lipofuscin, klinik görüntüleme sırasında fundus otofloresan sinyallerine katkıda bulunur ve hem Stargardt’ın hastaları hem de hayvan modelleri, retinal dejenerasyondan önce fundus otofloresansının arttığını gösterir, bu da lipofussin seviyeleri ile toksisite arasında bir korelasyon olduğunudüşündürmektedir 6,7. Bununla birlikte, yaşla birlikte, lipofuscin tüm insanlarda RPE dejenerasyonunu tetiklemeden birikir. Ayrıca, RPE dejenerasyonunun sadece yaşlı hastalarda meydana geldiği yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), hastalığın erken ve orta formlarına sahip olanlar, yaşa uygun hastalıksız insanlardan daha az fundus otofloresan sinyaline sahiptir8. Bu klinik bulgular histolojik düzeyde de doğrulanmıştır 9,10.

RPE lipofussin birikiminin hayvan modelleri de lipofussin toksisitesi hakkında bazı belirsizlikler bırakmıştır. ABCA4 nakavt faresi, pigmentli bir arka plan üzerinde retinal dejenerasyon göstermezken, albino bir arka planda veya mavi ışığa maruz kaldığında11,12 gösterir. Ayrıca, ABCA4 nakavtı yoluyla elde edilen lipofuscinin toksisitesi, AMD13’te görüldüğü gibi, doğal yaşlanma ile ortaya çıkan daha yavaş biriken lipofusinden farklıdır.

Lipofussin birikiminin in vitro modelleri, lipofussin birikiminin RPE sağlığı üzerindeki etkilerini incelemek için bir alternatif sunmaktadır. Bu tür modeller, tek retinoid bileşenlerin beslenmesinden işletim sisteminin beslenmesine kadar lipofuscin bileşenlerinin manipüle edilmesine izin verir ve hayvan RPE’sinden ziyade insanda çalışmaya izin verir. Son birkaç on yılda, RPE lipofuscin’i kültürde modellemek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Diğer gruplarla birlikte, Dr. Boulton’un grubu, 4 ila 85yaşları arasındaki donörlerden 4 ila 7 insan birincil RPE hücresinin geçişinde üç aya kadar günlük olarak sığır OS’yi besledi. Alternatif olarak, otofajinin inhibisyonu da pasajlarda lipofussin birikimine yol açmıştır 3 ila 7 birincil insan RPE kültürleri15. Bununla birlikte, oldukça farklılaşmış, pasaj 1, primer insan prenatal RPE (hfRPE) kültürlerinde sub-ölümcül lizozomal inhibisyon, günlük olarak tekrarlanan OS ilavesiyle bile lipofuscin’i indükleyememiştir16.

Daha indirgemeci bir yaklaşım olarak, diğerleri kültürlere, özellikle bis-retinoid A2E 4,17’ye tek lipofuscin bileşenlerini beslemişlerdir. Bu tür çalışmalar, bireysel lipofussin bileşenleri için potansiyel doğrudan toksisite mekanizmalarını tanımladıkları için değerlidir, örneğin lizozomal kolesterol ve seramid homeostazı18’i içerir. Aynı zamanda, A2E19’un toksisitesi hakkında tartışmalar vardır ve doğrudan hücrelere beslenmesi, fotoreseptör OS’nin fagositozunu içeren lipofussin birikimi için tipik yolu atlatır. Boulton ve Marshall, lipofuscin’in tüm bileşenlerini RPE kültürlerine ulaştırma girişiminde, lipofuscin’i insan gözlerinden saflaştırdı ve bunu hem fetal hem de yaşlı insan donörlerinden türetilen 4 ila 7 insan birincil RPE kültürüne besledi20. Yenilikçi olsa da, bu yöntem tekrarlanan deneyler için sınırlı bir lipofuscin kaynağını temsil eder.

OS’nin RPE kültürlerine tekrar tekrar beslenmesi birçok sistemde lipofussin üretirken, oldukça farklılaşmış birincil RPE kültürlerinde bunu başaramaz16. Foto-oksitleyici OS, in vivo lipofussin oluşumu sırasında doğal olarak ortaya çıkan bis-retinoid oluşumu gibi çapraz bağlanma reaksiyonlarını indükler. Bu, RPE kültür sistemlerinde lipofussin benzeri granül oluşumunu hızlandırabilir, hatta lipofussin birikimine karşı oldukça farklılaşmış ve dirençli olanlarbile16. Burada, Wihlmark’ın yayınlanmış protokol21’inden modifiye edilmiş, oldukça farklılaşmış hfRPE ve insan iPSC-RPE’sinde lipofussin benzeri granül birikimini indükleyen bir yöntem tanıtılmıştır. Bu yöntem, in vivo lipofuscinogenez için olduğu gibi aynı kaynağı (fotoreseptör OS) ve yolu (fagolizozomal OS alımı) kullanan lipofussin benzeri granülleri indükleme avantajına sahiptir. Ayrıca, insan RPE’sini in vivo22,23,24 çoğaltmak için yapılan birçok çalışmada oldukça farklılaşmış ve doğrulanmış insan RPE kültürleri üzerinde yapılır. Bu lipofussin benzeri granüller sindirilemeyen otofloresan materyal (UAM) olarak adlandırılır ve bu protokolde UAM’yi in vivo lipofuscin ile karşılaştıran veri ve tartışma sağlar. Yüksek oranda farklılaşmış insan RPE’sinde UAM yüklü kültürleri oluşturma ve değerlendirme yöntemlerinin yanı sıra, RPE OS fagositozunu değerlendirmek için güncellenmiş bir yöntem de tanıtılmıştır. OS fagositozunu ölçmek için Western blotting, immünositokimya ve FACS25,26,27 dahil olmak üzere birçok mükemmel nabız kovalama yöntemi tanıtılmıştır. Bununla birlikte, işletim sistemi nabız kovalamacasının başlarında, zayıf işletim sistemi alımına yol açan koşullar, içselleştirilmiş işletim sisteminin hızlı bir şekilde bozulmasını teşvik eden koşullarla birleştirilebilir. Burada sunulan yöntem, RPE (“Toplam Tüketim Kapasitesi”) tarafından tamamen tüketilen/bozulan tanıtılan işletim sisteminin toplam miktarını ölçer ve bu belirsizliğin ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. “Toplam Tüketim Kapasitesi” yöntemi kullanılarak OS fagositoz oranları üzerindeki etkiler de dahil olmak üzere, bu protokolleri kullanan lipofussin toksisitesi hakkındaki bilgilerin, lipofuscin’in in vivo toksisitesine ışık tutmak için kullanılması beklenmektedir.

Protocol

İnsan dokusunun edinimi ve kullanımını içeren mevcut protokol, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. 1. Foto-oksitlenmiş dış segment uçlarının ve parçalarının hazırlanması NOT: Koyulaştırılmış sığır retinaları satın alınmış ve buz üzerinde sevk edilmiştir (bkz. Bu retinalardan, işletim sistemi daha önce yayınlanmış bir protokol<sup class=…

Representative Results

İşletim sisteminin foto-oksidasyonu için kurulum Şekil 1Ai’de gösterilmiştir. Politetrafloroetilen kaplı kızaklar, slaydın geri kalanına yayılmadan açık dikdörtgen başına büyük miktarda çözelti içinde işletim sistemi yüklenmesini sağlar. İşletim sistemli slayt, kapağı kapalı steril bir Petri kabı içinde bulunur ve Şekil 1Aii’de gösterildiği gibi slaytın üzerine bir UV lambası yerleştirilir. Alternatif olarak, slayt <strong c…

Discussion

RPE lipofuscin on yıllardır çalışılırken, toksisitesi 2,9,16,42 tartışılmaktadır. Hayvan modellerinden lipofuscin’in toksisitesi hakkında belirsizlik göz önüne alındığında11, insan RPE’sini kullanan in vitro modeller değerlidir. Bir dizi in vitro lipofussin birikim modeli tanımlanmıştır, ancak hiçbiri hem OS beslenmesini hem de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, kısmen, Vitreo-Retinal Cerrahi Vakfı (VRSF), Görme için Mücadele (FFS) ve Uluslararası Retina Araştırma Vakfı (IRRF) tarafından verilen hibelerle desteklenmektedir. J.M.L.M. şu anda Ulusal Göz Enstitüsü’nden (EY033420) bir K08 hibesi ile desteklenmektedir. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Daha fazla destek James Grosfeld Initiative for Dry AMD ve aşağıdaki özel bağışçılardan geliyor: Barbara Dunn ve Dee &; Dickson Brown.

Materials

100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease–correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch’s membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. , 51-60 (2014).

Tags

Keywords: LipofuscinRetinal Pigment EpitheliumRPEPhagocytosisOuter SegmentsIn Vitro ModelStargardt’s DiseaseAge-related Macular DegenerationAMDToxicity
check_url/65242?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image