Усовершенствованные модели липофусцина и количественная оценка способности фагоцитоза наружного сегмента в высокополяризованных культурах пигментного эпителия сетчатки человека

Summary

В этом протоколе описывается модель накопления липофусцина в высокодифференцированных и поляризованных культурах пигментного эпителия сетчатки человека (RPE) и улучшенный анализ фагоцитоза наружного сегмента (OS) для определения общей способности RPE потреблять/деградировать OS. Эти методы преодолевают ограничения предыдущих моделей липофусцина и классических анализов фагоцитоза наружного сегмента с погоней за пульсом.

Abstract

Ежедневный фагоцитоз наружных сегментов фоторецепторов пигментным эпителием сетчатки (RPE) способствует накоплению внутриклеточного пигмента старения, называемого липофусцином. Токсичность липофусцина хорошо известна при болезни Штаргардта, наиболее распространенной наследственной дегенерации сетчатки, но более противоречива при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), основной причине необратимой слепоты в развитых странах. Определение токсичности липофусцина у людей было затруднено, а животные модели Штаргардта имеют ограниченную токсичность. Таким образом, модели in vitro , имитирующие человеческий RPE in vivo , необходимы для лучшего понимания генерации, клиренса и токсичности липофусцина. Большинство моделей липофусцина клеточных культур до настоящего времени были в клеточных линиях или включали кормление RPE одним компонентом сложной смеси липофусцина, а не фрагментами/кончиками всего внешнего сегмента фоторецептора, что создает более полную и физиологическую модель липофусцина. Здесь описан способ индуцирования накопления липофусциноподобного материала (называемого неперевариваемым автофлуоресцентным материалом, или UAM) в высокодифференцированном первичном пренатальном RPE человека (hfRPE) и индуцированном плюрипотентном стволовом клеточном (iPSC), полученном RPE. УАМ накапливался в культурах при многократном кормлении обработанных ультрафиолетовым светом фрагментов ОС, поглощенных РПЭ посредством фагоцитоза. Также обсуждаются ключевые способы, которыми UAM аппроксимируется и отличается от липофусцина in vivo . Сопровождая эту модель липофусциноподобного накопления, представлены методы визуализации, позволяющие отличить широкий спектр аутофлуоресценции гранул UAM от одновременного окрашивания антителами. Наконец, для оценки влияния UAM на способность к фагоцитозу RPE был введен новый метод количественной оценки поглощения и разрушения фрагментов/кончиков внешнего сегмента. Этот метод, получивший название «общая потребительская емкость», преодолевает потенциальные неправильные интерпретации способности к фагоцитозу RPE, присущие классическим анализам внешнего сегмента «погони за пульсом». Представленные здесь модели и методы могут быть использованы для изучения путей генерации и клиренса липофусцина, а также предполагаемой токсичности.

Introduction

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) обеспечивает критически важную поддержку вышележащих фоторецепторов, включая ежедневное поглощение и деградацию кончиков или фрагментов внешнего сегмента фоторецептора (в этом протоколе аббревиатура OS означает кончики или фрагменты OS, а не целые внешние сегменты). Это ежедневное поглощение постмитотического RPE в конечном итоге перегружает фаголизосомальную способность и приводит к накоплению неперевариваемого автофлуоресцентного внутриклеточного материала, называемого липофусцином. Интересно, что несколько исследований также продемонстрировали, что липофусцин RPE может накапливаться без фагоцитоза^{ОС 1,2}. Липофусцин имеет много компонентов, в том числе сшитые аддукты, полученные из ретиноидов зрительного цикла, и может занимать почти 20% объема клеток RPE для людей старше 80 лет³.

Вопрос о том, токсичен ли липофусцин, горячо обсуждается. Болезнь Штаргардта представляет собой аутосомно-рецессивную дегенерацию фоторецепторов и RPE, при которой мутация в ABCA4 вызывает неправильную обработку ретиноидов зрительного цикла, содержащихся во внешних сегментах фоторецепторов. Неправильная обработка ретиноидов приводит к аберрантному сшиванию и образованию видов бис-ретиноидов, включая бис-ретиноид N-ретинилиден-N-ретинилэтаноламин (A2E). Исследования продемонстрировали несколько механизмов токсичности A2E ^4,5. Липофусцин вносит свой вклад в сигналы аутофлуоресценции глазного дна во время клинической визуализации, и как у пациентов Штаргардта, так и у животных моделей наблюдается повышенная аутофлуоресценция глазного дна до дегенерации сетчатки, что свидетельствует о корреляции между уровнями липофусцина и токсичностью ^6,7. Однако с возрастом липофусцин накапливается у всех людей, не вызывая дегенерации РПЭ. Кроме того, при возрастной макулярной дегенерации (ВМД), когда дегенерация RPE встречается только у пожилых пациентов, пациенты с ранними и промежуточными формами заболевания имеют меньше сигналов аутофлуоресценции глазного дна, чем люди того же возраста без заболевания⁸. Эти клинические данные были проверены и на гистологическом уровне ^9,10.

Животные модели накопления липофусцина RPE также оставили некоторую двусмысленность в отношении токсичности липофусцина. Мышь с нокаутом ABCA4 не проявляет дегенерацию сетчатки на пигментированном фоне, тогда как на фоне альбиносов или при воздействии синего света^11,12. Кроме того, токсичность липофусцина, полученного с помощью нокаута ABCA4, вероятно, отличается от более медленно накапливающегося липофусцина, который происходит при естественном старении, как видно из ВМД¹³.

Модели накопления липофусцина in vitro представляют собой альтернативу изучению влияния накопления липофусцина на здоровье РПЭ. Такие модели позволяют манипулировать компонентами липофусцина, от кормления отдельными ретиноидными компонентами до кормления ОС, и позволяют проводить исследования на людях, а не на животных. За последние пару десятилетий было разработано несколько методов моделирования липофусцина RPE в культуре. Наряду с другими группами, группа доктора Болтона ежедневно кормила бычью ОС в течение трех месяцев при прохождении от 4 до 7 первичных клеток RPE человека от доноров в возрасте от 4 до 85 лет¹⁴. Альтернативно, ингибирование аутофагии также приводило к накоплению липофусцина в пассажах 3–7 первичных культур РПЭ^{человека 15}. Однако сублетальное ингибирование лизосома в высокодифференцированных, проходящих 1, первичных пренатальных культурах RPE человека (hfRPE) не могло индуцировать липофусцин даже при повторном добавлении ОВ на ежедневной основе¹⁶.

В качестве более редукционистского подхода другие скармливали культурам отдельные компоненты липофусцина, особенно бис-ретиноид A2E ^4,17. Такие исследования ценны тем, что они определяют потенциальные прямые механизмы токсичности для отдельных компонентов липофусцина, затрагивающие, например, лизосомальный холестерин и керамидный гомеостаз¹⁸. В то же время ведутся споры о токсичности A2E¹⁹, и подача его непосредственно в клетки обходит типичный путь накопления липофусцина, который включает фагоцитоз фоторецептора OS. В попытке доставить все компоненты липофусцина в культуры RPE, Болтон и Маршалл очистили липофусцин из глаз человека и скармливали его в проход с 4 по 7 первичные культуры RPE человека, полученные как от плодных, так и от пожилых доноров²⁰. Несмотря на то, что этот метод является инновационным, он представляет собой ограниченный источник липофусцина для повторных экспериментов.

В то время как повторное кормление ОВ культурами RPE продуцирует липофусцин во многих системах, это не происходит в высокодифференцированных первичных культурах RPE¹⁶. Фотоокисляющая ОС индуцирует реакции сшивания, такие как образование бис-ретиноидов, которые естественным образом происходят при образовании липофусцина in vivo. Это может ускорить образование липофусциноподобных гранул в культуральных системах РПЭ, даже в высокодифференцированных и устойчивых к накоплению липофусцина¹⁶. Здесь представлен метод индуцирования накопления липофусциноподобных гранул в высокодифференцированном hfRPE и человеческом iPSC-RPE, модифицированный по сравнению с опубликованным протоколом²¹ Вильмарка. Преимущество этого метода заключается в том, что он индуцирует липофусциноподобные гранулы с использованием того же источника (фоторецепторного ОС) и пути (фаголизосомальное поглощение ОС), что и для липофусциногенеза in vivo. Кроме того, это делается на культурах РПЭ человека, которые высоко дифференцированы и подтверждены в многочисленных исследованиях для воспроизведения РПЭ человека in vivo^22,23,24. Эти липофусциноподобные гранулы называются неперевариваемым автофлуоресцентным материалом (UAM) и предоставляют данные и обсуждение в этом протоколе, сравнивая UAM с липофусцином in vivo. Наряду с методами построения и оценки культур, нагруженных UAM, в высокодифференцированных РПЭ человека, также представлен обновленный метод оценки фагоцитоза СИЗО РПЭ. Было введено несколько отличных методов поиска импульсов для количественной оценки фагоцитоза ОВ, включая вестерн-блоттинг, иммуноцитохимию и FACS^25,26,27. Однако на ранних этапах погони за импульсами ОС условия, которые приводят к плохому усвоению ОС, могут быть объединены с условиями, способствующими быстрой деградации интернализованной ОС. Представленный здесь метод измеряет общее количество введенных ОС, которое полностью потребляется/ухудшается RPE («Общая потребляемая емкость»), помогая устранить эту двусмысленность. Ожидается, что информация о токсичности липофусцина с использованием этих протоколов, включая влияние на частоту фагоцитоза ОВ с использованием метода «Общая потребительская емкость», будет использована, чтобы пролить свет на токсичность липофусцина in vivo.

Protocol

Настоящий протокол, касающийся приобретения и использования тканей человека, был рассмотрен и одобрен Институциональным наблюдательным советом Мичиганского университета (HUM00105486). 1. Подготовка фотоокисленных наружных сегментных наконечников и фрагментов <p class="jove_content…

Representative Results

Установка для фотоокисления ОС показана на рисунке 1Ai. Предметные стекла с политетрафторэтиленовым покрытием позволяют загружать большой объем ОС в растворе на открытый прямоугольник, не распространяясь по остальной части предметного стекла. Предметное стекло с ОС на…

Discussion

В то время как липофусцин RPE изучался в течение десятилетий, его токсичность обсуждается 2,9,16,42. Учитывая неоднозначность в отношении токсичности липофусцина на животных моделях¹¹, модели in vitro, испол?…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000