Miglioramento dei modelli di lipofuscina e quantificazione della capacità di fagocitosi del segmento esterno in colture epiteliali di pigmenti retinici umani altamente polarizzate

Summary

Questo protocollo descrive un modello di accumulo di lipofuscina in colture epiteliali di pigmenti retinici (RPE) umane altamente differenziate e polarizzate e un test di fagocitosi del segmento esterno (OS) migliorato per rilevare il consumo totale di OS / capacità di degradazione dell’RPE. Questi metodi superano i limiti dei precedenti modelli di lipofuscina e dei classici saggi di fagocitosi del segmento esterno a inseguimento del polso.

Abstract

La fagocitosi quotidiana dei segmenti esterni dei fotorecettori da parte dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) contribuisce all’accumulo di un pigmento di invecchiamento intracellulare chiamato lipofuscina. La tossicità della lipofuscina è ben consolidata nella malattia di Stargardt, la più comune degenerazione retinica ereditaria, ma è più controversa nella degenerazione maculare legata all’età (AMD), la principale causa di cecità irreversibile nel mondo sviluppato. Determinare la tossicità della lipofuscina nell’uomo è stato difficile e i modelli animali di Stargardt hanno una tossicità limitata. Pertanto, sono necessari modelli in vitro che imitano l’RPE umano in vivo per comprendere meglio la generazione, la clearance e la tossicità della lipofuscina. La maggior parte dei modelli di lipofuscina di colture cellulari fino ad oggi sono stati in linee cellulari o hanno coinvolto l’alimentazione di RPE con un singolo componente della miscela complessa di lipofuscina piuttosto che frammenti / punte dell’intero segmento esterno del fotorecettore, che genera un modello di lipofuscina più completo e fisiologico. Qui è descritto un metodo per indurre l’accumulo di materiale simile alla lipofuscina (definito materiale di autofluorescenza indigeribile, o UAM) in RPE prenatale umano primario altamente differenziato (hfRPE) e RPE derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). L’UAM si è accumulata nelle colture mediante ripetute alimentazioni di frammenti di OS trattati con luce ultravioletta assorbiti dall’RPE tramite fagocitosi. Vengono anche discussi i modi chiave in cui UAM si avvicina e differisce dalla lipofuscina in vivo . Accompagnando questo modello di accumulo simile alla lipofuscina, vengono introdotti metodi di imaging per distinguere l’ampio spettro di autofluorescenza dei granuli di UAM dalla concomitante colorazione anticorpale. Infine, per valutare l’impatto dell’UAM sulla capacità di fagocitosi RPE, è stato introdotto un nuovo metodo per quantificare l’assorbimento e la rottura di frammenti/punte del segmento esterno. Definito “Total Consumptive Capacity”, questo metodo supera potenziali interpretazioni errate della capacità di fagocitosi RPE inerente ai classici saggi di “inseguimento a impulsi” del segmento esterno. I modelli e le tecniche qui introdotte possono essere utilizzati per studiare la generazione di lipofuscina e le vie di clearance e la tossicità putativa.

Introduction

L’epitelio pigmentato retinico (RPE) fornisce un supporto critico per i fotorecettori sovrastanti, compresa l’assorbimento e la degradazione quotidiana delle punte o dei frammenti del segmento esterno dei fotorecettori (in tutto questo protocollo, l’abbreviazione OS sta per punte o frammenti di OS piuttosto che interi segmenti esterni). Questo assorbimento giornaliero nell’RPE post-mitotico alla fine sovraccarica la capacità fagolisosomiale e porta all’accumulo di materiale intracellulare autofluorescente non digeribile, chiamato lipofuscina. È interessante notare che diversi studi hanno anche dimostrato che la lipofuscina RPE può accumularsi senza fagocitosi OS ^1,2. La lipofuscina ha molti componenti, compresi gli addotti reticolati derivati dai retinoidi del ciclo visivo e può occupare quasi il 20% del volume delle cellule RPE per quelli di età superiore agli 80³.

Se la lipofuscina è tossica è stato oggetto di accesi dibattiti. La malattia di Stargardt è una degenerazione autosomica recessiva dei fotorecettori e dell’RPE in cui una mutazione in ABCA4 innesca un’elaborazione impropria dei retinoidi del ciclo visivo contenuti nei segmenti esterni dei fotorecettori. L’elaborazione impropria dei retinoidi porta alla reticolazione aberrante e alla formazione di specie di bis-retinoidi, tra cui il bis-retinoide N-retiniletanamina (A2E). Gli studi hanno dimostrato molteplici meccanismi per la tossicità di A2E ^4,5. La lipofuscina contribuisce ai segnali di autofluorescenza del fondo oculare durante l’imaging clinico e sia i pazienti di Stargardt che i modelli animali mostrano una maggiore autofluorescenza del fondo prima della degenerazione retinica, suggerendo una correlazione tra i livelli di lipofuscina e la tossicità ^6,7. Tuttavia, con l’età, la lipofuscina si accumula in tutti gli esseri umani senza innescare una degenerazione RPE. Inoltre, nella degenerazione maculare legata all’età (AMD), dove la degenerazione RPE si verifica solo nei pazienti anziani, quelli con forme precoci e intermedie della malattia hanno meno segnali di autofluorescenza del fondo oculare rispetto agli esseri umani non malati di pari età⁸. Questi risultati clinici sono stati verificati anche a livello istologico ^9,10.

I modelli animali di accumulo di lipofuscina RPE hanno anche lasciato qualche ambiguità sulla tossicità della lipofuscina. Il topo knockout ABCA4 non mostra degenerazione retinica su uno sfondo pigmentato, mentre lo fa su uno sfondo albino o quando esposto alla luce blu^11,12. Inoltre, la tossicità della lipofuscina derivata tramite knockout ABCA4 probabilmente differisce dalla lipofuscina che si accumula più lentamente che si verifica con l’invecchiamento naturale, come visto in AMD¹³.

I modelli in vitro di accumulo di lipofuscina forniscono un’alternativa allo studio degli effetti dell’accumulo di lipofuscina sulla salute dell’RPE. Tali modelli consentono di manipolare i componenti della lipofuscina, dall’alimentazione di singoli componenti retinoidi all’alimentazione di OS, e consentono lo studio nell’RPE umano piuttosto che animale. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati diversi metodi per modellare la lipofuscina RPE in coltura. Insieme ad altri gruppi, il gruppo del Dr. Boulton ha alimentato quotidianamente OS bovini per un massimo di tre mesi sul passaggio da 4 a 7 cellule RPE primarie umane da donatori di età compresa tra 4 e 85 anni¹⁴. In alternativa, l’inibizione dell’autofagia ha anche portato all’accumulo di lipofuscina nei passaggi da 3 a 7 colture RPE umane primarie¹⁵. Tuttavia, l’inibizione lisosomiale sub-letale in colture di RPE prenatale umana primaria (hfRPE) altamente differenziate, di passaggio 1, non è riuscita a indurre lipofuscina, anche con l’aggiunta ripetuta di OS su base giornaliera¹⁶.

Come approccio più riduzionista, altri hanno alimentato singoli componenti di lipofuscina alle colture, in particolare il bis-retinoide A2E ^4,17. Tali studi sono preziosi in quanto definiscono potenziali meccanismi diretti di tossicità per i singoli componenti della lipofuscina, implicando, ad esempio, il colesterolo lisosomiale e l’omeostasi della ceramide¹⁸. Allo stesso tempo, c’è un dibattito sulla tossicità di A2E¹⁹ e alimentarlo direttamente alle cellule aggira il percorso tipico per l’accumulo di lipofuscina, che coinvolge la fagocitosi del fotorecettore OS. Nel tentativo di fornire tutti i componenti della lipofuscina alle colture RPE, Boulton e Marshall hanno purificato la lipofuscina dagli occhi umani e l’hanno alimentata al passaggio da 4 a 7 colture RPE primarie umane derivate da donatori umani sia fetali che anziani²⁰. Sebbene innovativo, questo metodo rappresenta una fonte limitata di lipofuscina per esperimenti ripetuti.

Mentre ripetute somministrazioni di OS a colture RPE producono lipofuscina in molti sistemi, non riescono a farlo in colture RPE primarie altamente differenziate¹⁶. Il sistema operativo fotoossidante induce reazioni di reticolazione incrociata come la formazione di bis-retinoidi che si verifica naturalmente durante la formazione di lipofuscina in vivo. Questo può accelerare la formazione di granuli simili a lipofuscine nei sistemi di coltura RPE, anche quelli che sono altamente differenziati e resistenti all’accumulo di lipofuscina¹⁶. Qui viene introdotto un metodo per indurre l’accumulo di granuli simili alla lipofuscina in hfRPE altamente differenziato e iPSC-RPE umano, modificato dal protocollo²¹ pubblicato da Wihlmark. Questo metodo ha il vantaggio di indurre granuli simili a lipofuscina impiegando la stessa fonte (OS fotorecettore) e la stessa via (assorbimento di OS fagolisosomiale) come avviene per la lipofuscinogenesi in vivo. Inoltre, viene fatto su colture di RPE umane che sono altamente differenziate e convalidate in più studi per replicare RPE umano in vivo^22,23,24. Questi granuli simili alla lipofuscina sono definiti materiale autofluorescente indigeribile (UAM) e forniscono dati e discussioni in questo protocollo confrontando UAM con lipofuscina in vivo. Insieme ai metodi per costruire e valutare colture cariche di UAM in RPE umano altamente differenziato, viene introdotto anche un metodo aggiornato per valutare la fagocitosi di RPE OS. Sono stati introdotti diversi metodi eccellenti per quantificare la fagocitosi della OS, tra cui Western blotting, immunocitochimica e FACS^25,26,27. Tuttavia, all’inizio della caccia all’impulso del sistema operativo, le condizioni che portano a uno scarso assorbimento del sistema operativo possono essere confuse con condizioni che promuovono un rapido degrado del sistema operativo interiorizzato. Il metodo qui presentato misura la quantità totale di sistema operativo introdotto che viene completamente consumata / degradata dall’RPE (“Total Consumptive Capacity”), contribuendo a eliminare questa ambiguità. Si prevede che le intuizioni sulla tossicità della lipofuscina utilizzando questi protocolli, compresi gli effetti sui tassi di fagocitosi di OS utilizzando il metodo “Total Consumptive Capacity”, saranno utilizzate per far luce sulla tossicità della lipofuscina in vivo.

Protocol

Il presente protocollo che prevede l’acquisizione e l’uso di tessuti umani è stato esaminato e approvato dall’Institutional Review Board dell’Università del Michigan (HUM00105486). 1. Preparazione di punte e frammenti di segmenti esterni fotoossidati NOTA: Le retine bovine adattate al buio sono state acquistate e spedite su ghiaccio (vedi Tabella dei materiali). Da queste retine, le OS sono state purificate seguendo un protocollo23…

Representative Results

Il set-up per la foto-ossidazione del sistema operativo è illustrato nella Figura 1Ai. Le guide rivestite in politetrafluoroetilene consentono di caricare un grande volume di OS in soluzione per rettangolo aperto senza diffondersi sul resto del vetrino. Il vetrino con OS è contenuto all’interno di una capsula di Petri sterile con il coperchio spento e una lampada UV è posizionata sopra la diapositiva come mostrato in Figura 1Aii. In alternativa, il vetrino pu…

Discussion

Mentre RPE lipofuscin è stato studiato per decenni, la sua tossicità è dibattuta 2,9,16,42. Data l’ambiguità sulla tossicità della lipofuscina da modelli animali¹¹, i modelli in vitro che utilizzano RPE umano sono preziosi. È stata descritta una serie di modelli di accumulo di lipofuscina in vitro, ma nessuno ha utilizzato sia l’alimentazione OS c…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000