Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

Published: April 14, 2023

doi:

Qitao Zhang, Gillian Autterson, Jason M. L. Miller²

¹Kellogg Eye Center,University of Michigan, Ann Arbor, ²Cellular and Molecular Biology Program,University of Michigan, Ann Arbor

Summary

이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

Abstract

망막 색소 상피(RPE)에 의한 광수용체 외부 세그먼트의 일일 식균 작용은 리포푸신(lipofuscin)이라고 하는 세포 내 노화 색소의 축적에 기여합니다. 리포푸신의 독성은 가장 흔한 유전성 망막변성인 스타가르트병에서 잘 알려져 있지만, 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반변성(AMD)에서 더 논란의 여지가 있습니다. 인간에서 리포푸신 독성을 결정하는 것은 어려웠으며 Stargardt의 동물 모델은 독성이 제한적이었습니다. 따라서 생체 내에서 인간 RPE를 모방하는 시험관 내 모델은 리포푸신 생성, 제거 및 독성을 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 현재까지 대부분의 세포 배양 리포푸신 모델은 세포주에 있었거나 전체 광수용체 외부 세그먼트의 단편/팁이 아닌 복합 리포푸신 혼합물의 단일 성분을 RPE에 공급하여 보다 완전하고 생리학적인 리포푸신 모델을 생성했습니다. 여기에 기술된 것은 고도로 분화된 일차 인간 산전 RPE(hfRPE) 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 RPE에서 리포푸신 유사 물질(소화되지 않는 자가형광 물질, 또는 UAM으로 명명됨)의 축적을 유도하는 방법이다. 식균 작용을 통해 RPE에 의해 흡수된 자외선 처리된 OS 단편의 반복 공급에 의해 배양에 축적된 UAM. UAM이 생체 내에서 리포푸신과 유사하고 다른 주요 방법도 논의됩니다. 이 리포푸신 유사 축적 모델과 함께 UAM 과립의 광범위한 자가형광 스펙트럼을 동시 항체 염색과 구별하는 이미징 방법이 도입되었습니다. 마지막으로, RPE 식균 작용 능력에 대한 UAM의 영향을 평가하기 위해 외부 세그먼트 조각/팁 흡수 및 분해를 정량화하는 새로운 방법이 도입되었습니다. “총 소비 용량”이라고 하는 이 방법은 고전적인 외부 세그먼트 “펄스 추적” 분석에 내재된 RPE 식균 작용 용량의 잠재적인 오해를 극복합니다. 여기에 소개된 모델과 기술은 리포푸신 생성 및 제거 경로와 추정 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체 외부 세그먼트 팁 또는 단편의 일일 흡수 및 분해를 포함하여 위에 있는 광수용체에 대한 중요한 지원을 제공합니다(이 프로토콜 전체에서 약어 OS는 전체 외부 세그먼트가 아닌 OS 팁 또는 단편을 나타냄). 유사분열 후 RPE의 이러한 일일 섭취는 결국 포골리소좀 용량에 과부하를 일으키고 리포푸신이라고 하는 소화되지 않는 자가형광 세포 내 물질의 축적으로 이어집니다. 흥미롭게도, 여러 연구에서 RPE 리포푸신이 OS 식균작용 없이 축적될 수 있음이 입증되었습니다 ^1,2. 리포푸신은 시각 주기 레티노이드에서 파생된 가교 부가물을 포함하여 많은 성분을 가지고 있으며 80세 이상의 경우 RPE 세포 부피의 거의 20%를 차지할 수 있습니다³.

리포푸신이 독성이 있는지 여부는 뜨거운 논쟁거리입니다. 스타가르트병은 ABCA4의 돌연변이가 광수용체 외부 세그먼트 내에 포함된 시각 주기 레티노이드의 부적절한 처리를 유발하는 광수용체 및 RPE의 상염색체 열성 변성입니다. 부적절한 레티노이드 처리는 비스-레티노이드 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E)을 포함한 비스-레티노이드 종의 비정상적인 가교 결합 및 형성을 초래합니다. 연구는 A2E 독성에 대한 여러 메커니즘을 입증했습니다 ^4,5. 리포푸신은 임상 영상 촬영 중 안저 자가형광 신호에 기여하며, Stargardt의 환자와 동물 모델 모두 망막 변성 전에 증가된 안저 자가형광을 나타내며, 이는 리포푸신 수치와 독성 사이의 상관관계를 시사합니다 ^6,7. 그러나 나이가 들어감에 따라 리포푸신은 RPE 퇴행을 유발하지 않고 모든 인간에게 축적됩니다. 또한, RPE 변성이 노인 환자에서만 발생하는 연령 관련 황반변성(AMD)의 경우, 초기 및 중간 형태의 황반변성을 가진 사람들은 연령이 일치하지 않는 사람보다 안저 자가형광 신호가 적다⁸. 이러한 임상 소견은 조직학적 수준에서도 검증되었습니다 ^9,10.

RPE 리포푸신 축적의 동물 모델은 또한 리포푸신 독성에 대해 약간의 모호성을 남겼습니다. ABCA4 녹아웃 마우스는 착색된 배경에서는 망막 변성을 나타내지 않는 반면, 알비노 배경에서는 또는 청색광에 노출될 때 나타납니다^11,12. 또한, ABCA4 녹아웃을 통해 유도된 리포푸신의 독성은 AMD¹³에서 볼 수 있듯이 자연 노화와 함께 발생하는 더 천천히 축적되는 리포푸신과 다를 수 있습니다.

리포푸신 축적의 시험관 내 모델은 리포푸신 축적이 RPE 건강에 미치는 영향을 연구하는 대안을 제공합니다. 이러한 모델은 단일 레티노이드 성분 공급에서 OS 공급에 이르기까지 리포푸신 성분을 조작할 수 있게 하고 동물 RPE가 아닌 인간에서 연구할 수 있도록 합니다. 지난 수십 년 동안 배양에서 RPE 리포푸신을 모델링하기 위해 여러 방법이 개발되었습니다. 다른 그룹과 함께, Boulton 박사의 그룹은 4세에서 85세 사이의 기증자로부터 4-7개의 인간 일차 RPE 세포를 통과하여 최대 3개월 동안 매일 소 OS를 공급했습니다¹⁴. 대안적으로, 자가포식의 억제는 또한 계대 3 내지 7 일차 인간 RPE 배양물에서 리포푸신 축적을 유도하였다¹⁵. 그러나, 고도로 분화된 계대 1, 1차 인간 산전 RPE(hfRPE) 배양물에서 치사율 이하의 리소좀 억제는 매일 OS를 반복적으로 첨가했음에도 불구하고 리포푸신을 유도하는 데 실패했다¹⁶.

보다 환원주의적인 접근 방식으로, 다른 사람들은 단일 리포푸신 성분, 특히 비스-레티노이드 A2E ^4,17을 배양물에 공급했습니다. 이러한 연구는 리소좀 콜레스테롤과 세라마이드 항상성 등을 내포하는 개별 리포푸신 성분에 대한 잠재적인 직접적인 독성 기전을 정의한다는 점에서 가치가 있다¹⁸. 동시에, A2E¹⁹의 독성에 대한 논쟁이 있으며, 이를 세포에 직접 공급하는 것은 광수용체 OS의 식균 작용을 포함하는 리포푸신 축적의 전형적인 경로를 우회합니다. 리포푸신의 모든 성분을 RPE 배양물에 전달하기 위한 시도로, Boulton과 Marshall은 인간의 눈에서 리포푸신을 정제하여 태아 및 노인 인간 공여자로부터 유래한 인간 일차 RPE 배양물 4-7계대에 공급하였다²⁰. 혁신적이기는 하지만 이 방법은 반복 실험을 위한 제한된 리포푸신 공급원을 나타냅니다.

RPE 배양에 OS를 반복적으로 공급하면 많은 시스템에서 리포푸신이 생성되지만, 고도로 분화된 1차 RPE 배양에서는 리포푸신이 생성되지 않습니다¹⁶. 광산화 OS는 생체 내에서 리포푸신 형성 중에 자연적으로 발생하는 비스-레티노이드 형성과 같은 가교 반응을 유도합니다. 이는 RPE 배양 시스템에서 리포푸신 유사 과립 형성을 가속화할 수 있으며, 심지어 고도로 분화되고 리포푸신 축적에 내성이 있는 시스템에서도 가속화될 수 있다¹⁶. 여기서, 고도로 분화된 hfRPE 및 인간 iPSC-RPE에서 리포푸신 유사 과립 축적을 유도하는 방법이 도입되며, 이는 Wihlmark의 공개된 프로토콜²¹에서 변형됩니다. 이 방법은 생체 내에서 리포푸시노생성에 대해 발생하는 것과 동일한 공급원(광수용체 OS) 및 경로(phagolysososomal OS 흡수)를 사용하여 리포푸신 유사 과립을 유도하는 이점이 있습니다. 또한, 생체 내에서 인간 RPE를 복제하기 위해 여러 연구에서 고도로 차별화되고 검증된 인간 RPE 배양에서 수행됩니다 ^22,23,24. 이러한 리포푸신 유사 과립은 소화되지 않는 자가형광 물질(UAM)이라고 하며, 이 프로토콜에서 UAM을 생체 내 리포푸신과 비교하는 데이터 및 논의를 제공합니다. 고도로 분화된 인간 RPE에서 UAM이 함유된 배양을 구축하고 평가하는 방법과 함께 RPE OS 식균 작용을 평가하는 업데이트된 방법도 도입되었습니다. 웨스턴 블로팅, 면역세포화학 및 FACS^25,26,27을 포함하여 OS 식균 작용을 정량화하기 위한 여러 가지 우수한 펄스 추적 방법이 도입되었습니다. 그러나 OS 펄스 추적 초기에는 OS 활용률이 저하되는 조건이 내재화된 OS의 급격한 성능 저하를 촉진하는 조건과 혼동될 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 RPE에 의해 완전히 사용/저하된 도입된 OS의 총량(“총 소비 용량”)을 측정하여 이러한 모호성을 제거하는 데 도움이 됩니다. “총 소비 용량” 방법을 사용한 OS 식균 작용 속도에 대한 영향을 포함하여 이러한 프로토콜을 활용한 리포푸신 독성에 대한 통찰력은 생체 내에서 리포푸신의 독성을 밝히는 데 사용될 것으로 예상됩니다.

Protocol

인체 조직의 획득 및 사용과 관련된 현재 프로토콜은 University of Michigan Institutional Review Board(HUM00105486)에 의해 검토 및 승인되었습니다. 1. 광산화된 외측 세그먼트 팁 및 단편의 제조 참고: 어둠에 적응한 소 망막은 구입하여 얼음 위에서 배송했습니다( 재료 표 참조). 이들 망막으로부터, OS는 이전에 공개된 프로토콜23에 따라 ?…

Representative Results

OS의 광산화를 위한 설정은 그림 1Ai에 나와 있습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드는 슬라이드의 나머지 부분에 퍼지지 않고 열린 직사각형당 많은 양의 OS 용액을 로드할 수 있습니다. OS가 있는 슬라이드는 뚜껑이 벗겨진 멸균 페트리 접시 안에 들어 있으며 UV 램프는 그림 1Aii와 같이 슬라이드 위에 놓입니다. 대안적으로, 슬라이드는 <stro…

Discussion

RPE 리포푸신은 수십 년 동안 연구되어 왔지만 그 독성은 2,9,16,42에 대해 논의되고 있습니다. 동물 모델¹¹에서 리포푸신의 독성에 대한 모호성을 감안할 때, 인간 RPE를 사용하는 시험관 내 모델은 가치가 있다. 다양한 시험관 내 리포푸신 축적 모델이 설명되었지만 OS 공?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 유리체-망막 수술 재단(VRSF), 시력을 위한 싸움(FFS) 및 국제 망막 연구 재단(IRRF)의 보조금으로 부분적으로 지원됩니다. J.M.L.M.은 현재 국립 안과 연구소(National Eye Institute, EY033420)의 K08 보조금으로 지원되고 있습니다. HFT 연구에는 연방 기금이 사용되지 않았습니다. 제임스 그로스펠드 이니셔티브(James Grosfeld Initiative for Dry AMD)와 바바라 던(Barbara Dunn), 디 앤 딕슨 브라운(Dee & Dickson Brown)의 개인 기부자들의 지원이 더욱 지원된다.

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" - 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000

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Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).