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Biology

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

Abstract

망막 색소 상피(RPE)에 의한 광수용체 외부 세그먼트의 일일 식균 작용은 리포푸신(lipofuscin)이라고 하는 세포 내 노화 색소의 축적에 기여합니다. 리포푸신의 독성은 가장 흔한 유전성 망막변성인 스타가르트병에서 잘 알려져 있지만, 선진국에서 돌이킬 수 없는 실명의 주요 원인인 연령 관련 황반변성(AMD)에서 더 논란의 여지가 있습니다. 인간에서 리포푸신 독성을 결정하는 것은 어려웠으며 Stargardt의 동물 모델은 독성이 제한적이었습니다. 따라서 생체 내에서 인간 RPE를 모방하는 시험관 내 모델은 리포푸신 생성, 제거 및 독성을 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 현재까지 대부분의 세포 배양 리포푸신 모델은 세포주에 있었거나 전체 광수용체 외부 세그먼트의 단편/팁이 아닌 복합 리포푸신 혼합물의 단일 성분을 RPE에 공급하여 보다 완전하고 생리학적인 리포푸신 모델을 생성했습니다. 여기에 기술된 것은 고도로 분화된 일차 인간 산전 RPE(hfRPE) 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 RPE에서 리포푸신 유사 물질(소화되지 않는 자가형광 물질, 또는 UAM으로 명명됨)의 축적을 유도하는 방법이다. 식균 작용을 통해 RPE에 의해 흡수된 자외선 처리된 OS 단편의 반복 공급에 의해 배양에 축적된 UAM. UAM이 생체 내에서 리포푸신과 유사하고 다른 주요 방법도 논의됩니다. 이 리포푸신 유사 축적 모델과 함께 UAM 과립의 광범위한 자가형광 스펙트럼을 동시 항체 염색과 구별하는 이미징 방법이 도입되었습니다. 마지막으로, RPE 식균 작용 능력에 대한 UAM의 영향을 평가하기 위해 외부 세그먼트 조각/팁 흡수 및 분해를 정량화하는 새로운 방법이 도입되었습니다. "총 소비 용량"이라고 하는 이 방법은 고전적인 외부 세그먼트 "펄스 추적" 분석에 내재된 RPE 식균 작용 용량의 잠재적인 오해를 극복합니다. 여기에 소개된 모델과 기술은 리포푸신 생성 및 제거 경로와 추정 독성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체 외부 세그먼트 팁 또는 단편의 일일 흡수 및 분해를 포함하여 위에 있는 광수용체에 대한 중요한 지원을 제공합니다(이 프로토콜 전체에서 약어 OS는 전체 외부 세그먼트가 아닌 OS 팁 또는 단편을 나타냄). 유사분열 후 RPE의 이러한 일일 섭취는 결국 포골리소좀 용량에 과부하를 일으키고 리포푸신이라고 하는 소화되지 않는 자가형광 세포 내 물질의 축적으로 이어집니다. 흥미롭게도, 여러 연구에서 RPE 리포푸신이 OS 식균작용 없이 축적될 수 있음이 입증되었습니다 1,2. 리포푸신은 시각 주기 레티노이드에서 파생된 가교 부가물을 포함하여 많은 성분을 가지고 있으며 80세 이상의 경우 RPE 세포 부피의 거의 20%를 차지할 수 있습니다3.

리포푸신이 독성이 있는지 여부는 뜨거운 논쟁거리입니다. 스타가르트병은 ABCA4의 돌연변이가 광수용체 외부 세그먼트 내에 포함된 시각 주기 레티노이드의 부적절한 처리를 유발하는 광수용체 및 RPE의 상염색체 열성 변성입니다. 부적절한 레티노이드 처리는 비스-레티노이드 N-레티닐리덴-N-레티닐에탄올아민(A2E)을 포함한 비스-레티노이드 종의 비정상적인 가교 결합 및 형성을 초래합니다. 연구는 A2E 독성에 대한 여러 메커니즘을 입증했습니다 4,5. 리포푸신은 임상 영상 촬영 중 안저 자가형광 신호에 기여하며, Stargardt의 환자와 동물 모델 모두 망막 변성 전에 증가된 안저 자가형광을 나타내며, 이는 리포푸신 수치와 독성 사이의 상관관계를 시사합니다 6,7. 그러나 나이가 들어감에 따라 리포푸신은 RPE 퇴행을 유발하지 않고 모든 인간에게 축적됩니다. 또한, RPE 변성이 노인 환자에서만 발생하는 연령 관련 황반변성(AMD)의 경우, 초기 및 중간 형태의 황반변성을 가진 사람들은 연령이 일치하지 않는 사람보다 안저 자가형광 신호가 적다8. 이러한 임상 소견은 조직학적 수준에서도 검증되었습니다 9,10.

RPE 리포푸신 축적의 동물 모델은 또한 리포푸신 독성에 대해 약간의 모호성을 남겼습니다. ABCA4 녹아웃 마우스는 착색된 배경에서는 망막 변성을 나타내지 않는 반면, 알비노 배경에서는 또는 청색광에 노출될 때 나타납니다11,12. 또한, ABCA4 녹아웃을 통해 유도된 리포푸신의 독성은 AMD13에서 볼 수 있듯이 자연 노화와 함께 발생하는 더 천천히 축적되는 리포푸신과 다를 수 있습니다.

리포푸신 축적의 시험관 내 모델은 리포푸신 축적이 RPE 건강에 미치는 영향을 연구하는 대안을 제공합니다. 이러한 모델은 단일 레티노이드 성분 공급에서 OS 공급에 이르기까지 리포푸신 성분을 조작할 수 있게 하고 동물 RPE가 아닌 인간에서 연구할 수 있도록 합니다. 지난 수십 년 동안 배양에서 RPE 리포푸신을 모델링하기 위해 여러 방법이 개발되었습니다. 다른 그룹과 함께, Boulton 박사의 그룹은 4세에서 85세 사이의 기증자로부터 4-7개의 인간 일차 RPE 세포를 통과하여 최대 3개월 동안 매일 소 OS를 공급했습니다14. 대안적으로, 자가포식의 억제는 또한 계대 3 내지 7 일차 인간 RPE 배양물에서 리포푸신 축적을 유도하였다15. 그러나, 고도로 분화된 계대 1, 1차 인간 산전 RPE(hfRPE) 배양물에서 치사율 이하의 리소좀 억제는 매일 OS를 반복적으로 첨가했음에도 불구하고 리포푸신을 유도하는 데 실패했다16.

보다 환원주의적인 접근 방식으로, 다른 사람들은 단일 리포푸신 성분, 특히 비스-레티노이드 A2E 4,17을 배양물에 공급했습니다. 이러한 연구는 리소좀 콜레스테롤과 세라마이드 항상성 등을 내포하는 개별 리포푸신 성분에 대한 잠재적인 직접적인 독성 기전을 정의한다는 점에서 가치가 있다18. 동시에, A2E19의 독성에 대한 논쟁이 있으며, 이를 세포에 직접 공급하는 것은 광수용체 OS의 식균 작용을 포함하는 리포푸신 축적의 전형적인 경로를 우회합니다. 리포푸신의 모든 성분을 RPE 배양물에 전달하기 위한 시도로, Boulton과 Marshall은 인간의 눈에서 리포푸신을 정제하여 태아 및 노인 인간 공여자로부터 유래한 인간 일차 RPE 배양물 4-7계대에 공급하였다20. 혁신적이기는 하지만 이 방법은 반복 실험을 위한 제한된 리포푸신 공급원을 나타냅니다.

RPE 배양에 OS를 반복적으로 공급하면 많은 시스템에서 리포푸신이 생성되지만, 고도로 분화된 1차 RPE 배양에서는 리포푸신이 생성되지 않습니다16. 광산화 OS는 생체 내에서 리포푸신 형성 중에 자연적으로 발생하는 비스-레티노이드 형성과 같은 가교 반응을 유도합니다. 이는 RPE 배양 시스템에서 리포푸신 유사 과립 형성을 가속화할 수 있으며, 심지어 고도로 분화되고 리포푸신 축적에 내성이 있는 시스템에서도 가속화될 수 있다16. 여기서, 고도로 분화된 hfRPE 및 인간 iPSC-RPE에서 리포푸신 유사 과립 축적을 유도하는 방법이 도입되며, 이는 Wihlmark의 공개된 프로토콜21에서 변형됩니다. 이 방법은 생체 내에서 리포푸시노생성에 대해 발생하는 것과 동일한 공급원(광수용체 OS) 및 경로(phagolysososomal OS 흡수)를 사용하여 리포푸신 유사 과립을 유도하는 이점이 있습니다. 또한, 생체 내에서 인간 RPE를 복제하기 위해 여러 연구에서 고도로 차별화되고 검증된 인간 RPE 배양에서 수행됩니다 22,23,24. 이러한 리포푸신 유사 과립은 소화되지 않는 자가형광 물질(UAM)이라고 하며, 이 프로토콜에서 UAM을 생체 내 리포푸신과 비교하는 데이터 및 논의를 제공합니다. 고도로 분화된 인간 RPE에서 UAM이 함유된 배양을 구축하고 평가하는 방법과 함께 RPE OS 식균 작용을 평가하는 업데이트된 방법도 도입되었습니다. 웨스턴 블로팅, 면역세포화학 및 FACS25,26,27을 포함하여 OS 식균 작용을 정량화하기 위한 여러 가지 우수한 펄스 추적 방법이 도입되었습니다. 그러나 OS 펄스 추적 초기에는 OS 활용률이 저하되는 조건이 내재화된 OS의 급격한 성능 저하를 촉진하는 조건과 혼동될 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 RPE에 의해 완전히 사용/저하된 도입된 OS의 총량("총 소비 용량")을 측정하여 이러한 모호성을 제거하는 데 도움이 됩니다. "총 소비 용량" 방법을 사용한 OS 식균 작용 속도에 대한 영향을 포함하여 이러한 프로토콜을 활용한 리포푸신 독성에 대한 통찰력은 생체 내에서 리포푸신의 독성을 밝히는 데 사용될 것으로 예상됩니다.

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Protocol

인체 조직의 획득 및 사용과 관련된 현재 프로토콜은 University of Michigan Institutional Review Board(HUM00105486)에 의해 검토 및 승인되었습니다.

1. 광산화된 외측 세그먼트 팁 및 단편의 제조

참고: 어둠에 적응한 소 망막은 구입하여 얼음 위에서 배송했습니다( 재료 표 참조). 이들 망막으로부터, OS는 이전에 공개된 프로토콜23에 따라 정제되었다.

  1. UV 램프를 사용한 외부 세그먼트 가교
    1. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드( 재료 표 참조)를 70% 에탄올에 10분 동안 완전히 담그고 생물 안전 캐비닛에 넣어 슬라이드를 살균합니다. 슬라이드를 멸균된 100mm 세포 배양 접시에서 자연 건조시킵니다.
    2. 각 슬라이드를 하나의 새로운 100mm 세포 배양 접시에 넣고 200μL의 혈청 함유 세포 배양 배지(RPE 배양에 일반적으로 사용되는 배지)를 각 직사각형에 추가한 다음 전구가 슬라이드를 직접 향하도록 하여 휴대용 254nm UV 광선(재료 표 참조)을 100mm 세포 배양 접시(뚜껑 없음)에 놓습니다. 20 분 동안 노출시킵니다. 이 연구에 특별히 사용된 배지와 배지 구성 요소에 대한 특정 제품 번호는 이전에 발표되었습니다22,23. 이 프로토콜을 통해 이 미디어를 "RPE 미디어"라고 합니다.
      알림: 미디어의 UV 처리는 유리 표면을 차단하고 다음 단계에서 OS가 달라붙는 것을 방지합니다.
    3. OS의 냉동 분취량을 37°C에서 해동합니다(손에 들고 또는 수조 를 통해 ). 필요한 OS의 양은 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 일반적으로 슬라이드에서 직사각형당 최대 500μL의 2 x 108 OS/mL를 처리할 수 있습니다.
    4. 해동되면 실온에서 5분 동안 2400 x g 로 OS를 돌립니다. 펠릿의 우발적인 손실을 방지하기 위해 진공 대신 피펫을 사용하여 생물 안전 캐비닛의 상층액을 즉시 흡인합니다.
    5. 멸균 PBS로 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
      알림: 재현탁된 볼륨과 예상 농도를 추적하십시오. 예를 들어, 500 μL PBS를 사용하여 1 x 10 8 OS/mL의 1 mL 튜브에서 펠릿을 재현탁하면 2 x 108 OS/mL가 생성됩니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드의 직사각형당 최대 부피 및 농도는 2 x 108 OS/mL의 500μL입니다.
    6. 슬라이드에서 배지를 흡인하고 슬라이드의 각 직사각형에 최대 500μL의 2 x 108 OS/mL PBS 용액을 놓습니다. 전구가 OS를 직접 향하도록 하여 세포 배양 접시(뚜껑 없음) 위에 휴대용 UV 광선을 놓습니다. OS 솔루션을 254nm 빛에 40분 동안 노출시킵니다.
      알림: 40분 동안 노출되는 동안 UV l을 덮으십시오.amp수건이나 흡수 패드로 접시를 닫고 생물 안전 캐비닛 새시를 닫고 송풍기를 끕니다. 이렇게 하면 상당한 증발이 발생하는 것을 방지할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 UV 램프를 연구자가 사용할 수 없는 경우 적절한 양의 가교가 달성되도록 하는 두 가지 대안이 있습니다. 첫 번째는 1.2단계에서 설명한 장치 또는 1.2단계에서 설명한 것과 동일한 정량적 복사 노출을 제공할 수 있는 다른 장치를 사용하여 1.2단계에서 설명한 정량적 UV 노출을 따르는 것입니다. 또 다른 대안은 OS를 UV 조사에 노출시켜 도 1C에서 볼 수 있는 쿠마시 염색 상의 가교 정도를 유도하는 것이다.
    7. 처리된 OS PBS 용액을 멸균 미세원심분리 튜브에 수집하고, 코팅된 슬라이드의 사각형을 200-500 μL의 PBS(2-3x)로 다시 세척하고, 각각의 세척을 미세원심분리 튜브에 수집한다. 완료되면 조직 배양실 현미경으로 슬라이드를 보고 슬라이드에서 거의 모든 OS가 제거되었는지 확인합니다.
    8. 실온에서 5분 동안 2400 x g 에서 OS PBS 용액을 회전시키고, 피펫터로 생물안전 캐비닛에서 PBS를 흡인하고, RPE 배양에 사용할 500μL 표준 배지(예: 섹션 1.1.2에 정의된 "RPE 배지")에 다시 현탁합니다. 재현탁 부피는 원하는 광산화 OS(OxOS) 농도에 기초하여 조절될 수 있다.
    9. 현탁액 10μL를 새 미세 원심분리기 튜브에 넣고 더 많은 세포 배양 배지로 50-100배 희석한 다음 혈구계로 OS를 계산합니다.
    10. OS 수에 따라 OxOS 현탁액을 최종 스톡 농도로 희석합니다. 24웰 Transwell(표면적 0.33 cm 2, 표 참조)에서 고도로 성숙한 RPE 배양물을 공급하려면2 x 107 OS/mL의 최종 배지 농도가 권장됩니다.
      1. 이를 달성하기 위해 OxOS를 5.6 x 107 OS/mL 농도의 25μL 분취량으로 분배하고 표준 RPE 배양 배지에 현탁합니다. 25μL 분취액을 해동한 후 전체 분취액을 45μL의 표준 RPE 배양 배지와 혼합하여 각 OxOS Transwell 공급에 대해 70μL의 최종 배지 부피와 2 x 107 OS/mL의 OS 농도를 제공합니다.
    11. OxOS를 분취하기 전에 OS 흡수 및 리포푸신 축적을 촉진하는 식균 작용 가교 리간드(단백질 S 및 MFG-E8, 재료 표 참조)를 추가합니다. 24웰 Transwell에서 가교 리간드의 작동 농도는 인간 정제 단백질 S의 경우 4μg/mL이고 인간 재조합 MFG-E8의 경우 1.5μg/mL입니다. 따라서 5.6 x 107 OS/mL에서 OxOS의 25μL 분취량에 대해 단백질 S의 스톡 농도는 11.2μg/mL이고 MFG-E8의 스톡 농도는 4.2μg/mL입니다.
      참고: 가교 리간드 농도는 24-웰 Transwell에서 hfRPE 배양에 최적화되었으며, 대략 세포 수는 0.33cm2 웰당 320,000개의 세포입니다. 식균작용 수용체 가용성을 초과하는 리간드가 역설적으로 OS 흡수를 차단할 수 있기 때문에 리간드 농도는 다른 RPE 유형 및 세포 밀도에 맞게 조정되어야 할 수 있습니다28.
    12. 액체 질소에서 분취량을 스냅 동결합니다.
      참고: 여러 번의 동결-해동은 OS 무결성에 매우 해롭습니다.
  2. UV 가교제 장치를 사용한 외부 세그먼트 가교
    참고: 1.1.2 및 1.1.6 단계를 각각 대체하는 아래 단계를 제외하고 1.1 단계를 따르십시오.
    1. (1.1.2단계 대체) 각 슬라이드를 하나의 새로운 100mm 세포 배양 접시에 넣고 200μL의 혈청 함유 세포 배양 배지(예: "RPE 배지" 또는 기타 대체품)를 각 직사각형에 추가한 다음 슬라이드를 자외선 가교 장치( 재료 표 참조)에 넣고 3-6J/cm2 의 복사 노출에서 254nm UV로 처리하여 유리 표면을 차단하고 다음 단계에서 OS가 달라붙는 것을 방지합니다.
    2. (1.1.6단계 대체) 슬라이드에서 배지를 흡인하고 최대 500μL의 2 x 108 OS/mL를 슬라이드의 각 직사각형에 멸균 PBS에 넣습니다. 자외선 가교제 장치에 슬라이드를 놓고 필요에 따라 처리 복사 노출(3-9J/cm2)을 설정하고 254nm에서 처리합니다.
      참고: 필요한 복사 노출은 자가형광 정도가 달성되고 단백질 가교(그림 1B 및 그림 1C에서 볼 수 있음)가 달성될 때까지 3-9J/cm2 사이의 복사 노출을 적정하여 신중하게 결정할 수 있습니다.
      주의 : 생물 안전 캐비닛 외부에서 OS를 취급하면 오염될 수 있습니다. UV 가교제 장치에 OS를 노출시킨 후 멸균 피펫 팁으로 OS를 수집하고 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 생물 안전 후드의 모든 추가 단계를 처리합니다.
  3. Oxidized OS의 특성화
    1. 이미징을 통한 자가형광 방출 스펙트럼 정량화
      1. 처리되지 않은 OS 및 OxOS의 원액 20-50μL를 두 개의 별도 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 실온에서 2400 x g 에서 5 분 동안 원심 분리하고, 완충 된 (예 : PBS) 4 % 파라 포름 알데히드에 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 15 분 동안 고정합니다.
      2. 고정 후 위와 같이 스핀다운하고 PBS x 2(세척 사이에 스핀 다운)로 세척한 다음 30μL 미만의 PBS로 재현탁합니다.
      3. 현미경 슬라이드에 몇 마이크로리터의 재현탁액을 놓고 마운팅 미디어( 재료 표 참조)를 추가하고 마지막으로 커버슬립을 추가합니다.
      4. 이미지 OxOS 컨포칼 현미경( 재료 표 참조).
        참고: OxOS 자가형광은 광범위한 레이저 파장에 의해 여기될 수 있지만 일반적으로 405nm 또는 488nm 레이저 라인이 사용됩니다. 방출도 비슷하게 광범위하지만 일반적인 GFP/FITC 여기/방출 필터 설정은 자가형광을 보기에 적합합니다.
      5. OxOS 방출 스펙트럼을 측정하려면 컨포칼 현미경에서 λ-스캐닝을 사용하십시오. 일반적인 λ 스캔 설정에는 405nm 또는 488nm의 여기와 레이저 여기 라인에서 약 800nm까지 10nm 적색 편이, 10nm의 λ 스텝 크기로 방출 감지가 포함됩니다. 각 현미경 시스템에는 λ 모드를 사용하는 방법에 대한 고유한 지침이 있으며 판독기는 특정 공초점에 대한 설명서를 참조해야 합니다.
    2. 대안으로, 유세포 분석에 의한 자가형광을 정량화합니다.
      1. 미세 원심분리기 튜브에서 2 x 10 7 처리되지 않은 OS와 별도로 2 x 107 OxOS를 스핀다운하고 1mL의 PBS에 재현탁합니다.
        참고: 해동 직후 유세포 분석을 수행하는 경우 고정이 필요하지 않습니다.
      2. 처리되지 않은 OS 및 OxOS 샘플을 유세포 분석기에 로드합니다( 재료 표 참조). FSC-SSC 산란 그래프에서 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)을 허용 가능한 산포로 조정합니다. PBS를 대조군으로 사용하여 오염된 작은 입자를 배제합니다. OS는 셀보다 상당히 작습니다.
      3. 자가형광 정량을 위해 유세포분석기의 표준 FITC 채널을 사용합니다. 최소 10,000개의 이벤트를 계산합니다. FITC 히스토그램의 펄스 면적 값을 사용하여 형광 강도를 나타냅니다.
        참고: 본 연구의 경우 모든 데이터는 제조업체의 지침에 따라 유세포 분석기 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 분석됩니다.
    3. 가교 정도 평가 OxOS
      1. 마이크로 원심분리기 튜브에서 2 x 10 7 처리되지 않은 OS와 별도로 2 x 107 OxOS를 스핀다운합니다. 상층액을 제거하고 1.2x Laemmli 샘플 버퍼를 추가하여 펠릿을 직접 용해합니다(덮을 수 있을 정도로, 재료 표 참조). 소용돌이, 실온에서 30분 동안 유지하고, 실온에서 12000 x g 이상으로 10분 동안 회전시키고, 상등액을 수집합니다.
        참고: OxOS에서 단백질 가교 정도를 평가하면 UV 처리의 적절성을 알 수 있습니다. 처리되지 않은 OS와 OxOS를 비교하며, Coomassie 염색을 지배하는 단량체 로돕신 밴드(그림 1C, 화살표)가 감지할 수 있을 때 적절한 가교 결합이 발생하며, 겔 상단에 고차 응집체와 단백질 도말이 나타납니다.
        주의 : 사용할 때ampOS를 용해하기 위해 버퍼를 사용하는 경우, 로돕신 응집을 유발할 수 있으므로 용해 용액을 가열하지 마십시오. 또한 SDS를 침전시킬 수 있으므로 스토리지가 준비될 때까지 lysed OS를 냉각하지 마십시오. 사용하지 않은 용해물은 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 재해동하는 경우 사용하기 전에 용해물을 실온에서 완전히 해동해야 합니다.
      2. 높은 SDS 및 환원제 농도에 내성이 있는 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화합니다29. 적절한 단백질 분석 시약에 대한 제안은 재료 표를 참조하고 이러한 시약에 대한 제조업체 프로토콜을 따르십시오.
      3. 표준 트리스-글리신 SDS 버퍼를 사용하여 4%-15% 그래디언트 겔에서 SDS-PAGE 전기영동30 으로 처리되지 않은 OS 및 OxOS 샘플을 실행합니다. 겔은 샘플이 스택에 들어갈 때까지 80V에서 실행한 다음 실온에서 120V에서 50-60분 동안 실행합니다.
      4. 표준 프로토콜31을 사용하여 Coomassie blue로 젤을 염색합니다. Coomassie 염색은 UV 처리에 의해 유도된 가교의 적절성을 입증할 것이다.

2. RPE 배양에서 리포푸신 유사 과립(UAM) 구축

  1. OxOS 공급: 양, 빈도 및 식균 작용 가교 리간드
    참고: 먹이는 Bharti 실험실(iPSC-RPE용)32에서 설명한 프로토콜에 따라 성장한 통로 1의 인간 iPSC-RPE 또는 hfRPE 배양에서 발생하며, Sheldon Miller 실험실22,23에서 채택한 hfRPE에 대해 이전에 요약된 프로토콜에 따라 성장합니다. 아래의 모든 계산은 하나의 24-웰 트랜스웰(6.5 mm 직경, 0.33cm2 성장 영역)에 OxOS 또는 OS를 공급하는 것을 기반으로 한다.
    1. 37°C에서 5.6 x 107 OxOS/mL 25μL를 해동하고 45μL의 세포 배양 배지를 OxOS 분취액에 추가하여 최종 부피가 70μL가 됩니다.
      참고: 1단계에서 제조된 OxOS 분취액에는 식균 작용 가교 리간드 MFG-E8 및 단백질 S가 포함됩니다. 그러나 이러한 리간드가 동결 전에 분취량에 첨가되지 않은 경우 이 단계에서 첨가하여 세포에 공급할 배지의 리간드의 최종 농도가 단백질 S의 경우 4μg/mL, MFG-E8의 경우 1.5μg/mL가 되도록 할 수 있습니다. 1.1.11 단계에서 설명한 바와 같이, 가교 리간드의 농도는 다른 RPE 유형 또는 세포 밀도에 대해 변경되어야 할 수 있습니다.
    2. Transwell에서 정점 배지를 제거하고 식균 작용 가교 리간드와 함께 70μL의 2 x 107 OxOS/mL를 정점 챔버에 추가합니다. 24시간 후 제거하고 새 OxOS 공급으로 교체하십시오. 수유는 평일에는 매일 이루어지며 주말은 건너 뛰고 20 회 수유가 완료 될 때까지 (~ 1 개월) 이루어집니다. 기저외측 세포 배양 배지(400-550 μL)를 2-3회/주 변경합니다.
    3. 20 회 공급이 완료되면 우물에 대한 정상적인 배지 교체를 재개하십시오.
      알림: RPE 정점 표면에서 끈적끈적한 OxOS를 씻어내려면 몇 가지 추가 배지 변경이 필요하므로 UAM이 함유된 배양에 대한 실험은 OxOS 공급이 끝난 후 최소 1-2주 후에 수행해야 합니다.
      주의 : UAM 축적을 위한 적절한 제어가 중요합니다. 매일 배지 교체가 RPE 생물학에 영향을 미칠 수 있으므로 다음과 같은 대조군 웰이 권장됩니다. 대조군 1: OxOS 처리 그룹과 동일한 수의 수유를 위해 평일 동안 매일 배지를 교체하십시오. 제어 2: 동일한 수의 급식에 대해 OxOS 급식과 동일한 농도 및 양으로 평일 동안 RPE를 처리하지 않은 OS를 매일 공급합니다.
  2. 경상피 전기 저항(TEER) 및 세포 사멸 분석을 통해 리포푸신 유사 과립이 함유된 배양물의 건강 모니터링
    참고: OxOS 공급 중 및 후에 RPE 배양의 건강은 RPE 밀착 접합 무결성 및 세포 사멸을 평가하여 측정할 수 있습니다. 경상피 전기 저항(TEER) 측정을 통한 밀착 접합 무결성 평가는 일반적인 세포 건강에 대한 민감한 마커임이 이전에 밝혀졌습니다33. 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출과 같은 세포 사멸의 보다 전통적인 비침습적 마커도 사용할 수 있습니다.
    1. TEER 수행
      참고: TEER는 일반적으로 제조업체의 지침에 따라 경상피 전기 저항(TEER) 측정기와 TEER 전극으로 테스트됩니다( 재료 표 참조).
      1. TEER 전극을 멸균하려면 70% 에탄올에 적신 작업 와이퍼를 사용하여 전극을 청소한 다음 전극 프로브의 팁을 70% 에탄올에 10분 동안 담그십시오.
      2. 전극을 완전히 건조시킨 다음 전극을 멸균 매체에 담그십시오.
      3. 멸균 매체에서 프로브를 제거하고 TEER 전극의 두 프로브를 배양된 Transwell의 정점 및 기저외측 챔버에 삽입합니다. 더 긴 프로브 팁은 기저측 챔버에 맞습니다.
        알림: 연습 없이 TEER 전극으로 정점 챔버의 바닥을 긁는 것은 쉬우며, 이러한 긁힘은 합류 RPE 단층이 중단됨에 따라 TEER 판독값을 극적으로 변경합니다. 따라서 초보자는 실험적 RPE 배양을 테스트하기 전에 중요하지 않은 Transwell에 대해 연습하는 것이 좋습니다. 또한, RPE 배양의 각 플레이트를 테스트한 후 실험자는 표준 조직 배양 현미경으로 RPE 단층의 긁힘이 있는지 확인해야 합니다.
      4. 정점 및 기저측 프로브가 Transwell에 배치되면 읽기 버튼을 누르거나 미터의 풋 스위치를 밟아 TEER을 기록합니다. 플레이트 또는 세포 그룹 사이에서 전극 프로브를 멸균 매체로 세척하십시오. 감염이 우려되는 경우 플레이트 사이에서 재멸균하십시오.
      5. 미터에서 저항 판독값을 취하고, 매체가 있지만 셀이 없는 빈 Transwell의 값(일반적으로 100cm110 표면적을 가진 24웰 Transwell의 경우 0.33-2 Ω)을 뺀 다음 Transwell의 표면적을 곱하여 TEER을 계산합니다.
        참고: TEER 값은 세포 표면적으로 정규화된 상태로 보고되어야 합니다. 건강한 hfRPE 배양의 일반적인 값은 350-1100Ωcm2 범위입니다. TEER 값은 온도가 감소함에 따라 증가합니다. 따라서, 배양물을 37°C 인큐베이터로부터 실온 후드로 제거할 때, TEER 값은 플레이트를 가로질러 증가하는 경향이 있을 것이다. 이러한 변동성을 방지하려면 신속하게 작업하거나(경험이 있는 경우) 플레이트 온도가 실온과 평형을 이룰 때까지 10-15분 동안 기다리십시오.
    2. LDH 방출 분석 수행
      참고: 세포 배양 상청액으로의 LDH 방출은 세포 사멸 중에 발생하며 표준 키트로 측정됩니다( 재료 표 참조).
      1. 24시간 배양 후 세포 위에서 상층액을 수집하고 표준 배지를 사용하여 1:100으로 희석합니다.
      2. 24-웰 트랜스웰의 대조군 세포로부터 100μL의 정점 배지에 2μL 10% 트리톤 X-100을 첨가하여 2.2.2.1단계의 모든 값을 정규화하는 데 중요한 가능한 총 LDH 방출을 유도합니다. 트리톤/세포 상청액 혼합물을 37°C에서 15분 동안 배양한 후, 현재 용해된 세포 위의 배지를 혼합하고 수집하여 가능한 총 LDH 방출을 측정합니다.
      3. 상층액이 수집되면 제조업체 표준 지침에 따라 분석을 수행하고 키트의 버퍼 용액을 사용하여 30분 배양 후 발광을 측정합니다.
        참고: 모든 LDH 값은 가능한 총 LDH 방출량으로 정규화됩니다.
  3. 리포푸신 유사 과립 스펙트럼 및 조성의 특성화
    1. Autofluorescence 정량화 및 스펙트럼 획득
      1. UAM이 함유된 배양물을 실온에서 4% PFA로 15분 동안 고정한 후 PBS 세척 5x.
      2. 정점 챔버에 소량의 PBS를 보관한 다음 Transwell을 거꾸로 뒤집습니다. 해부 현미경과 면도날을 사용하여 Transwell에서 반 다공성 멤브레인을 절단하고 멤브레인과 Transwell의 접합부에 절삭력을 가합니다.
        알림: 절단이 일관되지 않을 때 Transwell 멤브레인이 뒤틀리고 주름지는 경향이 있으므로 절단이 Transwell의 입술에 얼마나 가까운지에 대해 일관성을 유지하십시오.
      3. Transwell 멤브레인이 절단되면 즉시 집게를 사용하여 현미경 슬라이드에 놓고 Transwell 멤브레인의 일부가 세포와 접촉하지 않도록 주의하십시오. 세포를 만지지 않도록 작업 닦기로 과도한 PBS를 제거합니다. 장착 미디어와 커버슬립을 추가합니다. Transwell을 덮을 때 Transwell의 어느 쪽이 "오른쪽이 위로" 있는지 추적해야 합니다.
      4. 1.3.1.4 단계 및 1.3.1.5 단계와 동일한 설정 및 절차를 사용하여 자가형광 강도 및 스펙트럼을 획득합니다.
        알림: UAM을 이미징할 때 중요한 교란 요인은 OxOS가 자가형광성이며 종종 OxOS 공급 완료 후 며칠, 때로는 몇 주 동안 RPE 정점 표면에 달라붙는다는 것입니다. 결과적으로 UAM을 정량화할 때 측정된 자가형광이 OxOS가 아닌 UAM에서 나오는지 확인하는 방법을 사용해야 합니다. 가장 쉬운 방법은 리포푸신 배양액을 로돕신 항체와 함께 염색하는 것입니다. 예를 들어, 항-로돕신 항체 4D2는 1:1000 희석 및 표준 PFA-고정 면역세포화학 프로토콜34와 함께 사용될 수 있다. 로돕신에 대한 2차 항체는 UAM 및 OxOS 자가형광이 이 파장에서 가장 약한 경향이 있기 때문에 원적외선 염료 접합 항체(예: 여기 최대값이 647nm 근처)여야 합니다. 그런 다음 공초점 이미지를 두 채널에서 순차적으로 획득하여 405nm 레이저로 UAM 및 OxOS 자가형광을 여기시키고 415nm에서 550nm까지 방출할 수 있으며, 소화되지 않은 OxOS를 나타내는 잔류 로돕신은 별도의 채널에서 표준 원적외선 염료 이미징 매개변수로 여기될 수 있습니다. 획득 후 로돕신 채널은 ImageJ와 같은 프로그램에서 빼기 마스크로 사용하여 끈적끈적한 나머지 OxOS에서 나오는 자가형광을 제거하고 정량화할 UAM 자가형광만 남길 수 있습니다.
        주의 : 광산화되지 않은 OS도 약간의 자가형광을 나타내며 엄격한 세척에도 불구하고 일부 OS 및 OxOS는 RPE 표면에 달라붙습니다. 따라서, 상기 NOTE에서 제안된 바와 같이, 로돕신 면역염색을 사용하여 감산 마스크를 생성하지 않고, OxOs 또는 표준 OS를 공급한 배양물에서 UAM 자가형광 수준의 정확한 정량화는 불가능하다.
    2. 리포푸신 유사 과립 및 기타 면역형광 마커의 동시 검출 수행
      참고: 2.3.1단계에서 자세히 설명했듯이 리포푸신의 넓은 자가형광 스펙트럼은 형광 동시 염색을 위한 선택을 제한합니다. 동시염색을 용이하게 하기 위해 다음의 방법을 고려할 수 있다.
      1. 원적외선 형광단을 활용하십시오. 리포푸신의 자가형광은 근적외선에서 약합니다. 따라서 관심 항원의 형광 검출을 위해 원적외선 염료를 활용하고 컨포칼 현미경에서 채널 설정을 세심하게 조정하면 일반적으로 자가형광과 동시 염색 형광을 구별할 수 있습니다.
      2. 리포푸신의 긴 형광 방출 꼬리를 활용하십시오.
        참고: 리포푸신은 형광 방출 스펙트럼이 매우 넓기 때문에 낮은 nm 파장(예: 405nm 레이저)에서 여기될 수 있으며 스펙트럼의 주황색/빨간색 부분(예: 585-635nm)에서 방출이 여전히 감지될 수 있습니다. 여기 파장과 방출 파장의 이 독특한 조합은 종종 다른 동시 염색 형광단을 중심으로 조정될 수 있습니다.
        1. 약 488nm의 피크 여기와 500-530nm의 방출 검출이 있는 형광단을 사용하여 관심 항원을 검출합니다. 405 nm 여기 및 585-635 nm 방출로 자가형광 검출을 위한 별도의 채널을 설정합니다. 이 두 번째 채널은 UAM만 감지하는 반면 첫 번째 채널은 관심 항원과 리포푸신을 감지합니다.
        2. ImageJ와 같은 프리웨어 프로그램을 사용하여 이 두 번째 UAM 전용 채널을 빼기 마스크로 사용하여 첫 번째 채널(항원 신호와 UAM 신호 모두 포함)에서 UAM 신호를 제거합니다.
      3. 스펙트럼 비혼합을 활용합니다. 대부분의 최신 컨포칼 현미경에는 스펙트럼 비혼합 옵션이 포함되어 있습니다. 이를 통해 UAM만으로 샘플의 스펙트럼을 획득하고 관심 있는 동시 염색 형광단만 있는 다른 샘플의 스펙트럼을 획득할 수 있습니다. 그런 다음 UAM과 동시 염색 형광단을 모두 포함하는 실험 샘플을 획득하고 선형 비혼합 방법을 사용하여 자가형광 대 공동 염색에서 나온 신호의 퍼센트를 계산할 수 있습니다.
        참고: 스펙트럼 비혼합에 대한 포괄적인 가이드는 대부분의 최신 컨포칼 현미경에서 사용할 수 있습니다.
      4. 형광 수명 이미징을 활용합니다. UAM과 관심 있는 동시 염색 형광단 사이의 방출 스펙트럼은 유사할 수 있지만 형광 수명은 크게 다를 수 있습니다. 일반적으로 UAM은 대부분의 특정 형광단보다 형광 수명이 짧습니다. 평생 이미징이 가능한 컨포칼 현미경을 사용하면 형광 신호를 게이트하여 일반적인 리포푸신 수명보다 긴 신호를 감지할 수 있습니다.
        참고: 일반적으로 형광 수명을 2ns보다 긴 신호로 게이팅하면 신호가 완전히 제거되지는 않지만 UAM 오염이 크게 줄어듭니다.
      5. 자가형광 억제기를 활용합니다. 전통적으로, 수단 블랙은 특이적 면역형광 염색 전에 자가형광을 소멸시키기 위해 사용되어 왔다35. 상업적으로 이용 가능한 여러 자가형광 소광제 제품은 수단 블랙의 결과를 개선하기 위해 보고되며 이러한 제품은 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다. 물론자가 형광 소광은 리포 푸신 검출 능력을 파괴합니다.
    3. lipofuscin-like 과립의 조성을 결정하십시오
      1. 중성 지질 평가
        1. 실온에서 15분 동안 4% PFA에 UAM이 함유된 RPE 및 제어 웰(처리되지 않은 OS 공급)을 고정하고 PBS 5x로 세척합니다.
        2. 실온에서 1시간 동안 3% BSA PBS 용액에 10μg/mL Nile Red 또는 3.33μg/mL Bodipy 493/503을 사용하여 중성 지질에 대한 염색을 한 다음 PBS로 5분 3배 세척합니다.
        3. 2.3.1.2 및 2.3.1.3 단계와 같이 Transwell을 잘라내어 장착하고 이미지. 일반적으로 이미징을 위해 Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm 및 Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm의 여기 및 방출 대역폭을 사용합니다.
      2. 에스테르화 및 비에스테르화 콜레스테롤 평가
        1. 2.3.3.1.1 단계를 따르십시오.
        2. 필리핀은 에스테르화되지 않은 콜레스테롤을 인식하지만 에스테르화된 콜레스테롤은 인식하지 못하는 형광염료입니다36. 따라서, UAM 내의 총 콜레스테롤(비에스테르화 및 에스테르화)의 양을 평가하기 위해, 먼저 에스테르화된 콜레스테롤을 비에스테르화 콜레스테롤로 전환시키기 위해 콜레스테롤 에스테라아제로 샘플을 전처리한다. 세포를 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.2)( 재료 표 참조)에서 20U/mL 콜레스테롤 에스테라아제로 37°C에서 3.5시간 동안 처리한 후 PBS로 5분 3배 세척합니다.
        3. 실온에서 1시간 동안 PBS에 50μg/mL 필리핀( 재료 표 참조)으로 염색하고 PBS로 5분 3회 세척합니다. 필리핀의 광표백이 쉽게 발생하므로 샘플을 빛으로부터 멀리 덮으십시오.
          참고: 에스테르화되지 않은 콜레스테롤만 정량화해야 하는 경우 2.3.3.2.2 단계의 콜레스테롤 에스테라아제를 건너뛸 수 있습니다. 에스테르화 콜레스테롤의 양을 정량화해야 하는 경우 샘플의 총 콜레스테롤과 비에스테르화 콜레스테롤의 차이로 추론할 수 있습니다.
        4. 2.3.1.2 및 2.3.1.3 단계와 이미지에서와 같이 Transwell을 잘라내어 마운트합니다.
          참고: 필리핀을 이미징할 때 매우 빠르게 광표백됩니다. 여기의 강도와 지속 시간을 최소화해야 하며, 접안렌즈를 통해 샘플을 볼 때도 일부 광표백이 발생할 수 있습니다. 따라서 이미징 시 (1) 필리핀 채널이 아닌 형광 채널을 사용하여 이미징할 적절한 영역을 검색하고, (2) 컨포칼 현미경이 아닌 광시야에서 이미지를 촬영하고(빛 노출 강도를 제한하기 위해) (3) 영역의 반복적인 이미징을 피해야 합니다. 일반적으로 이미징 필리핀에는 다음과 같은 여기 및 방출 대역폭(예: 380nm, em 480nm)을 사용합니다.

3. RPE 식균 작용에 대한 리포푸신 유사 과립의 효과 평가: 총 소비 용량

참고: 아래의 OS 펄스 전용 프로토콜을 통해 OS 식균 작용을 측정하는 근거는 대표 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. "총 소비 용량"이라고 하는 이 방법은 전통적인 OS 펄스 추적 식균 작용 분석에서 나타날 수 있는 식균 작용 효율에 대한 모호성을 방지합니다. 분석은 4 x 106 OS /mL를 포함하는 50μL의 배지를 사용하여 24웰 Transwell 플레이트에서 수행됩니다.

  1. 실험에 필요한 웰 수를 계산한 다음 적절한 양의 일반 OS를 해동하고 실온에서 5분 동안 2400 x g 에서 스핀다운한 다음 표준 RPE 세포 배양 배지에서 4 x 106 OS/mL로 재현탁합니다. 식균 작용 속도를 촉진하기 위해 가교 리간드를 추가합니다.
    참고: 세포에 공급할 배지의 가교 리간드의 최종 농도는 단백질 S의 경우 4μg/mL, MFG-E8의 경우 1.5μg/mL입니다. 1.1.11 단계에서 설명한 바와 같이, 가교 리간드의 농도는 다른 RPE 유형 또는 세포 밀도에 대해 변경되어야 할 수 있습니다.
  2. 정점 배지를 제거하고 50 μL 4 x 106 OS/mL를 추가하며, 이상적으로는 적절한 농도의 가교 리간드를 사용합니다.
  3. OS 첨가 후 다양한 시간(예: - 0시간, 1시간, 4시간 및 24시간)에 16.67μL 4x Laemmli 샘플 버퍼를 프로테아제 억제제와 함께 추가하여 세포와 위에 놓인 OS 함유 상청액을 모두 용해합니다. P-200 피펫을 사용하여 Transwell 멤브레인에 구멍을 뚫거나 Transwell에서 멤브레인을 분리하지 않도록 주의하면서 Transwell 표면을 긁고 결합된 세포 상청액과 세포 용해물을 함께 수집합니다. 소용돌이, 회전, 그리고 완전한 변성을 위해 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.
    주의: 사용에도 불구하고 Sample Buffer를 사용하여 OS를 용해하고, 용해 용액을 가열하면 로돕신 응집이 유발될 수 있으므로 이후에 가열하지 마십시오. 또한 단백질을 침전시킬 수 있으므로 보관할 준비가 될 때까지 용해된 OS를 냉각하지 마십시오. 사용하지 않은 용해물을 -20°C에서 동결하고 사용하기 전에 용해물이 완전히 해동되었는지 확인합니다.
  4. 1.3.3단계와 동일한 설정을 사용하여 SDS PAGE에서 용해물을 실행하여 웰당 동일한 양의 용해물을 로드합니다. 식균 작용 속도는 세포 수에 따라 달라지므로 GAPDH, β-액틴 또는 다른 하우스키핑 단백질을 사용하여 세포 수를 정상화해야 합니다.
  5. 로돕신의 N- 또는 C- 말단에 대한 항체로 웨스턴 블롯을 조사합니다. 표준 웨스턴 블로팅 조건을 사용하고 항체 희석액은 재료 표에 나열되어 있습니다.
    참고: 주요 로돕신 밴드 아래에는 여러 개의 로돕신 조각이 있습니다. 이 단편은 부분적으로 소화된 로돕신을 나타내며, 이는 식소체와 리소좀이 융합되기 전에 시작되는 과정입니다32,33. 대조군 RPE와 비교하여 UAM이 함유된 RPE에서 로돕신 단편 수의 증가는 식소좀-리소좀 융합, 리소좀 산성화 및/또는 분해 효소 기능 수준에서 식균 능력의 다운스트림 결함을 나타낼 수 있습니다 16,34,35.

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Representative Results

OS의 광산화를 위한 설정은 그림 1Ai에 나와 있습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드는 슬라이드의 나머지 부분에 퍼지지 않고 열린 직사각형당 많은 양의 OS 용액을 로드할 수 있습니다. OS가 있는 슬라이드는 뚜껑이 벗겨진 멸균 페트리 접시 안에 들어 있으며 UV 램프는 그림 1Aii와 같이 슬라이드 위에 놓입니다. 대안적으로, 슬라이드는 도 1Aiii에 도시된 바와 같이 UV 가교결합제 장치에 배치될 수 있다. 광산화 후 OS 자가형광은 현미경과 유세포 분석으로 평가한 바와 같이 크게 증가합니다(그림 1B). 광산화 후 단백질 가교 정도는 쿠마시 염색을 사용하여 SDS-PAGE로 평가할 수 있으며, 이는 우성 단백질 밴드(단량체 로돕신)가 고차 응집체 및 도말로 전환되는 것으로 표시됩니다(그림 1C). 휴대용 UV 램프(그림 1Aii)와 UV 가교제 장치(그림 1Aiii)를 사용한 광산화를 비교하면 휴대용 UV 램프가 UV 가교제 장치(그림 1B)의 3J/cm2 처리와 UV 가교 장치(그림 1C)의 6J/cm2 처리만큼 많은 단백질 가교결합으로 OxOS를 생성한다는 것을 보여줍니다). 연구자가 사용할 수 있는 UV 램프가 이 프로토콜에 사용된 것과 다른 경우 노출 시간을 적정하여 그림 1C의 UV 램프 레인에서 볼 수 있는 가교 수준을 달성하는 것이 좋습니다. OxOS의 자가형광 스펙트럼은 OS의 단백질 분리 분획과 OS16의 지질 분리 분획 모두에서 처리되지 않은 OS의 스펙트럼에 비해 약간 청색 편이됩니다.

RPE 배양에서 UAM 축적의 양은 OxOS 급식의 수에 따라 달라지며(그림 2A), 약 4주 동안 20회 급식은 강력한 양의 UAM 축적을 제공합니다. 세척 후 며칠에서 몇 주가 지난 후에도 RPE 정점 표면에 달라붙어 있는 잔류 OxOS의 자가형광과 UAM 자가형광을 구별하기 위해 원적외선 염료로 검출된 로돕신 항체로 염색합니다. 이 로돕신 형광 채널을 마스크로 사용하면 UAM 채널에서 OxOS 자가형광을 빼낼 수 있으므로 UAM에서만 자가형광을 진정으로 정량화할 수 있습니다16. 위에서 설명한 염색 프로토콜을 활용하여, 이 모델에서 축적된 UAM은 천연 리포푸신과 유사한 나일 레드 염색16에 의해 평가된 바와 같이 풍부한 중성 지질을 가지고 있습니다. 그러나 에스테르화 또는 비에스테르화 콜레스테롤 축적은 거의 또는 전혀 발견되지 않으며(그림 2B), 이는 건강한 눈의 천연 리포푸신에서 볼 수 있는 콜레스테롤 축적 부족과 일치합니다(데이터는 표시되지 않음).

리포푸신의 매우 광범위한 형광 방출 스펙트럼을 고려할 때 리포푸신과 동시에 관심 있는 형광 마커를 따르는 것은 어렵습니다. 위의 방법 섹션에서는 이 문제를 극복하기 위한 몇 가지 방법을 자세히 설명합니다. 상기 단계 2.3.2.1에 요약된 방법은 원적외선에서 리포푸신에 대한 낮은 자가형광 방출 강도를 이용한다. 그림 2Ci에서 UAM과 자가포식 마커 LC3의 colocalization은 Alexa 647 염료로 LC3를 염색하여 평가합니다. UAM이 LC3 채널로 일부 블리드스루되었음에도 불구하고 이 이미지에서 리포푸신과 LC3가 어디에 있는지 분명합니다. 위의 단계 2.3.2.2에 요약된 방법에서, 리포푸신의 매우 긴 형광 방출 스펙트럼은 리포푸신으로부터의 형광만을 포함하는 방출 채널의 설계를 가능하게 한다. 그림 2Cii에서 UAM은 488nm 레이저로 여기되는 반면 방출은 500-535nm와 600-645nm 모두에서 감지됩니다. 샘플은 Alexa 488 염료로 검출된 LC3로 공동 염색됩니다. Alexa 488 채널(여기: 488nm, 방출: 500-535nm)에는 LC3 및 UAM 신호가 모두 포함됩니다. 그러나 488nm 여기 및 600-645nm 방출을 가진 두 번째 채널에는 UAM 만 포함됩니다. 이 두 번째 채널은 Alexa 488/LC3 채널에 적용되는 마스크로 사용하여 LC3 신호에서 원치 않는 UAM 신호를 뺄 수 있습니다. 위의 단계 2.3.2.4에 요약된 방법에서, 자가형광 리포푸신의 더 짧은 형광 수명은 리포푸신과 동시염색 형광을 구별할 수 있게 해준다. 그림 2Ciii에서 2ns 이전에 광자 계수 검출기에 도착하는 모든 형광 신호는 제거되며, 이는 LC3의 동시 염색 신호를 크게 보존하면서 UAM 자가형광 신호의 대부분을 차단합니다. 리포푸신과 동시염색 형광단의 강력한 동국화가 있는 경우 리포푸신과 동시염색 형광단을 구별하기 위해 여러 가지 방법을 조합해야 할 수 있습니다.

여러 연구에서 RPE 리포푸신 축적이 OS 식균 작용률 5,36,37,38,39에 미치는 영향을 가정함에 따라 UAM 함유 배양에서 OS 식균 작용 능력이 평가되었습니다. 전형적인 식균 작용 분석은 OS("펄스")가 있는 세포의 짧은 배양에 이어 결합되지 않은 OS의 세척 및 "추적" 기간 동안 OS가 없는 배지의 교체를 포함합니다. 추격하는 동안 OS가 분해됨에 따라 RPE 내에서 OS에서 가장 풍부한 단백질인 로돕신이 손실됩니다. 추적 중 다양한 시점에서 OS가 없는 배지가 제거된 후 RPE 용해물 내에 남아 있는 로돕신에 대한 세포 용해 및 SDS-PAGE가 수행됩니다. 그러나 OS 펄스 주기는 OS의 흡수와 분해로 구성되기 때문에 흡수 및 분해가 높은 RPE("식균 작용 능률" 세포)는 흡수 및 분해가 낮은 RPE("식균 작용 비효율적인" 세포)와 체이스 기간 초기에 동일한 로돕신 수준을 가질 수 있습니다. 이것은 Zhang etal 23의 연구에서 개략적으로 표현됩니다. 이러한 모호성을 극복하기 위해 여기에서 "펄스 전용" 분석이 사용되었습니다. 이 방법에서 OS는 RPE로 펄스되지만 씻겨 나가지 않습니다. OS 첨가 후 다양한 시간에 배지와 세포 용해물이 함께 수집됩니다. 배지에는 소화되지 않은 OS가 포함되어 있고 세포 용해물에는 세포 표면의 온전한 OS, 내재화된 부분적으로 소화된 OS 및 리소좀을 통해 성공적으로 만들어진 완전히 소화된 OS의 조합이 포함되어 있습니다. 대조군으로서 세포는 OS에 노출되지만 세포 용해물 및 OS 함유 상청액은 즉시 수집됩니다. 이 대조군은 얼마나 많은 총 로돕신이 세포에 도입되었는지를 보여줍니다. 용해물과 상청액이 OS 도입 후 다양한 지점에서 수집됨에 따라 현재 완전히 분해된 모든 도입/시작 OS의 양에 대한 마커로 사용하여 총 로돕신 신호의 어떤 부분이 사라졌는지 평가할 수 있습니다. 이 분석에 대한 판독값을 "총 소비 용량"이라고 하는데, 이는 모든 OS 성능 저하를 정확하게 측정하고 위에서 설명한 펄스 추적 실험의 혼란스러운 해석의 대상이 아니기 때문입니다.

도 3A 및 보충 도 1은 총 소모 용량 분석을 사용하여 잔류 로돕신의 웨스턴 블롯을 입증한다. 세포에 공급되는 OS의 양은 0시간에서 로돕신 밴드에 의해 측정됩니다. 주요 로돕신 밴드는 대조군과 UAM이 함유된 RPE 샘플(4시간 및 24시간에서 단일 화살표) 간에 동일한 효율로 분해됩니다. 그러나 부분적으로 분해된 로돕신 조각을 볼 때 그룹 간에 차이가 있으며, 이는 주요 로돕신 밴드 아래에 나타납니다. 단편 풍부도의 차이는 단백질 분해로 절단된 로돕신 단편이 정상적인 리소좀 기능으로 빠르게 분해되어야 하기 때문에 UAM 그룹에서 감소된 리소좀 용량을 의미합니다. 주요 로돕신 단편의 증가된 풍부함 없이 이러한 단편의 증가된 풍부함은 UAM이 함유된 배양에서 리소좀 분해 능력의 더 미묘한 결함을 시사합니다. 선행 연구에서는 리포푸신이 실제로 OS 식균 작용의 결함을 유발할 수 있다고 제안했지만44, 이전 연구에서는 리포푸신이 특히 로돕신 단편에 미치는 영향을 조사하지 않았으며, 이를 통해 식수좀 분해의 말기에 대한 기능 장애를 보다 정확하게 찾아낼 수 있습니다. 그림 3B는 두 개의 상이한 항-로돕신 항체를 사용하여 주요 로돕신 밴드와 로돕신 단편의 웨스턴 블로팅을 보여줍니다. 항체 4D2는 로돕신의 N-말단을 인식하고, N-말단 단편은 리소좀에서 분해되는 로돕신의 마지막 부분이다. 대조적으로, 항체 1D4는 로돕신의 C-말단을 인식하며, 이는 식소체-리소좀 융합 이전에도 분해됩니다. 따라서, 어떤 단편이 어떤 항체로 염색되는지를 이해하면 리소좀 전 대 리소좀인 로돕신 처리 결함의 감각을 제공한다 32,40,41.

Figure 1
그림 1: 광산화 외부 세그먼트(OxOS) 처리 및 특성 분석. (A) 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 슬라이드의 OS 묘사 (i) 254nm UV 핸드헬드 램프(ii) 또는 UV 가교제 장치(iii)로 처리됨. (B) 처리되지 않은(일반) OS(RegOS)와 비교하여 처리된 OS(OxOS)는 공초점 이미징(왼쪽)(스케일 막대 = 10μm) 및 유세포 분석(오른쪽)에서 알 수 있듯이 자가형광이 증가했습니다. 휴대용 UV 램프로 처리된 OxOS의 자가형광 강도는 3J/cm2(오차 막대 = S.E.M.)의 복사 노출에서 UV 가교제 장치로 처리된 OS와 유사했습니다. (C) SDS-PAGE, UV 노출에 의해 유도된 OS 단백질의 가교결합을 입증함. OxOS 휴대용 UV 램프를 통한 가교는 6J/cm2의 복사 노출에서 UV 가교제 장치로 처리된 OS와 유사했습니다. 단량체 rhodopsin은 화살표로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: hfRPE 배양에서 OxOS 유도 리포푸신 유사 과립 이미징. (A) OxOS에 의해 유도된 자가형광 과립 (녹색) 은 5회 공급에 비해 20회 공급 후 훨씬 더 많이 축적되었습니다. 로돕신 항체(자홍색)를 사용한 잔류 OxOS 염색. 스케일 바 = 10 μm. ( B ) OxOS(녹색)에 의해 유도된 UAM은 필리핀 염색(빨간색)에 의해 평가된 바와 같이 유리 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 에스테르로 농축되지 않았습니다. Scele bar = 10 μm. (C) 리포푸신의 존재 하에서 형광 동시 염색을 위한 이미징 방법. (i ) 원적외선 형광단(Alexa 647)을 사용하여 자가포식 마커 LC3(자홍색)을 염색하여 UAM 블리드스루를 최소화합니다. 순수 UAM(녹색)은 표준 녹색 채널 여기 및 방출 필터 설정으로 이미지화되었습니다. 스케일 바 = 2 μm. (ii) 비율계량 이미징을 사용하면 Alexa 488로 표지된 LC3 염색에서 UAM 자가형광을 해독하는 데 도움이 됩니다. 여기는 488 nm, 녹색 채널 방출 대역 통과는 500-535 nm, 적색 채널 방출 대역 통과는 600-645 nm입니다. 적색 채널은 녹색 채널에서 LC3 신호를 분리하기 위해 감산 마스크로 적용될 수 있습니다. 스케일 바 = 5 μm. (iii) 리포푸신/UAM의 형광 수명은 일반적으로 특정 염료보다 짧기 때문에 광자 계수 검출기에 도달하는 형광 신호를 2ns 미만으로 차단하여 UAM 자가형광을 줄일 수 있습니다. 상단 이미지는 게이팅이 없습니다. 하단 이미지는 게이팅이 있는 것으로, 수명이 2ns보다 긴 형광 신호만 유지합니다. 상단 이미지와 하단 이미지 사이의 특정 LC3 신호(Alexa 488로 표시됨)에 비해 UAM 신호가 상대적으로 더 크게 감소합니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: OS 식균 작용을 측정하기 위한 "총 소비 용량" 방법. (A) 웨스턴 블롯에 의해 분석된 바와 같이, RPE 배양에 OS를 도입한 후 세포 용해물 및 상청액 모두에 남아 있는 총 로돕신 단백질. 50μL 배지에 일반 OS를 공급한 후 컨디셔닝된 배지/상청액 및 세포를 모두 0, 4 및 24시간에 함께 용해했습니다. 0시간 시점은 각 Transwell에 공급되는 OS의 총 양을 나타내는 컨트롤 역할을 합니다. 손상되지 않은 로돕신 밴드(단일 화살표)는 대조군과 UAM이 함유된 RPE 세포 간에 차이가 없었으며, 이는 RPE 식균작용에 대한 UAM의 큰 영향이 없음을 시사합니다. 그러나 이중 화살표로 표시된 로돕신의 절단 산물은 UAM 그룹에서 더 높았으며, 이는 식수계 내 약간의 분해 기능 장애를 시사합니다. 동일한 수준의 GAPDH는 식균 작용 속도에 영향을 줄 수 있는 웰 사이의 세포 수가 동일하다는 것을 나타냅니다. (B) 상이한 로돕신 항체는 상이한 분해 단편을 인식한다. 4D2는 로돕신의 N-말단을 인식하며, 이는 리소좀 분해의 마지막 단계까지 손상되지 않습니다. 따라서 인식하는 조각은 작습니다(이중 화살표). 대조적으로, 1D4는 로돕신의 C-말단을 인식하는데, 이는 포골리소좀 과정에서 더 일찍 분해됩니다. 따라서 이 항체는 더 높은 분자량의 로돕신 단편을 인식합니다(이중 화살표). 두 항체 모두 온전한 로돕신(단일 화살표)을 인식합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 그림 3A에 해당하는 편집되지 않은 얼룩. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

RPE 리포푸신은 수십 년 동안 연구되어 왔지만 그 독성은 2,9,16,42에 대해 논의되고 있습니다. 동물 모델11에서 리포푸신의 독성에 대한 모호성을 감안할 때, 인간 RPE를 사용하는 시험관 내 모델은 가치가 있다. 다양한 시험관 내 리포푸신 축적 모델이 설명되었지만 OS 공급과 고도로 성숙하고 차별화된 인간 RPE 배양을 모두 활용한 모델은 없습니다. 이 조합은 OS 공급이 생체 내에서 리포푸신 축적 방법을 요약하고 고도로 성숙한 인간 RPE 배양이 생체 내에서 RPE 거동을 가장 잘 복제하기 때문에 이상적인 모델을 나타냅니다. 흥미롭게도, 고도로 분화된 hfRPE 배양을 이용할 때, 반복적인 섭식 후에도 일상적인 OS 노출은 리포푸신 유사 물질을 유도하기에 불충분하다는 것이 발견되었다16. 따라서, 이 프로토콜은 제어된 방식으로 광산화 OS(OxOS)에 의한 리포푸신 축적 과정을 가속화한다. OxOS를 인간 iPSC-RPE 및 hfRPE 배양 모두에 공급하면 소화되지 않는 자가형광 물질(UAM)이라고 하는 리포푸신 유사 과립이 강력하게 축적되었습니다. UAM 축적은 생체 내에서 건강한 인간 RPE를 모방하는 배양 시스템에서 리포푸신의 모델링을 허용합니다 22,23,29,43,44. 이전 간행물과 이 연구 모두에서 건강한 노인의 천연 리포푸신과 비교한 UAM의 광범위한 특성화는 유사점과 차이점을 모두 보여줍니다. UAM은 리포푸신 과립이 멜라닌 과립과 융합하여 멜라노리포푸신16을 형성하는 경향을 포함하여 생체 내에서 리포푸신의 미세 구조를 모방합니다. UAM과 리포푸신 모두 상당한 중성 지질을 함유하고 있으며, 로돕신이 없으며, 콜레스테롤이 크게 풍부하지 않습니다(이전 간행물16의 그림 2A, B, 위의 그림 2A, B 및 미공개 데이터). 우리는 또한 천연 리포푸신 과립 크기 및 스펙트럼을 UAM의 크기 및 스펙트럼과 비교했습니다(이전 간행물16의 그림 3). UAM 과립은 처음에는 천연 리포푸신에 비해 약간 더 크고 청색으로 이동하지만, 배양에서 상당한 기간 동안 UAM은 방출 스펙트럼에서 더 작은 크기와 적색 편이로 압축되어 천연 리포푸신의 크기 및 스펙트럼 프로파일과 훨씬 더 유사해집니다.

OxOS UAM 모델은 리포푸신 과립50의 예방 및 제거에 대한 자가포식 유도제의 효과와 RPE 극성 및 대사에 대한 리포푸신의 효과를 포함하여 다양한 응용 분야에 활용되어 왔습니다16. 또한, 이러한 과립은 배양된 RPE에서 1년 이상 지속되는 것으로 나타났으며, 이를 통해 장기간에 걸친 리포푸신 스펙트럼, 형태 및 행동의 진화를 연구할 수 있다16. 이 모델의 다른 응용 프로그램으로는 보체 활성화에 대한 리포푸신 축적 연구51, 리소좀 안정성 및 염증 반응 52, 미토콘드리아 손상53이 있습니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, RPE 문화는 고도로 차별화되고 성숙해야 합니다. OxOS 급식은 RPE가 최소 8주 동안 Transwells에 있었고 고도로 성숙한 RPE의 특징적인 모든 특성을 얻은 후에만 시작해야 합니다(Finnemann et al.에 의해 정교화된 5'P - 형태학, 유사분열 후, 색소, 편광 및 식세포의 다각형54). 둘째, OS는 매우 취약하므로 피펫팅 중에 주의해서 다루어야 합니다. 과도한 피펫팅 또는 동결-해동은 OS를 분해합니다. 마지막으로, 총 UV 플럭스 노출에 대한 OS의 비율은 손상되지 않은 상태로 유지되지만 여전히 UAM을 유도할 수 있는 OxOS를 생성하는 데 중요합니다. 이 비율은 이 프로토콜에서 개선되었습니다. 주어진 수의 OS에 대해 너무 많은 UV 광선은 과도한 가교를 일으키고 OS의 중요한 화학 구조를 파괴합니다. 주어진 수의 OS에 대해 너무 적은 UV 광선은 배양에서 UAM을 유도하지 못합니다.

프로토콜의 수정에는 주로 OxOS 섭식 기간 또는 농도. 경험적으로, 약 4 주 동안 20 회 공급하면 강력한 양의 UAM 축적이 생성됩니다. 이 이상의 공급은 UAM 축적에 점진적으로 추가될 수 있는 반면, 더 적은 수의 공급은 산발적인 UAM 축적만 유발할 수 있습니다. 급식의 수는 실험자와 실험자의 목적, 필요 및 자원에 따라 조정할 수 있습니다. 덜 분화된 RPE 배양(더 높은 계대 수, 세포주 또는 상피-중간엽 전이 특성을 나타내는 배양)에서는 강력한 UAM 유도를 위해 더 적은 수의 공급과 더 낮은 OxOS 농도가 필요합니다.

프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. OS의 광 산화를 위해 휴대용 UV 램프를 사용하면 OS에 전달되는 총 복사 노출을 정확하게 정량화할 수 없습니다. 그러나, 휴대용 램프를 사용한 OS의 광산화는 이 연구에서 복사 노출에 대한 파라미터를 제공하는 데 도움이 되도록 그림 1 에서 훨씬 더 비싼(그러나 정량적인) UV 가교제 장치와 상관관계가 있었습니다. 실험자는 가교/로돕신 번짐 패턴이 그림 1C의 웨스턴 블롯의 UV 램프 컬럼에서 볼 수 있는 것과 유사할 때까지 UV 노출 기간을 변경하는 것이 좋습니다.

이 방법의 두 번째 한계는 생체 내에서 리포푸신 축적의 많은 특징이 부족할 가능성이 있다는 것입니다. 실제로, 이 프로토콜 전반에 걸쳐 리포푸신 유사 과립은 이러한 구별을 명확하게 하기 위해 소화되지 않는 자가불화 물질(UAM)이라고 합니다. 광산화 OS는 질병 상태의 광수용체 외부 세그먼트에서 발생하는 일부 천연 화학적 가교를 요약하지만 가교는 크게 가속화되고 UAM 모델에서 더 비특이적일 수 있습니다. 또한, 거의 한 달 동안 OxOS를 먹였음에도 불구하고 UAM 모델은 리포푸신이 인간에게 축적되는 데 수십 년이 걸리는 것과 비교하여 여전히 리포푸신 유도 OS에 대한 "급성" 노출을 나타냅니다. 배양에서 리포푸신 축적이 더 길어지면 표현형 효과가 줄어들 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 배양 시스템에서 UAM 과립이 1년 이상 지속되기 때문에, RPE 건강에 대한 장기적인 영향을 연구할 기회가 있다16.

RPE 식균 작용 능력을 평가하기 위해 여기에 제시된 "총 소비 용량" 방법의 한계는 식균 작용 결함이 OS 결합 대 흡수 대 분해로 인한 것인지 여부를 구별하지 못한다는 것입니다. 실제로, 식균 작용 분석의 목표가 식균 작용 과정의 특정 단계의 기능 장애에 대한 기계론적 통찰력인 경우 전통적인 OS 펄스 추적 분석이 더 적합합니다. "총 소비 용량"의 측정은 단순히 통제 대 실험 조건에서 RPE 배양의 OS 식균 작용 능력을 명확하게 측정하는 것이 목표일 때 사용해야 합니다.

결론적으로, 고도로 분화된 인간 RPE 배양에서 리포푸신 유사 과립 축적에 대한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 리포푸신 축적에 대한 생리학적 과정(광산화 OS의 반복 공급)을 반복 연구에서 생체 내에서 인간 RPE를 강력하게 요약하는 것으로 나타난 RPE 배양 모델과 병합합니다 . 리포푸신 유사 과립이 함유된 배양물은 RPE 생물학에 대한 리포푸신 효과 평가부터 리포푸신 축적 조절에 중요한 소분자, 유전자 및 신호 경로 테스트에 이르기까지 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 유리체-망막 수술 재단(VRSF), 시력을 위한 싸움(FFS) 및 국제 망막 연구 재단(IRRF)의 보조금으로 부분적으로 지원됩니다. J.M.L.M.은 현재 국립 안과 연구소(National Eye Institute, EY033420)의 K08 보조금으로 지원되고 있습니다. HFT 연구에는 연방 기금이 사용되지 않았습니다. 제임스 그로스펠드 이니셔티브(James Grosfeld Initiative for Dry AMD)와 바바라 던(Barbara Dunn), 디 앤 딕슨 브라운(Dee & Dickson Brown)의 개인 기부자들의 지원이 더욱 지원된다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

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References

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생물학 제 194 호 리포 푸신 망막 색소 상피 (RPE) 광 수용체 외부 세그먼트 팁 또는 단편 (OS) 식균 작용 스타 가르트 병 연령 관련 황반 변성 (AMD) 소화되지 않는자가 형광 물질 (UAM)
Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures
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Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. … More

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

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