Modelos aprimorados de lipofuscina e quantificação da capacidade de fagocitose do segmento externo em culturas epiteliais pigmentares da retina humana altamente polarizadas

Summary

Este protocolo descreve um modelo de acúmulo de lipofuscina em culturas altamente diferenciadas e polarizadas do epitélio pigmentado da retina humana (EPR) e um ensaio melhorado de fagocitose do segmento externo (EO) para detectar o consumo/capacidade de degradação total do EPR. Esses métodos superam as limitações de modelos anteriores de lipofuscina e ensaios clássicos de fagocitose do segmento externo de perseguição de pulso.

Abstract

A fagocitose diária dos segmentos externos dos fotorreceptores pelo epitélio pigmentar da retina (EPR) contribui para o acúmulo de um pigmento envelhecido intracelular denominado lipofuscina. A toxicidade da lipofuscina está bem estabelecida na doença de Stargardt, a degeneração hereditária da retina mais comum, mas é mais controversa na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), a principal causa de cegueira irreversível no mundo desenvolvido. Determinar a toxicidade da lipofuscina em humanos tem sido difícil, e modelos animais de Stargardt têm toxicidade limitada. Assim, modelos in vitro que mimetizem o EPR humano in vivo são necessários para melhor compreender a geração, depuração e toxicidade da lipofuscina. A maioria dos modelos de lipofuscina em cultura celular até o momento foi em linhagens celulares ou envolveu a alimentação de EPR com um único componente da complexa mistura de lipofuscina em vez de fragmentos/pontas de todo o segmento externo do fotorreceptor, o que gera um modelo de lipofuscina mais completo e fisiológico. Descrito aqui é um método para induzir o acúmulo de material semelhante à lipofuscina (denominado material de autofluorescência não digestível, ou UAM) em EPR pré-natal humano primário altamente diferenciado (hfRPE) e PSE derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). As MAU acumularam-se nas culturas por repetidas alimentações de fragmentos de OS tratados com luz ultravioleta absorvidos pelo EPR via fagocitose. As principais maneiras pelas quais o UAM se aproxima e difere da lipofuscina in vivo também são discutidas. Acompanhando esse modelo de acúmulo semelhante à lipofuscina, métodos de imagem para distinguir o amplo espectro de autofluorescência dos grânulos de UAM da coloração concomitante de anticorpos são introduzidos. Finalmente, para avaliar o impacto da MAU na capacidade de fagocitose do EPR, um novo método para quantificar a captação e a degradação de fragmentos/pontas do segmento externo foi introduzido. Denominado “Capacidade de Consumo Total”, esse método supera potenciais erros de interpretação da capacidade de fagocitose do EPR inerente aos ensaios clássicos de “perseguição de pulso” do segmento externo. Os modelos e técnicas aqui introduzidos podem ser usados para estudar as vias de geração e depuração da lipofuscina e a toxicidade putativa.

Introduction

O epitélio pigmentado da retina (EPR) fornece suporte crítico para fotorreceptores sobrejacentes, incluindo a captação e degradação diárias de pontas ou fragmentos do segmento externo do fotorreceptor (ao longo deste protocolo, a abreviatura OS significa pontas ou fragmentos de SO em vez de segmentos externos inteiros). Essa captação diária no EPR pós-mitótico acaba sobrecarregando a capacidade fagolisossomal e levando ao acúmulo de material intracelular autofluorescente e indigesto, denominado lipofuscina. Curiosamente, vários estudos também demonstraram que a lipofuscina por EPR pode se acumular sem fagocitose do EO ^1,2. A lipofuscina possui vários componentes, incluindo adutos reticulados derivados de retinóides do ciclo visual, e pode ocupar cerca de 20% do volume celular do EPR para pessoas com mais de 80 anos³.

Se a lipofuscina é tóxica tem sido muito debatido. A doença de Stargardt é uma degeneração autossômica recessiva dos fotorreceptores e EPR na qual uma mutação no ABCA4 desencadeia o processamento inadequado dos retinóides do ciclo visual contidos nos segmentos externos dos fotorreceptores. O processamento inadequado dos retinóides leva à reticulação aberrante e à formação de espécies bis-retinoides, incluindo o N-retinilideno-N-retiniretanolamina (A2E) bis-retinireóide. Estudos têm demonstrado múltiplos mecanismos para a toxicidade do A2E ^4,5. A lipofuscina contribui para os sinais de autofluorescência do fundo de olho durante exames de imagem clínicos, e tanto os pacientes de Stargardt quanto os modelos animais apresentam aumento da autofluorescência do fundo de olho antes da degeneração retiniana, sugerindo uma correlação entre os níveis de lipofuscina e toxicidade ^6,7. No entanto, com a idade, a lipofuscina se acumula em todos os seres humanos sem desencadear uma degeneração do EPR. Além disso, na degeneração macular relacionada à idade (DMRI), em que a degeneração do EPR ocorre apenas em pacientes idosos, aqueles com formas precoce e intermediária da doença têm menos sinais de autofluorescência do fundo do que humanos não doentes pareados por idade⁸. Esses achados clínicos também foram verificados em nível^{histológico9,10}.

Modelos animais de acúmulo de lipofuscina por EPR também deixaram alguma ambiguidade sobre a toxicidade da lipofuscina. O camundongo knockout ABCA4 não apresenta degeneração retiniana em fundo pigmentado, enquanto o faz em fundo albino ou quando exposto à luz azul^11,12. Além disso, a toxicidade da lipofuscina derivada via nocaute ABCA4 provavelmente difere da lipofuscina de acúmulo mais lento que ocorre com o envelhecimento natural, como visto na DMRI¹³.

Modelos in vitro de acúmulo de lipofuscina fornecem uma alternativa para estudar os efeitos do acúmulo de lipofuscina na saúde do EPR. Tais modelos permitem a manipulação de componentes da lipofuscina, desde a alimentação de componentes retinóides únicos até a alimentação de EO, e permitem o estudo em PSE humano e não animal. Nas últimas duas décadas, vários métodos foram desenvolvidos para modelar a lipofuscina de EPR em cultura. Juntamente com outros grupos, o grupo do Dr. Boulton alimentou diariamente a OS bovina por até três meses na passagem de 4 a 7 células humanas primárias de EPR de doadores com idades entre 4 e 85 anos¹⁴. Alternativamente, a inibição da autofagia também levou ao acúmulo de lipofuscina nas passagens 3 a 7 culturas primárias de EPR humano¹⁵. No entanto, a inibição lisossômica subletal em culturas de EPR pré-natal humano (RPEh) altamente diferenciadas, passagem 1, falhou em induzir lipofuscina, mesmo com a adição repetida de EO diariamente¹⁶.

Como uma abordagem mais reducionista, outros têm fornecido componentes únicos de lipofuscina para culturas, especialmente o bis-retinóide A2E ^4,17. Tais estudos são valiosos na medida em que definem potenciais mecanismos diretos de toxicidade para componentes individuais da lipofuscina, implicando, por exemplo, colesterol lisossomal e homeostase da ceramida¹⁸. Ao mesmo tempo, discute-se a toxicidade da A2E¹⁹, e alimentá-la diretamente às células contorna a via típica de acúmulo de lipofuscina, que envolve a fagocitose do fotorreceptor OS. Na tentativa de entregar todos os componentes da lipofuscina às culturas de EPR, Boulton e Marshall purificaram a lipofuscina de olhos humanos e alimentaram esta para a passagem de 4 a 7 culturas humanas primárias de EPR derivadas de doadores humanos fetais e idosos²⁰. Embora inovador, este método representa uma fonte limitada de lipofuscina para experimentos repetidos.

Embora a alimentação repetida de EO para culturas de EPR produza lipofuscina em muitos sistemas, ela falha em culturas de EPR primário altamente diferenciadas¹⁶. O EO fotooxidante induz reações de reticulação como a formação de bis-retinóides que ocorre naturalmente durante a formação de lipofuscina in vivo. Isso pode acelerar a formação de grânulos semelhantes à lipofuscina em sistemas de cultura de EPR, mesmo aqueles que são altamente diferenciados e resistentes ao acúmulo de lipofuscina¹⁶. Aqui é introduzido um método para induzir o acúmulo de grânulos lipofuscin-like em hfRPE altamente diferenciado e iPSC-RPE humano, modificado a partir do protocolo publicado por^Wihlmark21. Este método tem a vantagem de induzir grânulos lipofuscin-símile empregando a mesma fonte (fotorreceptor OS) e via (captação de OS fagolisossomal) que ocorre para lipofuscinogênese in vivo. Além disso, é feito em culturas de EPR humano que são altamente diferenciadas e validadas em múltiplos estudos para replicar EPR humano in vivo^22,23,24. Esses grânulos semelhantes à lipofuscina são denominados material autofluorescente não digerível (MAU) e fornecem dados e discussão neste protocolo comparando a MAU com a lipofuscina in vivo. Juntamente com métodos para construir e avaliar culturas carregadas de VAM em EPR humano altamente diferenciado, um método atualizado para avaliar a fagocitose do EO do EPR também é introduzido. Vários métodos excelentes de perseguição de pulso para quantificar a fagocitose do EO foram introduzidos, incluindo Western blotting, imunocitoquímica e FACS^25,26,27. No entanto, no início da perseguição de pulso do sistema operacional, as condições que levam à baixa absorção do sistema operacional podem ser confundidas com condições que promovem a rápida degradação do sistema operacional internalizado. O método aqui apresentado mede a quantidade total de SO introduzida que é totalmente consumida/degradada pela EPR (“Capacidade Consumptiva Total”), ajudando a eliminar essa ambiguidade. Espera-se que conhecimentos sobre a toxicidade da lipofuscina utilizando estes protocolos, incluindo efeitos sobre as taxas de fagocitose do EO utilizando o método da “Capacidade de Consumo Total”, sejam usados para esclarecer a toxicidade da lipofuscina in vivo.

Protocol

O presente protocolo envolvendo a aquisição e uso de tecido humano foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Michigan (HUM00105486). 1. Preparação de pontas e fragmentos foto-oxidados do segmento externo NOTA: As retinas bovinas adaptadas ao escuro foram compradas e enviadas no gelo (ver Tabela de Materiais). A partir dessas retinas, os EO foram purificados seguindo protocolo previamentepublica…

Representative Results

A configuração para foto-oxidação do EO é demonstrada na Figura 1Ai. As lâminas revestidas de politetrafluoretileno permitem que um grande volume de OS em solução seja carregado por retângulo aberto sem se espalhar pelo resto da lâmina. A lâmina com OS está contida dentro de uma placa de Petri estéril com a tampa desligada, e uma lâmpada UV é colocada sobre a lâmina, como mostrado na Figura 1Aii. Alternativamente, a lâmina pode ser colocada em u…

Discussion

Embora a lipofuscina por EPR seja estudada há décadas, sua toxicidade é debatida 2,9,16,42. Dada a ambiguidade sobre a toxicidade da lipofuscina em modelos^animais11, modelos in vitro utilizando EPR humano são valiosos. Uma variedade de modelos de acúmulo de lipofuscina in vitro tem sido descrita, mas nenhum utilizou tanto a alimentação OS quanto …

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000