JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Forbedrede lipofuscinmodeller og kvantificering af ydre segment fagocytosekapacitet i stærkt polariserede humane retinale pigmentepitelkulturer

Published: April 14, 2023
doi:
10.3791/65242
, ,
1Kellogg Eye Center,University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program,University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Denne protokol beskriver en lipofuscinakkumuleringsmodel i stærkt differentierede og polariserede humane retinale pigmentepitelkulturer (RPE) og et forbedret ydre segment (OS) fagocytoseanalyse til påvisning af RPE’s samlede OS-forbrug / nedbrydningskapacitet. Disse metoder overvinder begrænsningerne i tidligere lipofuscinmodeller og klassiske pulsjagtende ydre segment fagocytose-assays.

Abstract

Den daglige fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter af retinal pigmentepitel (RPE) bidrager til akkumulering af et intracellulært aldringspigment kaldet lipofuscin. Toksiciteten af lipofuscin er veletableret i Stargardts sygdom, den mest almindelige arvelige retinal degeneration, men er mere kontroversiel i aldersrelateret makuladegeneration (AMD), den førende årsag til irreversibel blindhed i den udviklede verden. Det har været vanskeligt at bestemme lipofuscintoksicitet hos mennesker, og dyremodeller af Stargardts har begrænset toksicitet. Således er in vitro-modeller , der efterligner human RPE in vivo , nødvendige for bedre at forstå lipofuscingenerering, clearance og toksicitet. Størstedelen af cellekulturlipofuscinmodeller til dato har været i cellelinjer eller har involveret fodring af RPE en enkelt komponent i den komplekse lipofuscinblanding snarere end fragmenter / spidser af hele fotoreceptorens ydre segment, hvilket genererer en mere komplet og fysiologisk lipofuscinmodel. Her beskrives en metode til at inducere akkumulering af lipofuscinlignende materiale (kaldet ufordøjeligt autofluorescensmateriale eller UAM) i stærkt differentieret primær human prænatal RPE (hfRPE) og induceret pluripotent stamcelle (iPSC) afledt RPE. UAM akkumuleret i kulturer ved gentagen fodring af ultraviolette lysbehandlede OS-fragmenter optaget af RPE via fagocytose. De vigtigste måder, hvorpå UAM tilnærmer sig og adskiller sig fra lipofuscin in vivo , diskuteres også. Ledsaget af denne model af lipofuscinlignende akkumulering introduceres billeddannelsesmetoder til at skelne det brede autofluorescensspektrum af UAM-granulat fra samtidig antistoffarvning. Endelig er der indført en ny metode til kvantificering af optagelse og nedbrydning af ydre segmentfragment/spidser for at vurdere virkningen af UAM på RPE-fagocytosekapaciteten. Betegnes “Total Consumtive Capacity”, denne metode overvinder potentielle fejlfortolkninger af RPE fagocytose kapacitet iboende i klassiske ydre segment “puls-chase” assays. De modeller og teknikker, der introduceres her, kan bruges til at studere lipofuscingenerering og clearance veje og formodet toksicitet.

Introduction

Det retinale pigmentepitel (RPE) giver kritisk støtte til overliggende fotoreceptorer, herunder den daglige optagelse og nedbrydning af fotoreceptorens ydre segmentspidser eller fragmenter (i hele denne protokol står forkortelsen OS for OS-spidser eller fragmenter snarere end hele ydre segmenter). Denne daglige optagelse i post-mitotisk RPE overbelaster til sidst fagososomal kapacitet og fører til opbygning af ufordøjeligt, autofluorescerende intracellulært materiale, kaldet lipofuscin. Interessant nok har flere undersøgelser også vist, at RPE lipofuscin kan akkumulere uden OS fagocytose 1,2. Lipofuscin har mange komponenter, herunder tværbundne addukter afledt af visuelle cyklusretinoider, og kan optage næsten 20% af RPE-cellevolumen for dem over 80år 3.

Hvorvidt lipofuscin er giftigt har været varmt debatteret. Stargardts sygdom er en autosomal recessiv degeneration af fotoreceptorerne og RPE, hvor en mutation i ABCA4 udløser forkert behandling af visuelle cyklusretinoider indeholdt i fotoreceptorens ydre segmenter. Forkert retinoidbehandling fører til afvigende tværbinding og dannelse af bis-retinoidarter, herunder bis-retinoid N-retinyliden-N-retinylethanolamin (A2E). Undersøgelser har påvist flere mekanismer for A2E-toksicitet 4,5. Lipofuscin bidrager til fundus autofluorescenssignaler under klinisk billeddannelse, og både Stargardts patienter og dyremodeller viser øget fundus autofluorescens før retinal degeneration, hvilket tyder på en sammenhæng mellem lipofuscinniveauer og toksicitet 6,7. Men med alderen akkumuleres lipofuscin hos alle mennesker uden at udløse en RPE-degeneration. I aldersrelateret makuladegeneration (AMD), hvor RPE-degeneration kun forekommer hos ældre patienter, har de med tidlige og mellemliggende former for sygdommen mindre fundus autofluorescenssignaler end aldersmatchede ikke-syge mennesker8. Disse kliniske fund er også blevet verificeret på histologisk niveau 9,10.

Dyremodeller af RPE lipofuscin akkumulering har også efterladt en vis tvetydighed om lipofuscin toksicitet. ABCA4 knockout-musen viser ikke retinal degeneration på en pigmenteret baggrund, mens den gør på en albinobaggrund eller når den udsættes for blåt lys11,12. Endvidere adskiller toksiciteten af lipofuscin afledt via ABCA4 knockout sig sandsynligvis fra den langsommere akkumulerende lipofuscin, der forekommer med naturlig aldring, som det ses i AMD13.

In vitro modeller af lipofuscin akkumulering giver et alternativ til at studere virkningerne af lipofuscin akkumulering på RPE sundhed. Sådanne modeller giver mulighed for at manipulere lipofuscinkomponenter, fra fodring af enkelte retinoidkomponenter til fodring af OS, og tillader undersøgelse i human snarere end animalsk RPE. I de sidste par årtier er der udviklet flere metoder til at modellere RPE-lipofuscin i kultur. Sammen med andre grupper fodrede Dr. Boultons gruppe bovin OS dagligt i op til tre måneder ved passage 4 til 7 humane primære RPE-celler fra donorer i alderen 4 til 85 år14 år. Alternativt har hæmning af autofagi også ført til lipofuscinakkumulering i passager 3 til 7 primære humane RPE-kulturer15. Imidlertid kunne subletal lysosomal hæmning i stærkt differentierede, passage 1, primære humane prænatale RPE (hfRPE) kulturer ikke inducere lipofuscin, selv med gentagen tilsætning af OS dagligt16.

Som en mere reduktionistisk tilgang har andre fodret enkelte lipofuscinkomponenter til kulturer, især bis-retinoid A2E 4,17. Sådanne undersøgelser er værdifulde, idet de definerer potentielle direkte toksicitetsmekanismer for individuelle lipofuscinkomponenter, hvilket for eksempel implicerer lysosomalt kolesterol og ceramidhomeostase18. Samtidig er der debat om toksiciteten af A2E19, og fodring direkte til celler omgår den typiske vej for lipofuscinakkumulering, hvilket involverer fagocytose af fotoreceptor OS. I et forsøg på at levere alle komponenter af lipofuscin til RPE-kulturer rensede Boulton og Marshall lipofuscin fra menneskelige øjne og fodrede dette til passage 4 til 7 humane primære RPE-kulturer afledt af både føtale og ældre menneskelige donorer20. Selvom den er innovativ, repræsenterer denne metode en begrænset lipofuscinkilde til gentagne eksperimenter.

Mens gentagen fodring af OS til RPE-kulturer producerer lipofuscin i mange systemer, undlader det at gøre det i stærkt differentierede primære RPE-kulturer16. Fotooxiderende OS inducerer tværbindingsreaktioner som bis-retinoiddannelse, der naturligt forekommer under lipofuscindannelse in vivo. Dette kan fremskynde lipofuscinlignende granulatdannelse i RPE-kultursystemer, selv dem, der er stærkt differentierede og resistente over for lipofuscinakkumulering16. Her introduceres en metode til at inducere lipofuscinlignende granulakkumulering i stærkt differentieret hfRPE og human iPSC-RPE, modificeret fra Wihlmarks offentliggjorte protokol21. Denne metode har den fordel, at den inducerer lipofuscinlignende granulater ved hjælp af den samme kilde (fotoreceptor OS) og vej (phagolysosomal OS-optagelse) som forekommer for lipofuscinogenese in vivo. Endvidere gøres det på humane RPE-kulturer, der er stærkt differentierede og valideret i flere undersøgelser for at replikere human RPE in vivo22,23,24. Disse lipofuscinlignende granulater kaldes ufordøjeligt autofluorescerende materiale (UAM) og giver data og diskussion i denne protokol, der sammenligner UAM med in vivo lipofuscin. Sammen med metoder til opbygning og evaluering af UAM-belastede kulturer i stærkt differentieret human RPE introduceres også en opdateret metode til vurdering af RPE OS-fagocytose. Flere fremragende pulsjagtmetoder til kvantificering af OS-fagocytose er blevet introduceret, herunder Western blotting, immuncytokemi og FACS25,26,27. Men tidligt i OS-pulsjagten kan forhold, der fører til dårlig OS-optagelse, sammenblandes med forhold, der fremmer hurtig nedbrydning af internaliseret OS. Metoden, der præsenteres her, måler den samlede mængde introduceret operativsystem, der er fuldt forbrugt/nedbrudt af RPE (“Total Consumtive Capacity”), hvilket hjælper med at eliminere denne tvetydighed. Det forventes, at indsigt i lipofuscintoksicitet ved hjælp af disse protokoller, herunder effekter på OS-fagocytosehastigheder ved hjælp af metoden “Total Consumtive Capacity”, vil blive brugt til at kaste lys over toksiciteten af lipofuscin in vivo.

Protocol

Denne protokol, der involverer erhvervelse og anvendelse af humant væv, blev gennemgået og godkendt af University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486). 1. Fremstilling af fotooxiderede ydre segmentspidser og fragmenter BEMÆRK: Mørktilpassede kvægnethinden blev købt og sendt på is (se materialetabel). Fra disse nethinden blev OS renset efter en tidligere offentliggjort protokol23. Udvendigt seg…

Representative Results

Opsætningen til fotooxidation af OS er vist i figur 1Ai. De polytetrafluorethylenbelagte dias gør det muligt at indlæse en stor mængde OS i opløsning pr. åbent rektangel uden at sprede sig over resten af diaset. Objektglasset med OS er indeholdt i en steril petriskål med låget slukket, og en UV-lampe er placeret over diaset som vist i figur 1Aii. Alternativt kan objektglasset placeres i en UV-tværbindingsanordning, som vist i figur …

Discussion

Mens RPE lipofuscin er blevet undersøgt i årtier, dets toksicitet diskuteres 2,9,16,42. På grund af tvetydighed om lipofuscins toksicitet fra dyremodel11 er in vitro-modeller, der anvender human RPE, værdifulde. En række in vitro lipofuscinakkumuleringsmodeller er blevet beskrevet, men ingen har udnyttet både OS-fodring og meget modne og different…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde støttes delvist af bevillinger fra Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) og International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. støttes i øjeblikket af en K08-bevilling fra National Eye Institute (EY033420). Ingen føderale midler blev brugt til HFT-forskning. Yderligere støtte kommer fra James Grosfeld Initiative for Dry AMD og følgende private donorer: Barbara Dunn og Dee & Dickson Brown.

Materials

100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease–correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch’s membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -. L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. , 51-60 (2014).

Tags

Keywords: LipofuscinRetinal Pigment EpitheliumRPEPhagocytosisOuter SegmentsIn Vitro ModelStargardt’s DiseaseAge-related Macular DegenerationAMDToxicity
check_url/65242?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image