Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Forbedrede lipofuscinmodeller og kvantificering af ydre segment fagocytosekapacitet i stærkt polariserede humane retinale pigmentepitelkulturer

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Denne protokol beskriver en lipofuscinakkumuleringsmodel i stærkt differentierede og polariserede humane retinale pigmentepitelkulturer (RPE) og et forbedret ydre segment (OS) fagocytoseanalyse til påvisning af RPE's samlede OS-forbrug / nedbrydningskapacitet. Disse metoder overvinder begrænsningerne i tidligere lipofuscinmodeller og klassiske pulsjagtende ydre segment fagocytose-assays.

Abstract

Den daglige fagocytose af fotoreceptor ydre segmenter af retinal pigmentepitel (RPE) bidrager til akkumulering af et intracellulært aldringspigment kaldet lipofuscin. Toksiciteten af lipofuscin er veletableret i Stargardts sygdom, den mest almindelige arvelige retinal degeneration, men er mere kontroversiel i aldersrelateret makuladegeneration (AMD), den førende årsag til irreversibel blindhed i den udviklede verden. Det har været vanskeligt at bestemme lipofuscintoksicitet hos mennesker, og dyremodeller af Stargardts har begrænset toksicitet. Således er in vitro-modeller , der efterligner human RPE in vivo , nødvendige for bedre at forstå lipofuscingenerering, clearance og toksicitet. Størstedelen af cellekulturlipofuscinmodeller til dato har været i cellelinjer eller har involveret fodring af RPE en enkelt komponent i den komplekse lipofuscinblanding snarere end fragmenter / spidser af hele fotoreceptorens ydre segment, hvilket genererer en mere komplet og fysiologisk lipofuscinmodel. Her beskrives en metode til at inducere akkumulering af lipofuscinlignende materiale (kaldet ufordøjeligt autofluorescensmateriale eller UAM) i stærkt differentieret primær human prænatal RPE (hfRPE) og induceret pluripotent stamcelle (iPSC) afledt RPE. UAM akkumuleret i kulturer ved gentagen fodring af ultraviolette lysbehandlede OS-fragmenter optaget af RPE via fagocytose. De vigtigste måder, hvorpå UAM tilnærmer sig og adskiller sig fra lipofuscin in vivo , diskuteres også. Ledsaget af denne model af lipofuscinlignende akkumulering introduceres billeddannelsesmetoder til at skelne det brede autofluorescensspektrum af UAM-granulat fra samtidig antistoffarvning. Endelig er der indført en ny metode til kvantificering af optagelse og nedbrydning af ydre segmentfragment/spidser for at vurdere virkningen af UAM på RPE-fagocytosekapaciteten. Betegnes "Total Consumtive Capacity", denne metode overvinder potentielle fejlfortolkninger af RPE fagocytose kapacitet iboende i klassiske ydre segment "puls-chase" assays. De modeller og teknikker, der introduceres her, kan bruges til at studere lipofuscingenerering og clearance veje og formodet toksicitet.

Introduction

Det retinale pigmentepitel (RPE) giver kritisk støtte til overliggende fotoreceptorer, herunder den daglige optagelse og nedbrydning af fotoreceptorens ydre segmentspidser eller fragmenter (i hele denne protokol står forkortelsen OS for OS-spidser eller fragmenter snarere end hele ydre segmenter). Denne daglige optagelse i post-mitotisk RPE overbelaster til sidst fagososomal kapacitet og fører til opbygning af ufordøjeligt, autofluorescerende intracellulært materiale, kaldet lipofuscin. Interessant nok har flere undersøgelser også vist, at RPE lipofuscin kan akkumulere uden OS fagocytose 1,2. Lipofuscin har mange komponenter, herunder tværbundne addukter afledt af visuelle cyklusretinoider, og kan optage næsten 20% af RPE-cellevolumen for dem over 80år 3.

Hvorvidt lipofuscin er giftigt har været varmt debatteret. Stargardts sygdom er en autosomal recessiv degeneration af fotoreceptorerne og RPE, hvor en mutation i ABCA4 udløser forkert behandling af visuelle cyklusretinoider indeholdt i fotoreceptorens ydre segmenter. Forkert retinoidbehandling fører til afvigende tværbinding og dannelse af bis-retinoidarter, herunder bis-retinoid N-retinyliden-N-retinylethanolamin (A2E). Undersøgelser har påvist flere mekanismer for A2E-toksicitet 4,5. Lipofuscin bidrager til fundus autofluorescenssignaler under klinisk billeddannelse, og både Stargardts patienter og dyremodeller viser øget fundus autofluorescens før retinal degeneration, hvilket tyder på en sammenhæng mellem lipofuscinniveauer og toksicitet 6,7. Men med alderen akkumuleres lipofuscin hos alle mennesker uden at udløse en RPE-degeneration. I aldersrelateret makuladegeneration (AMD), hvor RPE-degeneration kun forekommer hos ældre patienter, har de med tidlige og mellemliggende former for sygdommen mindre fundus autofluorescenssignaler end aldersmatchede ikke-syge mennesker8. Disse kliniske fund er også blevet verificeret på histologisk niveau 9,10.

Dyremodeller af RPE lipofuscin akkumulering har også efterladt en vis tvetydighed om lipofuscin toksicitet. ABCA4 knockout-musen viser ikke retinal degeneration på en pigmenteret baggrund, mens den gør på en albinobaggrund eller når den udsættes for blåt lys11,12. Endvidere adskiller toksiciteten af lipofuscin afledt via ABCA4 knockout sig sandsynligvis fra den langsommere akkumulerende lipofuscin, der forekommer med naturlig aldring, som det ses i AMD13.

In vitro modeller af lipofuscin akkumulering giver et alternativ til at studere virkningerne af lipofuscin akkumulering på RPE sundhed. Sådanne modeller giver mulighed for at manipulere lipofuscinkomponenter, fra fodring af enkelte retinoidkomponenter til fodring af OS, og tillader undersøgelse i human snarere end animalsk RPE. I de sidste par årtier er der udviklet flere metoder til at modellere RPE-lipofuscin i kultur. Sammen med andre grupper fodrede Dr. Boultons gruppe bovin OS dagligt i op til tre måneder ved passage 4 til 7 humane primære RPE-celler fra donorer i alderen 4 til 85 år14 år. Alternativt har hæmning af autofagi også ført til lipofuscinakkumulering i passager 3 til 7 primære humane RPE-kulturer15. Imidlertid kunne subletal lysosomal hæmning i stærkt differentierede, passage 1, primære humane prænatale RPE (hfRPE) kulturer ikke inducere lipofuscin, selv med gentagen tilsætning af OS dagligt16.

Som en mere reduktionistisk tilgang har andre fodret enkelte lipofuscinkomponenter til kulturer, især bis-retinoid A2E 4,17. Sådanne undersøgelser er værdifulde, idet de definerer potentielle direkte toksicitetsmekanismer for individuelle lipofuscinkomponenter, hvilket for eksempel implicerer lysosomalt kolesterol og ceramidhomeostase18. Samtidig er der debat om toksiciteten af A2E19, og fodring direkte til celler omgår den typiske vej for lipofuscinakkumulering, hvilket involverer fagocytose af fotoreceptor OS. I et forsøg på at levere alle komponenter af lipofuscin til RPE-kulturer rensede Boulton og Marshall lipofuscin fra menneskelige øjne og fodrede dette til passage 4 til 7 humane primære RPE-kulturer afledt af både føtale og ældre menneskelige donorer20. Selvom den er innovativ, repræsenterer denne metode en begrænset lipofuscinkilde til gentagne eksperimenter.

Mens gentagen fodring af OS til RPE-kulturer producerer lipofuscin i mange systemer, undlader det at gøre det i stærkt differentierede primære RPE-kulturer16. Fotooxiderende OS inducerer tværbindingsreaktioner som bis-retinoiddannelse, der naturligt forekommer under lipofuscindannelse in vivo. Dette kan fremskynde lipofuscinlignende granulatdannelse i RPE-kultursystemer, selv dem, der er stærkt differentierede og resistente over for lipofuscinakkumulering16. Her introduceres en metode til at inducere lipofuscinlignende granulakkumulering i stærkt differentieret hfRPE og human iPSC-RPE, modificeret fra Wihlmarks offentliggjorte protokol21. Denne metode har den fordel, at den inducerer lipofuscinlignende granulater ved hjælp af den samme kilde (fotoreceptor OS) og vej (phagolysosomal OS-optagelse) som forekommer for lipofuscinogenese in vivo. Endvidere gøres det på humane RPE-kulturer, der er stærkt differentierede og valideret i flere undersøgelser for at replikere human RPE in vivo22,23,24. Disse lipofuscinlignende granulater kaldes ufordøjeligt autofluorescerende materiale (UAM) og giver data og diskussion i denne protokol, der sammenligner UAM med in vivo lipofuscin. Sammen med metoder til opbygning og evaluering af UAM-belastede kulturer i stærkt differentieret human RPE introduceres også en opdateret metode til vurdering af RPE OS-fagocytose. Flere fremragende pulsjagtmetoder til kvantificering af OS-fagocytose er blevet introduceret, herunder Western blotting, immuncytokemi og FACS25,26,27. Men tidligt i OS-pulsjagten kan forhold, der fører til dårlig OS-optagelse, sammenblandes med forhold, der fremmer hurtig nedbrydning af internaliseret OS. Metoden, der præsenteres her, måler den samlede mængde introduceret operativsystem, der er fuldt forbrugt/nedbrudt af RPE ("Total Consumtive Capacity"), hvilket hjælper med at eliminere denne tvetydighed. Det forventes, at indsigt i lipofuscintoksicitet ved hjælp af disse protokoller, herunder effekter på OS-fagocytosehastigheder ved hjælp af metoden "Total Consumtive Capacity", vil blive brugt til at kaste lys over toksiciteten af lipofuscin in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol, der involverer erhvervelse og anvendelse af humant væv, blev gennemgået og godkendt af University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486).

1. Fremstilling af fotooxiderede ydre segmentspidser og fragmenter

BEMÆRK: Mørktilpassede kvægnethinden blev købt og sendt på is (se materialetabel). Fra disse nethinden blev OS renset efter en tidligere offentliggjort protokol23.

  1. Udvendigt segment tværbinding med en UV-lampe
    1. Dyp polytetrafluorethylenbelagte dias (se materialetabel) helt ned i 70% ethanol i 10 minutter i et biosikkerhedsskab for at sterilisere diasene. Lad objektglassene lufttørre i en steril 100 mm cellekulturskål.
    2. Hvert dias anbringes i en ny 100 mm cellekulturskål, og der tilsættes 200 μL serumholdige cellekulturmedier (uanset hvilket medie der typisk anvendes til de foreliggende RPE-kulturer) i hvert rektangel, og anbring derefter et håndholdt 254 nm UV-lys (se materialetabellen) på 100 mm cellekulturskålen (uden låg) med pæren direkte vendt mod objektglasset. og udsæt i 20 min. De medier, der specifikt er anvendt til denne undersøgelse, og de specifikke produktnumre for mediets komponenter er tidligere blevet offentliggjort22,23. Dette medie kaldes "RPE-medier" i hele denne protokol.
      BEMÆRK: UV-behandling af mediet blokerer glasoverfladen og forhindrer OS i at klæbe under de næste trin.
    3. Optø frosne delprøver af OS ved 37 °C (i hånden eller via vandbad). Den nødvendige mængde operativsystem afhænger af applikationen. Generelt kan man behandle op til 500 μL af 2 x 108 OS/ml pr. rektangel på diaset.
    4. Når det er optøet, drej operativsystemet ved 2400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Opsug straks supernatanten i biosikkerhedsskabet ved hjælp af en pipette i stedet for et vakuum for at forhindre utilsigtet tab af pellet.
    5. Opslæv forsigtigt pelleten med steril PBS.
      BEMÆRK: Hold styr på den resuspenderede mængde og den forventede koncentration. F.eks. giver resuspendering af pellet fra et 1 ml rør på 1 x 10 8 OS / ml med 500 μL PBS 2 x 108 OS / ml. Det maksimale volumen og koncentration pr. rektangel på det polytetrafluorethylenbelagte objektglas er 500 μL 2 x 108 OS/ml.
    6. Opsug mediet fra diasene, og anbring op til 500 μL 2 x 108 OS/ml PBS-opløsning på hvert rektangel på diaset. Placer det håndholdte UV-lys over cellekulturskålen (uden låg) med pæren direkte mod operativsystemet. Udsæt OS-opløsningen for 254 nm lys i 40 minutter.
      BEMÆRK: Under 40 minutters eksponering skal du dække UV-lampen og fadet med et håndklæde eller absorberende pude, lukke biosikkerhedsskabets ramme og slukke blæseren. Dette forhindrer enhver signifikant fordampning. Hvis UV-lampen, der anvendes i denne protokol, ikke er tilgængelig for en forsker, er der to alternativer for at sikre, at den passende mængde tværbinding opnås. Den første er at følge den kvantitative UV-eksponering, der er skitseret i trin 1.2, enten med den enhed, der er skitseret i trin 1.2, eller en anden enhed, der kan give den samme kvantitative strålingseksponering som den nævnte enhed i 1.2. Et andet alternativ er at udsætte OS for UV-bestråling i et tidsrum, der inducerer graden af tværbinding på Coomassie-pletten, der ses i figur 1C.
    7. Den behandlede OS PBS-opløsning opsamles i sterile mikrocentrifugeglas, rektanglet på det coatede objektglas vaskes igen med 200-500 μL PBS (2-3x), og hver vask opsamles i mikrocentrifugeglasset. Når du er færdig, skal du se på diaset under et vævskulturrumsmikroskop for at bekræfte, at næsten alt operativsystem er fjernet fra diaset.
    8. Drej OS PBS-opløsningen ned ved 2400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, opsug PBS i biosikkerhedsskabet med en pipetter, og resuspender i 500 μL standardmedier, der skal bruges til RPE-kulturer (f.eks. - "RPE-medier" defineret i punkt 1.1.2). Resuspensionsvolumenet kan justeres baseret på den ønskede fotooxiderede OS-koncentration (OxOS).
    9. Anbring 10 μL af suspensionen i et nyt mikrocentrifugerør, fortynd 50-100x med flere cellekulturmedier, og tæl OS'er med et hæmocytometer.
    10. Baseret på OS-optællingen fortyndes OxOS-suspensionen til en endelig lagerkoncentration. Til fodring af højt modne RPE-kulturer i 24-brønds transboringer (overfladeareal på 0,33 cm 2; se materialetabel) anbefales en slutmediekoncentration på2 x 107 OS/ml.
      1. For at opnå dette fordeles OxOS i 25 μL alikvoter ved en koncentration på 5,6 x 107 OS/ml, suspenderet i standard RPE-kulturmedier. Efter optøning af en 25 μL delprøve blandes hele prøven med 45 μL standard RPE-kulturmedier, hvilket giver et slutmedievolumen på 70 μL og OS-koncentration på 2 x 107 OS/ml for hver OxOS Transwell-tilførsel.
    11. Før du aliquoterer OxOS, skal du tilføje fagocytose, der bygger bro mellem ligander (protein S og MFG-E8, se materialetabel), som letter OS-optagelse og lipofuscinakkumulering. Arbejdskoncentrationerne af broligander i en 24-brønds Transwell er 4 μg/ml for humant renset protein S og 1,5 μg/ml for human rekombinant MFG-E8. For 25 μL alikvoter af OxOS ved 5,6 x 107 OS/ml er stamkoncentrationen for protein S således 11,2 μg/ml og for MFG-E8 4,2 μg/ml.
      BEMÆRK: De brobyggende ligandkoncentrationer blev optimeret til hfRPE-kulturer på 24-brønds transbrønde med et omtrentligt celletal på 320.000 celler pr. 0,33 cm2 brønd. Det kan være nødvendigt at justere ligandkoncentrationerne for andre RPE-typer og celletætheder, da ligander, der er til stede ud over fagocytosereceptorens tilgængelighed, paradoksalt nok kan blokere OS-optagelse28.
    12. Snap fryse alikvoterne i flydende nitrogen.
      BEMÆRK: Flere fryse-optøninger er meget skadelige for OS-integriteten.
  2. Ydre segment tværbinding med en UV-tværbindingsenhed
    BEMÆRK: Følg trin 1.1 med undtagelse af nedenstående trin, som erstatter henholdsvis trin 1.1.2 og 1.1.6:
    1. (erstatter trin 1.1.2) Hvert dias anbringes i en ny 100 mm cellekulturskål, og der tilsættes 200 μL serumholdige cellekulturmedier (f.eks. -"RPE-medier" eller enhver anden erstatning) i hvert rektangel, og derefter anbringes lysbilleder i en ultraviolet tværbindingsenhed (se materialetabel), idet der behandles med 254 nm UV ved en stråleeksponering på 3-6 J/cm2 for at blokere glasoverfladen og forhindre, at operativsystemet sætter sig fast under de næste trin.
    2. (erstatter trin 1.1.6) Opsug mediet fra diasene, og anbring op til 500 μL 2 x 108 OS/ml i sterilt PBS på hvert rektangel på diaset. Placer lysbilleder i den ultraviolette tværbindingsenhed, indstil behandlingsstråleeksponeringen efter behov (3-9 J/cm2), og behandl ved 254 nm.
      BEMÆRK: Den nødvendige strålingseksponering kan bestemmes omhyggeligt ved at titrere stråleeksponering mellem 3-9 J/cm2, indtil graden af autofluorescens og proteintværbinding (som vist i figur 1B og figur 1C) er opnået.
      FORSIGTIG: Håndtering af OS uden for et biosikkerhedsskab kan resultere i kontaminering. Efter eksponering af OS for UV-tværbindingsenheden skal du indsamle OS med sterile pipettespidser, overføre til sterile mikrocentrifugerør og håndtere alle yderligere trin i biosikkerhedshætten.
  3. Karakterisering af oxideret OS
    1. Kvantificer autofluorescensemissionsspektrum ved billeddannelse
      1. 20-50 μL stamopløsning fra ubehandlet OS og OxOS anbringes i to separate mikrocentrifugeglas. Der centrifugeres ved 2400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, pellet resuspenderes i bufferet (f.eks. PBS) 4% paraformaldehyd, og det fikseres i 15 minutter ved stuetemperatur.
      2. Efter fiksering drejes ned som ovenfor, vaskes med PBS x 2 (centrifugeres ned mellem vaskene) og opslæmmes derefter igen i mindre end 30 μL PBS.
      3. Anbring et par mikroliter af resuspensionen på et mikroskopglas, tilføj monteringsmedier (se materialetabel) og til sidst en dæksel.
      4. Billede af OxOS på et konfokalmikroskop (se materialetabel).
        BEMÆRK: OxOS-autofluorescens kan exciteres af en lang række laserbølgelængder, men en 405 nm eller 488 nm laserlinje anvendes typisk. Emission er ligeledes bred, men en typisk GFP / FITC excitation / emissionsfilteropsætning er tilstrækkelig til at se autofluorescens.
      5. For at måle OxOS-emissionsspektret skal du bruge λ-scanning på et konfokalmikroskop. Typiske λ-scanningsindstillinger omfatter excitation med 405 nm eller 488 nm og detektion af emission, der spænder fra 10 nm rødforskudt fra laserexcitationslinjen hele vejen til ca. 800 nm med en λ-trinstørrelse på 10 nm. Hvert mikroskopisystem har sine egne anvisninger på, hvordan man anvender λ-tilstanden, og læseren skal henvise til manualen for deres specifikke konfokal.
    2. Som et alternativ kvantificeres autofluorescens ved flowcytometri.
      1. Drej 2 x 107 ubehandlede OS og separat 2 x 107 OxOS i mikrocentrifugeglas og resuspender i 1 ml PBS.
        BEMÆRK: Fiksering er ikke påkrævet, hvis flowcytometri udføres direkte efter optøning.
      2. Indlæs ubehandlede OS- og OxOS-prøver på flowcytometer (se materialetabel). Juster forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) til et acceptabelt spread i FSC-SSC scatter grafen. Brug PBS som en kontrol for at udelukke enhver kontaminering af små partikler. Bemærk, at OS er betydeligt mindre end celler.
      3. Brug flowcytometerets standard FITC-kanal til autofluorescenskvantificering. Tæl mindst 10.000 hændelser. Brug FITC-histogrammets pulsområdeværdi til at repræsentere fluorescensintensitet.
        BEMÆRK: I denne undersøgelse analyseres alle data ved hjælp af flowcytometeranalysesoftware (se materialetabel) efter producentens anvisninger.
    3. Vurder graden af tværbinding i OxOS
      1. Drej ned 2 x 107 ubehandlede OS og separat 2 x 107 OxOS i mikrocentrifugeglas. Supernatanten fjernes og pellet lyseres direkte ved tilsætning af 1,2x Laemmli prøvebuffer (nok til at dække; se materialetabellen). Hvirvelstrømmen, opbevares ved stuetemperatur i 30 min., centrifugeres ned ved stuetemperatur på 12000 x g eller derover i 10 min, og supernatanten opsamles.
        BEMÆRK: Vurdering af graden af proteintværbinding i OxOS giver en fornemmelse af UV-behandlingens tilstrækkelighed. Sammenligning foretages mellem ubehandlet OS og OxOS, og tilstrækkelig tværbinding opstår, når det monomere rhodopsinbånd, der dominerer Coomassie-farvningen (figur 1C, pil), bare er mærkbart, med fremkomst af højere ordens aggregater og et proteinudtværing øverst på gelen.
        FORSIGTIG: Når du bruger prøvebuffer til at lyse operativsystemet, må du ikke efterfølgende opvarme lysisopløsningen, da dette kan udløse rhodopsinaggregering. Undgå også at afkøle det lyserede operativsystem, indtil det er klar til opbevaring, da dette vil udfælde SDS. Ubrugte lysater kan opbevares ved -20 °C. Hvis du trækker dig tilbage, skal du sørge for, at lysaterne er helt optøet ved stuetemperatur før brug.
      2. Kvantificer proteinkoncentrationen ved hjælp af et proteinassay, der er tolerant over for høje SDS- og reduktionsmiddelkoncentrationer29. Se materialefortegnelsen for forslag til passende proteinassayreagenser, og følg producentens protokol for disse reagenser.
      3. Kør ubehandlede OS- og OxOS-prøver med SDS-PAGE-elektroforese30 på en 4% -15% gradientgel, der anvender standard tris-glycin SDS-buffer. Gel køres ved 80 V, indtil prøver kommer ind i stakken, derefter ved 120 V i 50-60 minutter ved stuetemperatur.
      4. Plet gelen med Coomassie-blå ved hjælp af standardprotokoller31. Coomassie-farvningen vil demonstrere tilstrækkeligheden af tværbinding induceret af UV-behandling.

2. Opbygning af lipofuscinlignende granulater (UAM) i RPE-kulturer

  1. OxOS-fodringer: mængde, hyppighed og fagocytose, der bygger bro over ligander
    BEMÆRK: Fodring forekommer på humane iPSC-RPE- eller hfRPE-kulturer ved passage 1, dyrket i henhold til protokollen skitseret af Bharti-laboratoriet (for iPSC-RPE)32 eller vores tidligere skitserede protokol for hfRPE, tilpasset fra Sheldon Miller-laboratoriet22,23. Alle beregninger nedenfor er baseret på tilførsel af OxOS eller OS til en 24-brønds Transwell (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 vækstareal).
    1. 25 μL 5,6 x 107 OxOS/ml ved 37 °C optøs, og der tilsættes 45 μL cellekulturmedier til OxOS-alikvoten, hvilket resulterer i et slutvolumen på 70 μL.
      BEMÆRK: OxOS-alikvoter fremstillet i trin 1 vil indeholde fagocytose, der bygger bro mellem liganderne MFG-E8 og protein S. Men hvis disse ligander ikke blev tilsat til alikvoterne før nedfrysning, kan de tilsættes på dette trin, hvilket sikrer, at den endelige koncentration af liganderne i det medie, der skal fodres med celler, er 4 μg/ml for protein S og 1,5 μg/ml for MFG-E8. Som anført i trin 1.1.11 kan det være nødvendigt at ændre koncentrationerne af broligander for andre RPE-typer eller celletætheder.
    2. Fjern apikale medier fra Transwell og tilsæt 70 μL 2 x 107 OxOS/ml med fagocytosebroliganderne til det apikale kammer. Efter 24 timer fjernes og udskiftes med en ny OxOS-fodring. Fodring sker dagligt i hverdage, springer weekender over, indtil 20 fodringer er afsluttet (~ 1 måned). Skift basolaterale cellekulturmedier (400-550 μL) 2-3x / uge.
    3. Efter afslutningen af 20 fodringer genoptages normale medieændringer for brønden.
      BEMÆRK: Det kræver flere yderligere medieændringer at vaske klæbrig OxOS fra RPE-apikal overflade, så eksperimenter med UAM-belastede kulturer skal udføres mindst 1-2 uger efter, at OxOS-fodringer er afsluttet.
      FORSIGTIG: Det er vigtigt at have ordentlig kontrol for UAM-opbygning via OxOS-fodringer. Da daglige medieændringer kan påvirke RPE-biologien, anbefales følgende kontrolhuller: Kontrol 1: Udskift medier dagligt på hverdage for samme antal fodringer som OxOS-behandlet gruppe. Kontrol 2: Feed RPE ubehandlet OS dagligt i hverdage med samme koncentration og volumen som OxOS-fodringer til det samme antal fodringer.
  2. Overvågning af sundheden hos kulturer belastet med lipofuscinlignende granulater ved transepitelial elektrisk modstand (TEER) og celledødsassays
    BEMÆRK: Under og efter OxOS-fodring kan sundheden for RPE-kulturer måles ved at vurdere RPE-tæthedsintegritet og celledød. Det er tidligere blevet vist, at vurdering af tæthedsintegritet via måling af transepitelial elektrisk modstand (TEER) er en følsom markør for generel cellesundhed33. Mere traditionelle ikke-invasive markører for celledød, såsom frigivelse af lactat dehydrogenase (LDH), kan også anvendes.
    1. Udfør TEER
      BEMÆRK: TEER testes med en TEER-måler (transepitelial elektrisk modstand) og TEER-elektrode, generelt efter producentens anvisninger (se materialetabel).
      1. For at sterilisere TEER-elektroden skal du bruge en opgavevisker gennemblødt i 70% ethanol til at rengøre elektroden og derefter nedsænke spidserne af elektrodesonden i 70% ethanol i 10 minutter.
      2. Lad elektroden tørre helt, og nedsænk derefter elektroden i sterile medier.
      3. Sonden fjernes fra sterile medier, og TEER-elektrodens to sonder indsættes i de apikale og basolaterale kamre i en dyrket Transwell; Den længere sondespids passer ind i det basolaterale kammer.
        BEMÆRK: Det er let at skrabe bunden af det apikale kammer med TEER-elektroden uden øvelse, og sådan skrabning vil dramatisk ændre TEER-aflæsninger, da det sammenflydende RPE-monolag forstyrres. Derfor anbefales det, at begyndere træner på ikke-vigtige Transwells inden test på eksperimentelle RPE-kulturer. Efter at hver plade af RPE-kulturer er testet, skal eksperimentatoren kontrollere for enhver skrabning af RPE-monolaget under et standard vævskulturmikroskop.
      4. Når de apikale og basolaterale sonder er på plads i Transwell, skal du trykke på læseknappen eller træde på fodkontakten på måleren for at registrere TEER. Mellem plader eller grupper af celler vaskes elektrodesonden med sterile medier. Hvis infektion er en stor bekymring, skal du sterilisere igen mellem pladerne.
      5. Beregn TEER ved at tage modstandsaflæsningen fra måleren, trække værdien af en tom Transwell med medier, men ingen celler (generelt 100-110 Ω for en 24-brønds Transwell med 0,33 cm2 overfladeareal) og derefter gange med Transwells overfladeareal.
        BEMÆRK: TEER-værdier skal rapporteres normaliseret til celleoverfladeareal. Typiske værdier for sunde hfRPE-kulturer spænder fra 350-1100 Ωcm2. TEER-værdier stiger, når temperaturen falder. Når kulturer fjernes fra en 37 °C inkubator til en emhætte ved stuetemperatur, vil TEER-værdierne således have tendens til at stige over pladen. For at beskytte mod denne variation skal du enten arbejde hurtigt (hvis oplevet) eller vente i 10-15 minutter på, at pladetemperaturen udligner stuetemperaturen.
    2. Udfør LDH-frigivelsesanalyse
      BEMÆRK: Frigivelse af LDH til cellekultursupernatant sker under celledød og måles med et standardsæt (se materialetabel).
      1. Supernatanten opsamles oven fra cellerne efter en inkubation på 24 timer og fortyndes til 1:100 ved hjælp af standardmedier.
      2. Inducer total mulig LDH-frigivelse, hvilket er vigtigt for normalisering af alle værdier fra trin 2.2.2.1, ved tilsætning af 2 μL 10% triton X-100 til 100 μL apikale medier fra kontrolceller i en 24-brønds Transwell. Efter inkubation af triton/celle-supernatantblandingen i 15 minutter ved 37 °C blandes mediet over de nu lyserede celler og opsamles for at måle den samlede mulige LDH-frigivelse.
      3. Når supernatanterne er indsamlet, udføres analysen ved hjælp af producentens standardinstruktioner, hvor luminescensen måles efter 30 minutters inkubation med sættets bufferopløsning.
        BEMÆRK: Alle LDH-værdier normaliseres til den samlede mulige mængde LDH-frigivelse.
  3. Karakterisering af lipofuscinlignende granulatspektrum og sammensætning
    1. Erhvervelse af autofluorescenskvantificering og spektre
      1. Reparer UAM-belastede kulturer med 4% PFA ved stuetemperatur i 15 min, efterfulgt af PBS-vask 5x.
      2. Hold en lille mængde PBS i det apikale kammer, og vend derefter Transwell på hovedet. Brug et dissekerende mikroskop og et barberblad til at skære den halvporøse membran fra Transwell og anvende skærekraft ved krydset mellem membranen og Transwell.
        BEMÆRK: Vær konsekvent med hensyn til, hvor tæt på Transwells læbe snittet er lavet, da Transwell-membranen har en tendens til at vride og rynke, når snittene ikke er konsistente.
      3. Når Transwell-membranen er skåret, skal du straks placere den på et mikroskopglas ved hjælp af pincet, og pas på at undgå at røre dele af Transwell-membranen med celler. Væg overskydende PBS væk med en opgaveserviet, samtidig med at du undgår at røre cellerne. Tilføj monteringsmedier og en dæksel. Sørg for at holde styr på, hvilken side af Transwell der er "højre side opad", når du dækker Transwell.
      4. Autofluorescerende intensitet og spektre opnås ved hjælp af de samme indstillinger og procedurer som trin 1.3.1.4 og trin 1.3.1.5.
        BEMÆRK: Ved billeddannelse af UAM er en vigtig confounder, at OxOS er autofluorescerende og ofte klæber til RPE-apikal overflade i dage og nogle gange endda uger efter afslutning af OxOS-fodring. Som følge heraf skal der ved kvantificering af UAM anvendes en metode til at sikre, at målt autofluorescens kommer fra UAM og ikke OxOS. Den nemmeste metode er at co-plette lipofuscinkulturer med et rhodopsinantistof. For eksempel kan anti-rhodopsin-antistof 4D2 anvendes i en 1:1000 fortynding og med en standard PFA-fikseringsimmuncytokemisk protokol34. Det sekundære antistof mod rhodopsin bør være et fjernrødt farvestofkonjugeret antistof (f.eks. med en excitationsmaksima nær 647 nm), da UAM og OxOS autofluorescens har tendens til at være svagest i denne bølgelængde. Konfokale billeder kan derefter sekventielt erhverves i to kanaler, spændende UAM og OxOS autofluorescens med en 405 nm laser og emission fra 415 nm til 550 nm, mens resterende rhodopsin, der indikerer ufordøjet OxOS, kan exciteres med standard fjernrøde farvestofbilleddannelsesparametre i en separat kanal. Efter erhvervelsen kan rhodopsinkanalen bruges som en subtraktiv maske i et program som ImageJ til at fjerne autofluorescens, der kommer fra klæbrig resterende OxOS, hvilket kun efterlader UAM-autofluorescens for at kvantificere.
        FORSIGTIG: Selv OS, der ikke er fotooxideret, viser en vis autofluorescens, og selv med streng vask holder nogle OS og OxOS sig til RPE-overfladen. Uden at generere en subtraktiv maske ved hjælp af rhodopsinimmunfarvning, som foreslået i ovenstående BEMÆRK, er nøjagtig kvantificering af UAM-autofluorescensniveauer i kulturer fodret med OxO'er eller standard OS ikke mulig.
    2. Udfør samtidig påvisning af lipofuscinlignende granulater og andre immunfluorescensmarkører
      BEMÆRK: Som beskrevet i trin 2.3.1 begrænser det brede autofluorescensspektrum af lipofuscin valg til fluorescensfarvning. Følgende metoder kan overvejes for at lette samfarvning.
      1. Brug en langt rød fluorofor. Autofluorescens fra lipofuscin er svag i den nærmeste infrarøde. Således kan anvendelse af et langt rødt farvestof til fluorescensdetektion af et antigen af interesse kombineret med omhyggelige justeringer af kanalindstillinger på et konfokalmikroskop normalt skelne autofluorescens fra co-farvning af fluorescens.
      2. Udnyt den lange fluorescensemissionshale af lipofuscin.
        BEMÆRK: Da lipofuscin har et meget bredt fluorescensemissionsspektrum, kan det ofte exciteres ved en lav nm-bølgelængde (f.eks. 405 nm laser) og stadig have emission detekteret i den orange / røde del af spektret (f.eks. 585-635nm). Denne unikke kombination af excitations- og emissionsbølgelængder kan ofte skræddersys omkring en anden co-farvningsfluorofor.
        1. Detekter antigenet af interesse ved hjælp af en fluorofor, der har maksimal excitation omkring 488 nm, med emissionsdetektion ved 500-530 nm. Opsæt en separat kanal til autofluorescensdetektion med 405 nm excitation og 585-635 nm emission. Denne anden kanal registrerer kun UAM, mens den første kanal registrerer antigenet af interesse plus lipofuscin.
        2. Brug et free-ware-program som ImageJ til at bruge denne anden UAM-eneste kanal som en subtraktiv maske til at fjerne UAM-signalet fra den første kanal (som indeholder både antigensignalet og UAM-signalet).
      3. Brug spektral unmixing. De fleste moderne konfokale mikroskoper indeholder en spektral unmixing mulighed. Dette gør det muligt for en at erhverve spektret af en prøve med kun UAM og en anden prøve med kun den co-farvning fluorofor af interesse. Den eksperimentelle prøve, der indeholder både UAM og co-farvningsfluoroforen, kan derefter erhverves og udsættes for lineære unmixing-metoder for at beregne, hvilken procentdel af signalet der kom fra autofluorescens vs. co-farvning.
        BEMÆRK: Omfattende vejledninger til spektral unmixing er tilgængelige med de fleste moderne konfokale mikroskoper.
      4. Brug fluorescens levetid billeddannelse. Mens emissionsspektret mellem UAM og en co-farvning af fluorofor af interesse kan være ens, er det sandsynligt, at deres fluorescenslevetid adskiller sig betydeligt. Generelt viser UAM kortere fluorescenslevetid end de fleste specifikke fluoroforer. Med adgang til et konfokalmikroskop, der giver mulighed for livstidsbilleddannelse, kan man gate fluorescenssignaler for at detektere dem, der er længere end den typiske lipofuscin levetid.
        BEMÆRK: Generelt reducerer gatingfluorescenslevetid til signaler, der er længere end 2 ns, UAM-kontaminering kraftigt, selvom det ikke helt eliminerer signalet.
      5. Brug af en autofluorescensdæmper. Traditionelt er Sudan Black blevet brugt til at slukke autofluorescens før specifik immunfluorescensfarvning35. Flere kommercielt tilgængelige autofluorescens quencher produkter rapport for at forbedre resultaterne af Sudan Black, og disse produkter er detaljeret i tabellen over materialer. Autofluorescens slukning vil naturligvis ødelægge evnen til at detektere lipofuscin.
    3. Bestem sammensætningen af lipofuscinlignende granulater
      1. Vurder neutrale lipider
        1. Fastgør UAM-belastet RPE og kontrolbrønde (fodret ubehandlet OS) i 4% PFA ved stuetemperatur i 15 minutter, og vask med PBS 5x.
        2. Plet til neutrale lipider med enten 10 μg/ml Nilrød eller 3,33 μg/ml Bodipy 493/503 i en 3% BSA PBS-opløsning ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af vask med PBS i 5 min 3x.
        3. Klip og monter Transwell som i trin 2.3.1.2 og 2.3.1.3 og billede. Generelt skal du bruge følgende excitations- og emissionsbåndbredder til billeddannelse: Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm og Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Vurder esterificeret og uesterificeret kolesterol
        1. Følg trin 2.3.3.1.1
        2. Filipin er et fluorescerende farvestof, der genkender uesterificeret kolesterol, men ikke esterificeret kolesterol36. For at vurdere mængden af total cholesterol (uesterificeret og esterificeret) i UAM skal du først forbehandle prøven med kolesterolesterase for at omdanne esterificeret kolesterol til uesterificeret kolesterol. Cellerne behandles med 20 E/ml kolesterolesterase i 0,1 M kaliumphosphatbuffer (pH 7,2) (se materialetabel) ved 37 °C i 3,5 timer, efterfulgt af vask med PBS i 5 min 3x.
        3. Plet med 50 μg/ml filipin (se materialetabel) i PBS ved stuetemperatur i 1 time og vask med PBS i 5 min 3x. Hold prøverne tildækket, væk fra lys, da filipin fotobleger let.
          BEMÆRK: Hvis kun uesterificeret kolesterol skal kvantificeres, kan kolesterolestera i trin 2.3.3.2.2 springes over. Hvis mængden af esterificeret kolesterol skal kvantificeres, kan den udledes af forskellen mellem det totale kolesterol og det ikke-esterificerede kolesterol i prøven.
        4. Klip og monter Transwell som i trin 2.3.1.2 og 2.3.1.3 og billede.
          BEMÆRK: Ved billeddannelse filipin fotobleges det meget hurtigt. Man er nødt til at minimere intensiteten og varigheden af excitation og forvente, at en vis fotoblegning endda kan forekomme ved at se prøven gennem okularen. Derfor bør man, når man billeddanner: (1) søge efter et passende område til billedet ved hjælp af en anden fluorescenskanal end filipinkanalen, (2) afbilde filipin på et widefield snarere end konfokalmikroskop (for at begrænse intensiteten af lyseksponering) og (3) undgå gentagen billeddannelse af et område. Generelt skal du bruge følgende excitations- og emissionsbåndbredder til billeddannelse af filipin - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Vurdering af virkningerne af lipofuscinlignende granulater på RPE-fagocytose: Samlet forbrugskapacitet

BEMÆRK: Begrundelsen for måling af OS-fagocytose via OS-pulsprotokollen nedenfor er beskrevet i afsnittet om repræsentative resultater. Metoden, der kaldes "Total Consumtive Capacity", undgår tvetydigheder om fagocytoseeffektivitet, der kan opstå med traditionelle OS-pulsjagtende fagocytose-assays. Assays udføres på 24-brønds Transwell-plader ved hjælp af 50 μL medier indeholdende 4 x 106 OS / ml.

  1. Beregn antallet af brønde, der er nødvendige til eksperimentet, og tø derefter en passende mængde almindeligt OS op, drej ned ved 2400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og resuspender i standard RPE-cellekulturmedier til 4 x 106 OS / ml. Tilføj broligander for at lette fagocytosehastigheder.
    BEMÆRK: Den endelige koncentration af broliganderne i det medie, der skal fødes celler, er 4 μg/ml for protein S og 1,5 μg/ml for MFG-E8. Som anført i trin 1.1.11 kan det være nødvendigt at ændre koncentrationerne af broligander for andre RPE-typer eller celletætheder.
  2. Fjern apikale medier og tilsæt 50 μL 4 x 106 OS/ml, ideelt med passende koncentrationer af broligander.
  3. På forskellige tidspunkter efter tilsætning af operativsystemet (f.eks. - 0 timer, 1 time, 4 timer og 24 timer) tilsættes 16,67 μL 4x Laemmli prøvebuffer med proteasehæmmere for at lysere både celler og den overliggende OS-holdige supernatant. Brug en P-200-pipette til at ridse Transwell-overfladen, pas på ikke at punktere Transwell-membranen eller løsne membranen fra Transwell, og saml den kombinerede cellesupernatant plus cellelysat sammen. Vortex, drej ned og lad det stå ved stuetemperatur i 30 minutter for grundig denaturering.
    FORSIGTIG: På trods af at du bruger prøvebuffer til at lyse operativsystemet, må du ikke efterfølgende opvarme lysisopløsningen, da dette kan udløse rhodopsinaggregering. Undgå også at afkøle det lyserede operativsystem, indtil det er klar til opbevaring, da dette vil udfælde protein. Ubrugte lysater fryses ned ved -20 °C, og sørg for, at lysaterne er helt optøet før brug.
  4. Kør lysater på SDS PAGE ved hjælp af de samme indstillinger som i trin 1.3.3, og indlæs lige store mængder lysater pr. Brønd. GAPDH, β-actin eller et andet husholdningsprotein bør bruges til at normalisere celleantallet, da fagocytosehastigheder er afhængige af cellenummer.
  5. Sonde Western blots med antistoffer mod enten N- eller C-terminalen af rhodopsin. Brug standard vestlige blottingbetingelser, og antistoffortyndinger er anført i materialetabellen.
    BEMÆRK: Under hovedrhodopsinbåndet vil der være flere rhodopsinfragmenter. Disse fragmenter repræsenterer delvist fordøjet rhodopsin, en proces, der starter før fusion af fagosomet med lysosomet32,33. En stigning i antallet af rhodopsinfragmenter i UAM-laden RPE sammenlignet med kontrol-RPE kunne indikere en nedstrømsdefekt i fagosomkapaciteten på niveauet af fagosom-lysosomfusion, lysosomal forsuring og/eller nedbrydningsenzymfunktion 16,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Opsætningen til fotooxidation af OS er vist i figur 1Ai. De polytetrafluorethylenbelagte dias gør det muligt at indlæse en stor mængde OS i opløsning pr. åbent rektangel uden at sprede sig over resten af diaset. Objektglasset med OS er indeholdt i en steril petriskål med låget slukket, og en UV-lampe er placeret over diaset som vist i figur 1Aii. Alternativt kan objektglasset placeres i en UV-tværbindingsanordning, som vist i figur 1Aiii. Efter fotooxidation øges OS-autofluorescens signifikant, vurderet ved både mikroskopi og flowcytometri (figur 1B). Graden af proteintværbinding efter fotooxidation kan vurderes ved SDS-PAGE med en Coomassie-plet, vist som en omdannelse af det dominerende proteinbånd (monomere rhodopsin) til højere ordens aggregater og udtværing (figur 1C). Sammenligning af fotooxidation med en håndholdt UV-lampe (figur 1Aii) versus UV-tværbindingsenheden (figur 1Aiii) viser, at den håndholdte UV-lampe producerer OxOS med lige så meget autofluorescens som en 3 J/cm2-behandling fra UV-tværbindingsenheden (figur 1B) og lige så meget proteintværbinding som en 6 J/cm2-behandling fra UV-tværbindingsenheden (figur 1C). Hvis den UV-lampe, der er tilgængelig for en forsker, adskiller sig fra den, der anvendes i denne protokol, foreslår vi, at eksponeringstiden titreres for at opnå et niveau af tværbinding, der ses i UV-lampebanen i figur 1C. Autofluorescensspektret af OxOS er mildt blåforskudt sammenlignet med spektret af ubehandlet OS, både i den proteinisolerede fraktion af OS og den lipidisolerede fraktion af OS16.

Mængden af UAM-ophobning i RPE-kulturer afhænger af antallet af OxOS-fodringer (figur 2A), og 20 fodringer i løbet af ca. 4 uger giver en robust mængde UAM-akkumulering. For at skelne UAM-autofluorescens fra autofluorescens af resterende OxOS, der forbliver fast på RPE-apikal overflade, selv dage til uger efter afvaskning, pletter vi med et rhodopsinantistof, detekteret med et langt rødt farvestof. Ved at bruge denne rhodopsinfluorescenskanal som en maske kan vi trække OxOS-autofluorescens fra UAM-kanalen, hvilket sikrer, at vi virkelig kvantificerer autofluorescens fra UAM kun16. Ved hjælp af farvningsprotokoller skitseret ovenfor har akkumuleret UAM i denne model rigelige neutrale lipider, som vurderet af Nile Red farvning16, svarende til native lipofuscin. Vi finder dog lidt eller ingen esterificeret eller uesterificeret kolesterolakkumulering (figur 2B), hvilket er i overensstemmelse med den manglende kolesterolakkumulering, vi ser i native lipofuscin fra raske øjne (data ikke vist).

Det er vanskeligt at følge fluorescerende markører af interesse samtidig med lipofuscin, autofluorescens i betragtning af lipofuscins meget brede fluorescensemissionsspektrum. I metodeafsnittet ovenfor er flere metoder detaljeret for at løse dette problem. Den metode, der er skitseret i trin 2.3.2.1 ovenfor, udnytter den lave autofluorescensemissionsintensitet for lipofuscin i det fjerne rødt. I figur 2Ci vurderes colokaliseringen af UAM og autofagimarkøren LC3 ved farvning af LC3 med et Alexa 647-farvestof. På trods af en vis gennemblødning af UAM i LC3-kanalen er det tydeligt, hvor lipofuscin og LC3 er placeret på disse billeder. I den metode, der er skitseret i trin 2.3.2.2 ovenfor, tillader lipofuscins meget lange fluorescensemissionsspektre design af en emissionskanal, der kun indeholder fluorescens fra lipofuscin. I figur 2Cii er UAM exciteret med en 488 nm laser, mens emission detekteres ved både 500-535 nm og ved 600-645 nm. Prøven er co-farvet med LC3, detekteret med Alexa 488 farvestof. Alexa 488-kanalen (excitation: 488 nm, emission: 500-535 nm) indeholder både LC3- og UAM-signal. Den anden kanal med 488 nm excitation og 600-645 nm emission indeholder dog kun UAM. Denne anden kanal kan bruges som en maske, der anvendes på Alexa 488/LC3-kanalen, for at trække uønsket UAM-signal fra LC3-signalet. I metoden skitseret i trin 2.3.2.4 ovenfor tillader den kortere fluorescenslevetid for autofluorescerende lipofuscin en at skelne lipofuscin fra co-farvning fluorescens. I figur 2Ciii elimineres alle fluorescenssignaler, der ankommer til en fotontælledetektor før 2 ns, hvilket lukker meget af UAM-autofluorescenssignalet ud, mens det stort set bevarer co-farvningssignalet fra LC3. En kombination af metoder kan være nødvendig for at skelne lipofuscin fra co-farvning fluorescens, hvis der er stærk co-lokalisering af lipofuscin og co-farvning fluorofor.

Da flere undersøgelser har postuleret en indvirkning af RPE-lipofuscinakkumulering på OS-fagocytosehastigheder 5,36,37,38,39, blev OS-fagocytosekapacitet i UAM-belastede kulturer vurderet. Typiske fagocytose-assays involverer en kort inkubation af celler med OS ("puls") efterfulgt af afvaskning af ubundet OS og udskiftning af medier uden OS i en "jagt" periode. Under jagten, da OS nedbrydes, er der et tab af rhodopsin, det mest rigelige protein i OS, inden for RPE. På forskellige tidspunkter under jagten fjernes det OS-frie medie efterfulgt af cellelyse og SDS-PAGE for rhodopsin, der forbliver inden for RPE-lysaterne. Da OS-pulsperioden imidlertid består af både optagelse og nedbrydning af OS, kan RPE med høj optagelse og nedbrydning ("fagocytoseeffektive" celler) have de samme rhodopsinniveauer tidligt i jagtperioden som RPE med lav optagelse og nedbrydning ("fagocytose ineffektive" celler). Dette er skematisk repræsenteret i undersøgelsen af Zhang et al23. For at overvinde denne tvetydighed blev der anvendt et "puls-only" assay her. I denne metode pulseres OS på RPE, men vaskes ikke af. På forskellige tidspunkter efter OS-tilsætning samles medierne og cellelysatet sammen. Mediet indeholder ufordøjet OS, og cellelysatet indeholder en kombination af intakt OS på celleoverfladen, delvist fordøjet OS, der er blevet internaliseret, og fuldt fordøjet OS, der med succes har gjort det gennem lysosomet. Som kontrol udsættes cellerne for OS, men derefter opsamles cellelysatet og OS-holdige supernatant straks. Denne kontrol afslører, hvor meget total rhodopsin blev introduceret til cellerne. Da lysat plus supernatant indsamles forskellige steder efter OS-introduktion, kan man vurdere, for hvilken brøkdel af det samlede rhodopsinsignal der er forsvundet, ved hjælp af dette som markør for mængden af alle indførte/startende OS, der nu er fuldstændig nedbrudt. Udlæsningen for dette assay kaldes "Total Consumtive Capacity", da den nøjagtigt måler al OS-nedbrydning og ikke er underlagt de forvirrende fortolkninger af et pulsjagteksperiment beskrevet ovenfor.

Figur 3A og supplerende figur 1 viser en vestlig plet af resterende rhodopsin ved hjælp af analysen Total Consumtive Capacity. Mængden af OS, der føres til celler, måles af rhodopsinbåndet ved 0 timer. Hovedrhodopsinbåndet nedbrydes med samme effektivitet mellem kontrol- og UAM-ladede RPE-prøver (enkelt pil ved 4 timer og 24 timer). Der er dog forskel på grupperne, når man ser på delvist nedbrudte fragmenter af rhodopsin, som vises under hovedrhodopsinbåndet. Forskellene i fragmentoverflod indebærer reduceret lysosomal kapacitet i UAM-gruppen, da proteolytisk spaltede fragmenter af rhodopsin hurtigt bør nedbrydes med normal lysosomal funktion. Øget overflod af disse fragmenter uden øget overflod af det vigtigste rhodopsinfragment antyder mere subtile defekter i lysosomal nedbrydningskapacitet i UAM-belastede kulturer. Tidligere undersøgelser har antydet, at lipofuscin faktisk kan fremkalde defekter i OS phagocytosis44, men ingen tidligere undersøgelse har undersøgt virkningerne af lipofuscin specifikt på rhodopsinfragmenter, hvilket muliggør en mere præcis lokalisering af dysfunktionen til slutstadierne af fagosomal nedbrydning. Figur 3B viser vestlig blotting af hovedrhodopsinbåndet plus rhodopsinfragmenter ved hjælp af to forskellige anti-rhodopsin-antistoffer. Antistof 4D2 genkender rhodopsins N-terminal, og N-terminale fragmenter er den sidste del af rhodopsin, der nedbrydes i lysosomet. I modsætning hertil genkender antistof 1D4 C-terminalen af rhodopsin, som nedbrydes selv før fagosom-lysosomfusion. Forståelse af, hvilke fragmenter pletter med hvilket antistof, giver således en følelse af rhodopsinbehandlingsdefekter, der er præ-lysosomale vs. lysosomale 32,40,41.

Figure 1
Figur 1: Fotooxideret ydre segment (OxOS) behandling og karakterisering. ( A ) Afbildning af OS på et polytetrafluorethylenbelagt objektglas (i ) behandlet med enten en 254 nm UV håndholdt lampe ( ii) eller en UV Crosslinker enhed (iii). (B ) Sammenlignet med ubehandlet (almindeligt) OS (RegOS) havde behandlet OS (OxOS) øget autofluorescens som vist ved konfokal billeddannelse (venstre) (skalabjælke = 10 μm) og flowcytometri (højre). Autofluorescerende intensitet af OxOS behandlet med den håndholdte UV-lampe svarede til OS-behandlet med UV-tværbindingsenheden ved en strålende eksponering på 3 J/cm2 (fejlbjælke = S.E.M.). C) SDS-PAGE, der viser tværbindingen af OS-protein induceret ved UV-eksponering. OxOS-tværbinding via den håndholdte UV-lampe svarede til OS, der blev behandlet med UV-tværbindingsenheden ved en stråleeksponering på 6 J/cm2. Monomere rhodopsin fremhæves med en pil. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Billeddannelse af OxOS-inducerede lipofuscinlignende granulater i hfRPE-kulturer. (A ) Autofluorescerende granulater (grøn) induceret af OxOS akkumuleret betydeligt mere efter 20 fodringer sammenlignet med 5 fodringer. Resterende OxOS-plet med rhodopsinantistof (magenta). Skalabjælke = 10 μm. (B) UAM induceret af OxOS (grøn) blev ikke beriget med frit kolesterol eller kolesterolester, vurderet ved filipinfarvning ( rød). Scele bar = 10 μm. (C) Billeddannelsesmetoder til fluorescens co-farvning i nærvær af lipofuscin. (i ) Brug af langt rød fluorofor (Alexa 647) til at plette autofagimarkør LC3 (magenta), hvilket minimerer UAM-gennemblødning. Ren UAM (grøn) afbildet med en standard grøn kanalexcitations- og emissionsfilteropsætning. Skalabjælke = 2 μm. (ii) Brug af ratiometrisk billeddannelse hjælper med at dechifrere UAM-autofluorescens fra LC3-farvning mærket med Alexa 488. Excitation er 488 nm, grøn kanal emission båndpass er 500-535 nm, mens rød kanal emission båndpass er 600-645 nm. Rød kanal kan anvendes som en subtraktiv maske for at isolere LC3-signal fra den grønne kanal. Skalabjælke = 5 μm. (iii) Da lipofuscin/UAM's fluorescenslevetid typisk er kortere end specifikke farvestoffer, kan UAM-autofluorescens reduceres ved at udsende fluorescenssignaler, der ankommer til en fotontælledetektor på mindre end 2 ns. Topbillede er uden gating. Nederste billede er med gating, der kun holder fluorescenssignaler med en levetid længere end 2 ns. Der er en større relativ reduktion i UAM-signal sammenlignet med specifikt LC3-signal (mærket med Alexa 488) mellem top- og bundbilleder. Skalabjælke = 5 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: "Total Consumtive Capacity" metode til måling af OS-fagocytose. (A) Samlet resterende rhodopsinprotein i både cellelysat og supernatant efter introduktion af OS til RPE-kultur, som analyseret ved western blot. Efter tilførsel af almindelig OS i 50 μL medier blev både det konditionerede medie/supernatanten og cellerne lyseret sammen ved 0, 4 og 24 timer. Tidspunktet 0 timer fungerer som en kontrol, der angiver den samlede mængde OS, der føres til hver Transwell. Det intakte rhodopsinbånd (enkelt pil) var ikke forskelligt mellem kontrol- og UAM-belastede RPE-celler, hvilket tyder på, at UAM ikke har nogen stor effekt på RPE-fagocytose. Imidlertid var spaltningsprodukterne af rhodopsin, angivet med dobbeltpilene, højere i UAM-gruppen, hvilket tyder på en mild nedbrydningsdysfunktion i fagosomsystemet. Lige niveauer af GAPDH indikerer, at celletal mellem brønde, som kan påvirke fagocytosehastigheder, var ens. (B) Forskellige rhodopsinantistoffer genkender forskellige nedbrydningsfragmenter. 4D2 genkender N-terminalen af rhodopsin, som er intakt indtil de allersidste trin af lysosomal nedbrydning. De fragmenter, den genkender, er derfor små (dobbeltpile). I modsætning hertil genkender 1D4 C-terminalen af rhodopsin, som nedbrydes tidligere i fagosomalprocessen. Dette antistof genkender derfor rhodopsinfragmenter med en højere molekylvægt (dobbeltpile). Begge antistoffer genkender intakt rhodopsin (enkelt pil). Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Uredigeret plet svarende til figur 3A. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens RPE lipofuscin er blevet undersøgt i årtier, dets toksicitet diskuteres 2,9,16,42. På grund af tvetydighed om lipofuscins toksicitet fra dyremodel11 er in vitro-modeller, der anvender human RPE, værdifulde. En række in vitro lipofuscinakkumuleringsmodeller er blevet beskrevet, men ingen har udnyttet både OS-fodring og meget modne og differentierede humane RPE-kulturer. Denne kombination repræsenterer en ideel model, da OS-fodring rekapitulerer metoden til lipofuscinakkumulering in vivo, og meget modne humane RPE-kulturer bedst replikerer RPE-adfærd in vivo. Interessant nok blev det opdaget, at når man brugte stærkt differentierede hfRPE-kulturer, var det opdaget, at rutinemæssig OS-eksponering var utilstrækkelig til at inducere lipofuscinlignende materiale, selv efter gentagne fodringer16. Således accelererer denne protokol lipofuscinakkumuleringsprocessen ved fotooxiderende OS (OxOS) på en kontrolleret måde. Fodring af OxOS til både humane iPSC-RPE- og hfRPE-kulturer resulterede i robust ophobning af lipofuscinlignende granulater, som kaldes ufordøjeligt autofluorescerende materiale (UAM). UAM-akkumulering muliggør modellering af lipofuscin i dyrkningssystemer, der efterligner sund human RPE in vivo 22,23,29,43,44. I både en tidligere publikation og i denne undersøgelse viser omfattende karakterisering af UAM sammenlignet med native lipofuscin fra raske ældre voksne både ligheder og forskelle. UAM efterligner ultrastrukturen af lipofuscin in vivo, herunder tendensen til, at lipofuscingranulat smelter sammen med melaningranulat til dannelse af melanolipofuscin16. Både UAM og lipofuscin indeholder betydelige neutrale lipider, ingen rhodopsin og ingen signifikant berigelse i kolesterol (figur 2A, B fra vores tidligere publikation16, figur 2A, B ovenfor og upublicerede data). Vi sammenlignede også native lipofuscin granulat størrelse og spektrum med dem fra UAM (figur 3 fra vores tidligere publikation16). UAM-granulater er oprindeligt lidt større og blåforskudte sammenlignet med native lipofuscin, men over betydelige perioder i kultur komprimeres UAM til en mindre størrelse og rødforskydning i deres emissionsspektrum og bliver meget mere lig størrelsen og spektreprofilen af native lipofuscin.

OxOS UAM-modellen er blevet brugt til en række applikationer, herunder virkningerne af autofagiinduktorer på forebyggelse og fjernelse af lipofuscingranulat50 og virkningerne af lipofuscin på RPE-polaritet og metabolisme16. Endvidere har disse granulater vist sig at fortsætte i dyrket RPE i mere end et år, hvilket gør det muligt at studere udviklingen af lipofuscinspektre, morfologi og adfærd over længere perioder16. Andre anvendelser til modellen inkluderer undersøgelsen af lipofuscinakkumulering ved komplementaktivering51, lysosomal stabilitet og inflammatoriske reaktioner 52 og mitokondriekompromis53.

Der er et par kritiske trin i denne protokol. For det første skal RPE-kulturer være meget differentierede og modne. OxOS-fodringer bør først påbegyndes, når RPE har været på Transwells i mindst 8 uger og har opnået alle de kvaliteter, der er karakteristiske for meget moden RPE (de 5 'P'er uddybet af Finnemann et al. - polygonal i morfologi, postmitotisk, pigmenteret, polariseret og fagocytisk54). For det andet er OS meget skrøbeligt og skal håndteres med forsigtighed under pipettering. Overdreven pipettering eller frysetøning vil bryde operativsystemet fra hinanden. Endelig er forholdet mellem OS og total UV-fluxeksponering kritisk for at generere OxOS, der forbliver intakt, men stadig kan inducere UAM; Dette forhold er blevet raffineret i denne protokol. For meget UV-lys til et givet antal operativsystemer forårsager overdreven tværbinding og ødelægger kritiske kemiske strukturer i operativsystemet. For lidt UV-lys til et givet antal operativsystemer vil ikke fremkalde UAM i kultur.

Ændringer af protokollen involverer stort set ændring af OxOS-fodringsvarighed eller koncentration. Empirisk producerer 20 fodringer i løbet af cirka 4 uger en robust mængde UAM-akkumulering. Fodring ud over dette kan gradvist øge UAM-akkumulering, mens færre fodringer sandsynligvis kun forårsager sporadisk UAM-akkumulering. Antallet af fodringer kan justeres ud fra eksperimentets og eksperimentatorens formål, behov og ressourcer. I mindre differentierede RPE-kulturer (højere passageantal, cellelinjer eller kulturer, der viser epitel-mesenkymale overgangsegenskaber) er færre fodringer og lavere OxOS-koncentrationer nødvendige for robust UAM-induktion.

Protokollen har flere begrænsninger. Brug af en håndholdt UV-lampe til fotooxidation af OS forhindrer præcis kvantificering af den samlede strålingseksponering, der leveres til OS. Imidlertid blev fotooxidation af OS ved hjælp af den håndholdte lampe korreleret i denne undersøgelse til en meget dyrere (men kvantitativ) UV-tværbindingsenhed i figur 1 for at hjælpe med at tilvejebringe parametre for strålingseksponering. Det anbefales, at eksperimenter ændrer varigheden af UV-eksponering, indtil tværbindings- / rhodopsinudtværingsmønsteret efterligner det, der ses i UV-lampesøjlen i Western blot i figur 1C.

En anden begrænsning af metoden er, at den sandsynligvis mangler mange af funktionerne ved lipofuscinakkumulering in vivo. Faktisk omtales de lipofuscinlignende granulater i hele denne protokol som ufordøjeligt autofluroescent materiale (UAM) for at gøre denne sondring klar. Fotooxiderende OS rekapitulerer nogle af de naturlige kemiske tværbindinger, der sker i fotoreceptorens ydre segmenter i sygdomstilstande, men tværbindingen er stærkt accelereret og sandsynligvis mere uspecifik i UAM-modellen. På trods af næsten en måneds OxOS-fodring repræsenterer UAM-modellen stadig en "akut" eksponering for lipofuscin-inducerende OS sammenlignet med de årtier, det tager for lipofuscin at akkumulere hos mennesker. Med en mere langvarig lipofuscinakkumulering i kultur kan der være færre fænotypiske virkninger. Ikke desto mindre, fordi UAM-granulat vedvarer i mere end et år i det kultursystem, der præsenteres her, er der mulighed for at studere deres langsigtede virkninger på RPE-sundhed16.

En begrænsning af metoden "Total Consumtive Capacity", der præsenteres her for at vurdere RPE-fagocytosekapacitet, er, at den ikke skelner mellem, om fagocytosedefekter kan skyldes OS-binding vs. optagelse vs. nedbrydning. Når målet med fagocytoseanalysen er mekanistisk indsigt i dysfunktion af specifikke trin i fagocytoseprocessen, er traditionelle OS-pulsjagtassays mere passende. Måling af "Total Consumtive Capacity" bør anvendes, når målet simpelthen er entydigt at måle OS-fagocytosekompetencen for RPE-kulturen under kontrol versus eksperimentelle betingelser.

Afslutningsvis præsenteres en protokol for lipofuscinlignende granulakkumulering i stærkt differentierede humane RPE-kulturer. Denne metode fusionerer den fysiologiske proces for lipofuscinakkumulering - gentagen fodring af fotooxideret OS - med RPE-kulturmodeller, der i gentagne undersøgelser har vist sig stærkt at rekapitulere human RPE in vivo. De resulterende kulturer fyldt med lipofuscinlignende granulater kan anvendes til utallige applikationer, lige fra vurdering af lipofuscineffekter på RPE-biologi til test af små molekyler, gener og signalveje, der er vigtige for modulering af lipofuscinakkumulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde støttes delvist af bevillinger fra Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) og International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. støttes i øjeblikket af en K08-bevilling fra National Eye Institute (EY033420). Ingen føderale midler blev brugt til HFT-forskning. Yderligere støtte kommer fra James Grosfeld Initiative for Dry AMD og følgende private donorer: Barbara Dunn og Dee & Dickson Brown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Tags

Biologi udgave 194 Lipofuscin retinal pigmentepitel (RPE) fotoreceptor ydre segment tips eller fragmenter (OS) fagocytose Stargardts sygdom aldersrelateret makuladegeneration (AMD) ufordøjeligt autofluorescensmateriale (UAM)
Forbedrede lipofuscinmodeller og kvantificering af ydre segment fagocytosekapacitet i stærkt polariserede humane retinale pigmentepitelkulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. … More

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter