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Biology

अत्यधिक ध्रुवीकृत मानव रेटिना वर्णक उपकला संस्कृतियों में बेहतर लिपोफसिन मॉडल और बाहरी खंड फागोसाइटोसिस क्षमता का परिमाणीकरण

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

यह प्रोटोकॉल अत्यधिक विभेदित और ध्रुवीकृत मानव रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) संस्कृतियों में एक लिपोफससिन संचय मॉडल और आरपीई की कुल ओएस खपत / गिरावट क्षमता का पता लगाने के लिए एक बेहतर बाहरी खंड (ओएस) फागोसाइटोसिस परख का वर्णन करता है। ये विधियां पिछले लिपोफसिन मॉडल और शास्त्रीय पल्स-चेज़ बाहरी खंड फागोसाइटोसिस परख की सीमाओं को दूर करती हैं।

Abstract

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) द्वारा फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों का दैनिक फागोसाइटोसिस एक इंट्रासेल्युलर उम्र बढ़ने वाले वर्णक के संचय में योगदान देता है जिसे लिपोफसिन कहा जाता है। लिपोफस्सिन की विषाक्तता स्टार्गर्ड की बीमारी में अच्छी तरह से स्थापित है, सबसे आम विरासत में मिली रेटिना अपघटन, लेकिन उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) में अधिक विवादास्पद है, जो विकसित दुनिया में अपरिवर्तनीय अंधापन का प्रमुख कारण है। मनुष्यों में लिपोफससिन विषाक्तता का निर्धारण करना मुश्किल रहा है, और स्टारगार्ड के पशु मॉडल में सीमित विषाक्तता है। इस प्रकार, इन विट्रो मॉडल जो विवो में मानव आरपीई की नकल करते हैं, लिपोफसिन उत्पादन, निकासी और विषाक्तता को बेहतर ढंग से समझने के लिए आवश्यक हैं। आज तक अधिकांश सेल कल्चर लिपोफसिन मॉडल सेल लाइनों में रहे हैं या आरपीई को पूरे फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड के टुकड़ों / युक्तियों के बजाय जटिल लिपोफसिन मिश्रण के एक घटक को खिलाना शामिल है, जो एक अधिक पूर्ण और शारीरिक लिपोफसिन मॉडल उत्पन्न करता है। यहां वर्णित अत्यधिक विभेदित प्राथमिक मानव प्रसव पूर्व आरपीई (एचएफआरपीई) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) व्युत्पन्न आरपीई में लिपोफसिन जैसी सामग्री (जिसे अपचनीय ऑटोफ्लोरेसेंस सामग्री, या यूएएम कहा जाता है) के संचय को प्रेरित करने की एक विधि है। फागोसाइटोसिस के माध्यम से आरपीई द्वारा उठाए गए पराबैंगनी प्रकाश-उपचारित ओएस टुकड़ों के बार-बार फीडिंग द्वारा संस्कृतियों में यूएएम जमा हुआ। विवो में लिपोफस्सिन से यूएएम अनुमानित और भिन्न होने के प्रमुख तरीकों पर भी चर्चा की गई है। लिपोफससिन जैसे संचय के इस मॉडल के साथ, समवर्ती एंटीबॉडी धुंधला होने से यूएएम ग्रैन्यूल के व्यापक ऑटोफ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम को अलग करने के लिए इमेजिंग विधियां पेश की जाती हैं। अंत में, आरपीई फागोसाइटोसिस क्षमता पर यूएएम के प्रभाव का आकलन करने के लिए, बाहरी खंड के टुकड़े / टिप्स अपटेक और ब्रेकडाउन को निर्धारित करने के लिए एक नई विधि पेश की गई है। "कुल उपभोग्य क्षमता" कहा जाता है, यह विधि क्लासिक बाहरी खंड "पल्स-चेज़" परख में निहित आरपीई फागोसाइटोसिस क्षमता की संभावित गलत व्याख्याओं को दूर करती है। यहां पेश किए गए मॉडल और तकनीकों का उपयोग लिपोफसिन उत्पादन और निकासी मार्गों और कथित विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड युक्तियों या टुकड़ों के दैनिक उत्थान और गिरावट सहित फोटोरिसेप्टर के लिए महत्वपूर्ण समर्थन प्रदान करता है (इस प्रोटोकॉल के दौरान, संक्षिप्त नाम ओएस पूरे बाहरी खंडों के बजाय ओएस युक्तियों या टुकड़ों के लिए खड़ा है)। पोस्ट-माइटोटिक आरपीई में यह दैनिक उत्थान अंततः फागोलाइसोसोमल क्षमता को अधिभारित करता है और अपचनीय, ऑटोफ्लोरोसेंट इंट्रासेल्युलर सामग्री के निर्माण की ओर जाता है, जिसे लिपोफसिन कहा जाता है। दिलचस्प बात यह है कि कई अध्ययनों से यह भी पता चला है कि आरपीई लिपोफसिन ओएस फागोसाइटोसिस 1,2 के बिना जमा हो सकता है। लिपोफसिन में कई घटक होते हैं, जिनमें दृश्य चक्र रेटिनोइड्स से प्राप्त क्रॉस-लिंक्ड जोड़ शामिल हैं, और 80 3 वर्ष से अधिक आयु के लोगों के लिए आरपीई सेल वॉल्यूम के लगभग 20% पर कब्जा कर सकतेहैं।

क्या लिपोफसिन विषाक्त है, इस पर गर्म बहस हुई है। स्टारगार्ड की बीमारी फोटोरिसेप्टर और आरपीई का एक ऑटोसोमल रिसेसिव अपघटन है जिसमें एबीसीए 4 में एक उत्परिवर्तन फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों के भीतर निहित दृश्य चक्र रेटिनोइड्स के अनुचित प्रसंस्करण को ट्रिगर करता है। अनुचित रेटिनोइड प्रसंस्करण से बीआईएस-रेटिनोइड प्रजातियों के असामान्य क्रॉस-लिंकिंग और गठन की ओर जाता है, जिसमें बीआईएस-रेटिनोइड एन-रेटिनिलिडेन-एन-रेटिनिलएथेनॉलमाइन (ए 2 ई) शामिल है। अध्ययनों ने ए 2 ई विषाक्तता 4,5 के लिए कई तंत्रों का प्रदर्शन किया है। लिपोफसिन नैदानिक इमेजिंग के दौरान फंडस ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों में योगदान देता है, और स्टारगार्ड के रोगियों और पशु मॉडल दोनों रेटिना अपघटन से पहले फंडस ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि प्रदर्शित करते हैं, जो लिपोफसिन के स्तर और विषाक्तता 6,7 के बीच सहसंबंध का सुझाव देते हैं। हालांकि, उम्र के साथ, लिपोफससिन आरपीई अपघटन को ट्रिगर किए बिना सभी मनुष्यों में जमा होता है। इसके अलावा, उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) में, जहां आरपीई अपघटन केवल बुजुर्ग रोगियों में होता है, रोग के शुरुआती और मध्यवर्ती रूपों वाले लोगों में उम्र से मेल खाने वाले गैर-रोगग्रस्तमनुष्यों की तुलना में कम फंडस ऑटोफ्लोरेसेंस संकेत होते हैं। इन नैदानिक निष्कर्षों को हिस्टोलॉजिकल स्तर पर भी 9,10 तक सत्यापित किया गया है।

आरपीई लिपोफससिन संचय के पशु मॉडल ने लिपोफसिन विषाक्तता के बारे में कुछ अस्पष्टता भी छोड़ी है। एबीसीए 4 नॉकआउट माउस एक पिगमेंटेड पृष्ठभूमि पर रेटिना अपघटन प्रदर्शित नहीं करता है, जबकि यह अल्बिनो पृष्ठभूमि पर या नीली रोशनी11,12 के संपर्क में आने पर करता है। इसके अलावा, एबीसीए 4 नॉकआउट के माध्यम से प्राप्त लिपोफससिन की विषाक्तता संभवतः प्राकृतिक उम्र बढ़ने के साथ होने वाले अधिक धीरे-धीरे जमा होने वाले लिपोफसिन से भिन्न होती है, जैसा कि एएमडी13 में देखा गया है।

लिपोफससिन संचय के इन विट्रो मॉडल आरपीई स्वास्थ्य पर लिपोफसिन संचय के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प प्रदान करते हैं। इस तरह के मॉडल लिपोफसिन घटकों में हेरफेर करने की अनुमति देते हैं, एकल रेटिनोइड घटकों को खिलाने से लेकर ओएस को खिलाने तक, और पशु आरपीई के बजाय मानव में अध्ययन की अनुमति देते हैं। पिछले कुछ दशकों में, संस्कृति में आरपीई लिपोफसिन मॉडल करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। अन्य समूहों के साथ, डॉ बोल्टन के समूह ने 4 से 85 वर्ष की आयु के दाताओं से 4 से 7 मानव प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के मार्ग पर तीन महीने तक रोजाना गोजातीय ओएस खिलाया। वैकल्पिक रूप से, ऑटोफैगी के निषेध ने 3 से 7 प्राथमिक मानव आरपीई संस्कृतियों15 में लिपोफस्सिन संचय को भी जन्म दिया है। हालांकि, अत्यधिक विभेदित, मार्ग 1, प्राथमिक मानव प्रसव-पूर्व आरपीई (एचएफआरपीई) संस्कृतियों में उप-घातक लाइसोसोमल निषेध लिपोफसिन को प्रेरित करने में विफल रहा, यहां तक किदैनिक आधार पर ओएस के बार-बार जोड़ने के साथ भी।

अधिक न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण के रूप में, दूसरों ने संस्कृतियों को एकल लिपोफसिन घटकों को खिलाया है, विशेष रूप से बीआईएस-रेटिनोइड ए 2 ई 4,17। इस तरह के अध्ययन मूल्यवान हैं कि वे व्यक्तिगत लिपोफसिन घटकों के लिए विषाक्तता के संभावित प्रत्यक्ष तंत्र को परिभाषित करते हैं, उदाहरण के लिए, लाइसोसोमल कोलेस्ट्रॉल और सेरामाइड होमियोस्टेसिस18। इसी समय, ए 2 ई1 9 की विषाक्तता के बारे में बहस है, और इसे सीधे कोशिकाओं को खिलाने से लिपोफसिन संचय के लिए विशिष्ट मार्ग को दरकिनार कर दिया जाता है, जिसमें फोटोरिसेप्टर ओएस का फागोसाइटोसिस शामिल है। आरपीई संस्कृतियों में लिपोफसिन के सभी घटकों को वितरित करने के प्रयास में, बोल्टन और मार्शल ने मानव आंखों से लिपोफसिन को शुद्ध किया और भ्रूण और बुजुर्ग मानव दाताओं दोनों से प्राप्त 4 से 7 मानव प्राथमिक आरपीई संस्कृतियों को पारित करने के लिए इसे खिलाया। अभिनव होने के बावजूद, यह विधि बार-बार प्रयोगों के लिए एक सीमित लिपोफसिन स्रोत का प्रतिनिधित्व करती है।

जबकि आरपीई संस्कृतियों को ओएस के बार-बार फीडिंग कई प्रणालियों में लिपोफसिन का उत्पादन करते हैं, यह अत्यधिक विभेदित प्राथमिक आरपीईसंस्कृतियों में ऐसा करने में विफल रहता है। फोटो-ऑक्सीकरण ओएस बीआईएस-रेटिनोइड गठन जैसी क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है जो स्वाभाविक रूप से विवो में लिपोफसिन गठन के दौरान होता है। यह आरपीई संस्कृति प्रणालियों में लिपोफससिन जैसे ग्रेन्युल गठन में तेजी ला सकता है, यहां तक कि वे भी जो लिपोफसिन संचयके लिए अत्यधिक विभेदित और प्रतिरोधी हैं। यहां, अत्यधिक विभेदित एचएफआरपीई और मानव आईपीएससी-आरपीई में लिपोफसिन जैसे ग्रेन्युल संचय को प्रेरित करने की एक विधि पेश की गई है, जो विहलमार्क के प्रकाशित प्रोटोकॉल21 से संशोधित है। इस विधि में लिपोफससिन जैसे कणिकाओं को प्रेरित करने का लाभ है जो उसी स्रोत (फोटोरिसेप्टर ओएस) और मार्ग (फागोलाइसोसोमल ओएस अपटेक) को नियोजित करते हैं जैसा कि विवो में लिपोफसिनोजेनेसिस के लिए होता है। इसके अलावा, यह मानव आरपीई संस्कृतियों पर किया जाता है जो विवो 22,23,24 में मानव आरपीई को दोहराने के लिए कई अध्ययनों में अत्यधिक विभेदित और मान्य हैं। इन लिपोफससिन जैसे कणिकाओं को अपचनीय ऑटोफ्लोरोसेंट सामग्री (यूएएम) कहा जाता है, और इस प्रोटोकॉल में डेटा और चर्चा प्रदान करते हैं जो यूएएम की तुलना विवो लिपोफसिन में करते हैं। अत्यधिक विभेदित मानव आरपीई में यूएएम से भरी संस्कृतियों के निर्माण और मूल्यांकन के तरीकों के साथ, आरपीई ओएस फागोसाइटोसिस का आकलन करने के लिए एक अद्यतन विधि भी पेश की गई है। ओएस फागोसाइटोसिस को निर्धारित करने के लिए कई उत्कृष्ट पल्स-चेज़ विधियों को पेश किया गया है, जिसमें पश्चिमी सोख्ता, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और एफएसीएस25,26,27 शामिल हैं। हालांकि, ओएस पल्स-चेज़ की शुरुआत में, खराब ओएस अपटेक की ओर ले जाने वाली स्थितियों को उन स्थितियों के साथ जोड़ा जा सकता है जो आंतरिक ओएस के तेजी से क्षरण को बढ़ावा देते हैं। यहां प्रस्तुत विधि पेश किए गए ओएस की कुल मात्रा को मापती है जो आरपीई ("कुल उपभोग क्षमता") द्वारा पूरी तरह से खपत / अवक्रमित है, जिससे इस अस्पष्टता को खत्म करने में मदद मिलती है। यह अनुमान लगाया गया है कि इन प्रोटोकॉल का उपयोग करके लिपोफसिन विषाक्तता के बारे में अंतर्दृष्टि, जिसमें "कुल उपभोग्य क्षमता" विधि का उपयोग करके ओएस फागोसाइटोसिस दरों पर प्रभाव शामिल है, का उपयोग विवो में लिपोफसिन की विषाक्तता पर प्रकाश डालने के लिए किया जाएगा।

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Protocol

मानव ऊतक के अधिग्रहण और उपयोग से जुड़े वर्तमान प्रोटोकॉल की समीक्षा की गई और मिशिगन संस्थागत समीक्षा बोर्ड (एचयूएम00105486) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. फोटो-ऑक्सीकृत बाहरी खंड युक्तियों और टुकड़ों की तैयारी

नोट: अंधेरे-अनुकूलित गोजातीय रेटिना खरीदे गए और बर्फ पर भेज दिए गए ( सामग्री की तालिका देखें)। इन रेटिना से, ओएस को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल23 का पालन करते हुए शुद्ध किया गया था।

  1. यूवी लैंप के साथ बाहरी खंड क्रॉस-लिंकिंग
    1. स्लाइड्स को निष्फल करने के लिए बायोसेफ्टी कैबिनेट में 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन-लेपित स्लाइड्स ( सामग्री की तालिका देखें) को पूरी तरह से डुबोएं। स्लाइड्स को एक बाँझ 100 मिमी सेल कल्चर डिश में हवा में सूखने दें।
    2. प्रत्येक स्लाइड को एक नए 100 मिमी सेल कल्चर डिश में रखें और प्रत्येक आयत में सीरम युक्त सेल कल्चर मीडिया (जो भी मीडिया आमतौर पर आरपीई संस्कृतियों के लिए उपयोग किया जाता है) के 200 μL जोड़ें, फिर 100 मिमी सेल कल्चर डिश (बिना ढक्कन के) पर एक हैंडहेल्ड 254 एनएम यूवी लाइट (सामग्री की तालिका देखें) रखें, जिसमें बल्ब सीधे स्लाइड के सामने हो। और 20 मिनट के लिए उजागर करें। इस अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोग किए जाने वाले मीडिया और मीडिया के घटकों के लिए विशिष्ट उत्पाद संख्या पहले 22,23 प्रकाशित की गई है। इस मीडिया को इस प्रोटोकॉल में "आरपीई मीडिया" कहा जाता है।
      नोट: मीडिया का यूवी उपचार कांच की सतह को अवरुद्ध करता है और ओएस को अगले चरणों के दौरान चिपकने से रोकता है।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस (हाथ में या पानी के स्नान के माध्यम से ) पर ओएस के जमे हुए एलिकोट को पिघलाएं। आवश्यक ओएस की मात्रा आवेदन पर निर्भर करती है। सामान्य तौर पर, स्लाइड पर प्रति आयत 2 x 108 ओएस / एमएल के 500 μL तक इलाज किया जा सकता है।
    4. एक बार पिघलने के बाद, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ओएस को 2400 x g पर स्पिन करें। गोली के आकस्मिक नुकसान को रोकने के लिए वैक्यूम के बजाय एक पिपेट का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में सतह पर तैरनेवाले को तुरंत हटा दें।
    5. धीरे से बाँझ पीबीएस के साथ गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: वॉल्यूम को पुन: निलंबित और अपेक्षित एकाग्रता का ट्रैक रखें। उदाहरण के लिए, 500 μL PBS के साथ 1 x 10 8 OS/mL की 1 mL ट्यूब से गोली को निलंबित करने से 2 x 108 OS/mL प्राप्त होता है। पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन-लेपित स्लाइड पर प्रति आयत अधिकतम मात्रा और एकाग्रता 2 x 108 ओएस / एमएल के 500 μL है।
    6. स्लाइड्स से मीडिया को एस्पिरेट करें और स्लाइड के प्रत्येक आयत पर 2 x 108 ओएस / एमएल पीबीएस समाधान के 500 μL तक रखें। सेल कल्चर डिश (बिना ढक्कन के) पर हैंडहेल्ड यूवी लाइट रखें, जिसमें बल्ब सीधे ओएस के सामने हो। ओएस समाधान को 40 मिनट के लिए 254 एनएम प्रकाश में उजागर करें।
      नोट: 40 मिनट के एक्सपोजर के दौरान, यूवी लैंप को कवर करें और तौलिया या शोषक पैड के साथ डिश करें, बायोसेफ्टी कैबिनेट सैश को बंद करें, और ब्लोअर को बंद करें। यह किसी भी महत्वपूर्ण वाष्पीकरण को होने से रोक देगा। यदि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला यूवी लैंप एक शोधकर्ता के लिए उपलब्ध नहीं है, तो क्रॉस-लिंकिंग की उचित मात्रा प्राप्त करने के लिए दो विकल्प हैं। पहला चरण 1.2 में उल्लिखित मात्रात्मक यूवी एक्सपोजर का पालन करना है, या तो चरण 1.2 में उल्लिखित डिवाइस के साथ या किसी अन्य डिवाइस के साथ जो 1.2 में उक्त डिवाइस के समान मात्रात्मक उज्ज्वल एक्सपोजर प्रदान कर सकता है। एक अन्य विकल्प ओएस को यूवी विकिरण के लिए एक समय के लिए उजागर करना है जो चित्रा 1 सी में देखे गए कूमासी दाग पर क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री को प्रेरित करता है।
    7. बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में उपचारित ओएस पीबीएस समाधान एकत्र करें, लेपित स्लाइड के आयत को पीबीएस (2-3x) के 200-500 μL के साथ फिर से धोएं, और प्रत्येक धोने को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें। एक बार ऐसा करने के बाद, यह पुष्टि करने के लिए एक ऊतक संस्कृति कक्ष माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड को देखें कि स्लाइड से लगभग सभी ओएस हटा दिए गए हैं।
    8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2400 x g पर ओएस पीबीएस समाधान को स्पिन करें, एक पिपेटर के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट में पीबीएस को एस्पिरेट करें, और 500 μL मानक मीडिया में फिर से निलंबित करें जिसका उपयोग आरपीई संस्कृतियों के लिए किया जाएगा (उदाहरण के लिए - "आरपीई मीडिया" खंड 1.1.2 में परिभाषित)। वांछित फोटो-ऑक्सीकृत ओएस (ऑक्सओएस) एकाग्रता के आधार पर रीसस्पेंशन वॉल्यूम को समायोजित किया जा सकता है।
    9. एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में निलंबन के 10 μL रखें, अधिक सेल कल्चर मीडिया के साथ 50-100x पतला करें, और हेमोसाइटोमीटर के साथ ओएस की गिनती करें।
    10. ओएस गणना के आधार पर, ऑक्सओएस निलंबन को अंतिम स्टॉक एकाग्रता में पतला करें। 24-वेल ट्रांसवेल (0.33 सेमी 2 का सतह क्षेत्र; सामग्री की तालिका देखें) में अत्यधिक परिपक्व आरपीई संस्कृतियों को खिलाने के लिए,2 x 107 ओएस / एमएल की अंतिम मीडिया एकाग्रता की सिफारिश की जाती है।
      1. इसे प्राप्त करने के लिए, OxOS को मानक RPE कल्चर मीडिया में निलंबित 5.6 x 107 OS / mL एकाग्रता पर 25 μL एलिकोट में वितरित करें। 25 μL एलिकोट को पिघलाने के बाद, पूरे एलिकोट को मानक आरपीई कल्चर मीडिया के 45 μL के साथ मिलाएं, प्रत्येक OxOS ट्रांसवेल फीडिंग के लिए 70 μL की अंतिम मीडिया मात्रा और 2 x 107 OS / mL की ओएस एकाग्रता प्रदान करें।
    11. ऑक्सओएस को एलिकोट करने से पहले, फागोसाइटोसिस ब्रिजिंग लिगेंड (प्रोटीन एस और एमएफजी-ई 8, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, जो ओएस अपटेक और लिपोफसिन संचय की सुविधा प्रदान करते हैं। 24-वेल ट्रांसवेल में ब्रिजिंग लिगेंड की कामकाजी सांद्रता मानव शुद्ध प्रोटीन एस के लिए 4 μg / mL और मानव पुनः संयोजक MFG-E8 के लिए 1.5 μg / mL है। इस प्रकार, 5.6 x 107 ओएस / एमएल पर ऑक्सओएस के 25 μL एलिकोट के लिए, प्रोटीन एस के लिए स्टॉक एकाग्रता 11.2 μg / mL है, और MFG-E8 के लिए 4.2 μg / mL है।
      नोट: ब्रिजिंग लिगैंड सांद्रता को 24-वेल ट्रांसवेल पर एचएफआरपीई संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसमें प्रति 0.33 सेमी2 अच्छी तरह से 320,000 कोशिकाओं की अनुमानित सेल गिनती थी। लिगैंड सांद्रता को अन्य आरपीई प्रकारों और सेल घनत्वों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि फागोसाइटोसिस रिसेप्टर उपलब्धता से अधिक में मौजूद लिगेंड विरोधाभासी रूप से ओएस अपटेक28 को अवरुद्ध कर सकते हैं।
    12. तरल नाइट्रोजन में एलिकोट को फ्रीज करें।
      नोट: कई फ्रीज-पिघलना ओएस अखंडता के लिए अत्यधिक हानिकारक हैं।
  2. यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस के साथ बाहरी खंड क्रॉस-लिंकिंग
    नोट: नीचे दिए गए चरणों के अपवाद के साथ चरण 1.1 का पालन करें, जो क्रमशः चरण 1.1.2 और 1.1.6 को प्रतिस्थापित करते हैं:
    1. (चरण 1.1.2 को प्रतिस्थापित करता है) प्रत्येक स्लाइड को एक नए 100 मिमी सेल कल्चर डिश में रखें और प्रत्येक आयत में सीरम युक्त सेल कल्चर मीडिया (जैसे -"आरपीई मीडिया" या कोई अन्य विकल्प) के 200 μL जोड़ें, फिर एक पराबैंगनी क्रॉसलिंकर डिवाइस (सामग्री की तालिका देखें) में स्लाइड रखें, कांच की सतह को अवरुद्ध करने और अगले चरणों के दौरान ओएस को चिपकने से रोकने के लिए 3-6 जे / सेमी2 के चमकदार जोखिम पर 254 एनएम यूवी के साथ इलाज करें।
    2. (चरण 1.1.6 को प्रतिस्थापित करता है) स्लाइड्स से मीडिया को एस्पिरेट करें और स्लाइड के प्रत्येक आयत पर बाँझ पीबीएस में 2 x 108 ओएस / एमएल के 500 μL तक रखें। पराबैंगनी क्रॉसलिंकर डिवाइस में स्लाइड रखें, आवश्यकतानुसार उपचार उज्ज्वल एक्सपोजर सेट करें (3-9 जे / सेमी2), और 254 एनएम पर इलाज करें।
      नोट: आवश्यक उज्ज्वल एक्सपोजर को 3-9 जे / सेमी2 के बीच चमकदार एक्सपोजर को सावधानीपूर्वक निर्धारित किया जा सकता है जब तक कि ऑटोफ्लोरेसेंस की डिग्री, और प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग (जैसा कि चित्रा 1 बी और चित्रा 1 सी में देखा गया है) प्राप्त नहीं किया जाता है।
      सावधानी: जैव सुरक्षा कैबिनेट के बाहर ओएस को संभालने से संदूषण हो सकता है। यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस के लिए ओएस के संपर्क के बाद, बाँझ पिपेट युक्तियों के साथ ओएस एकत्र करें, बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और जैव सुरक्षा हुड में आगे के सभी चरणों को संभालें।
  3. ऑक्सीकृत ओएस का लक्षण वर्णन
    1. इमेजिंग द्वारा ऑटोफ्लोरेसेंस उत्सर्जन स्पेक्ट्रम की मात्रा निर्धारित करें
      1. अनुपचारित ओएस और ऑक्सओएस से स्टॉक समाधान के 20-50 μL को दो अलग-अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में रखें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2400 x g पर सेंट्रीफ्यूज, बफर्ड (जैसे पीबीएस) 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में गोली को फिर से निलंबित करें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए फिक्स करें।
      2. निर्धारण के बाद, ऊपर की तरह नीचे की ओर घूमें, पीबीएस एक्स 2 (वॉश के बीच घूमना) से धो लें, फिर पीबीएस के 30 μL से कम में फिर से निलंबित करें।
      3. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रीसस्पेंशन के कुछ माइक्रोलीटर रखें, माउंटिंग मीडिया जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और अंत में एक कवरस्लिप।
      4. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर छवि ऑक्सओएस ( सामग्री की तालिका देखें)।
        नोट: ऑक्सओएस ऑटोफ्लोरेसेंस को लेजर तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा उत्तेजित किया जा सकता है, लेकिन आमतौर पर 405 एनएम या 488 एनएम लेजर लाइन नियोजित होती है। उत्सर्जन समान रूप से व्यापक है, लेकिन ऑटोफ्लोरेसेंस को देखने के लिए एक विशिष्ट जीएफपी / एफआईटीसी उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर सेट-अप पर्याप्त है।
      5. ऑक्सओएस उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को मापने के लिए, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 3-स्कैनिंग का उपयोग करें। विशिष्ट स्कैन सेटिंग्स में 405 एनएम या 488 एनएम के साथ उत्तेजना शामिल है, और उत्सर्जन का पता लगाना जो लेजर उत्तेजना लाइन से लगभग 800 एनएम तक 10 एनएम रेड-शिफ्ट होता है, जिसमें 10 एनएम का चरण आकार होता है। प्रत्येक माइक्रोस्कोपी प्रणाली के अपने निर्देश होते हैं कि कैसे " मोड को नियोजित किया जाए, और पाठक को अपने विशिष्ट कन्फोकल के लिए मैनुअल का उल्लेख करने की आवश्यकता है।
    2. एक विकल्प के रूप में, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा ऑटोफ्लोरेसेंस की मात्रा निर्धारित करें।
      1. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 2 x 10 7 अनुपचारित ओएस और अलग से 2 x 107 ऑक्सओएस को नीचे घुमाएं और पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें।
        नोट: यदि फ्लो साइटोमेट्री पिघलने के बाद सीधे की जाती है तो निर्धारण की आवश्यकता नहीं होती है।
      2. अनुपचारित ओएस और ऑक्सओएस नमूने प्रवाह साइटोमीटर पर लोड करें (सामग्री की तालिका देखें)। एफएससी-एसएससी स्कैटर ग्राफ में एक स्वीकार्य प्रसार के लिए फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी) को समायोजित करें। किसी भी दूषित छोटे कणों को बाहर निकालने के लिए पीबीएस का उपयोग नियंत्रण के रूप में करें। ध्यान दें कि ओएस कोशिकाओं की तुलना में काफी छोटे हैं।
      3. ऑटोफ्लोरेसेंस परिमाणीकरण के लिए फ्लो साइटोमीटर के मानक एफआईटीसी चैनल का उपयोग करें। कम से कम 10,000 घटनाओं की गिनती करें। प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व करने के लिए एफआईटीसी हिस्टोग्राम के पल्स क्षेत्र मान का उपयोग करें।
        नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए फ्लो साइटोमीटर विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके सभी डेटा का विश्लेषण किया जाता है।
    3. OxOS में क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री का आकलन करें
      1. माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 2 x 10 7 अनुपचारित ओएस और अलग से 2 x 107 ऑक्सओएस को स्पिन करें। 1.2x Laemmli नमूना बफर जोड़कर सुपरनैटेंट और सीधे लाइज़ गोली निकालें (कवर करने के लिए पर्याप्त; सामग्री की तालिका देखें)। भंवर, 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें, 10 मिनट के लिए 12000 x g के बराबर या उससे अधिक कमरे के तापमान पर घूमें, और सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें।
        नोट: ऑक्सओएस में प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री का आकलन यूवी उपचार की पर्याप्तता की भावना देता है। अनुपचारित ओएस और ऑक्सओएस के बीच तुलना की जाती है, और पर्याप्त क्रॉस-लिंकिंग तब होती है जब मोनोमेरिक रोडोप्सिन बैंड जो कोमासी स्टेनिंग (चित्रा 1 सी, तीर) पर हावी होता है, सिर्फ बोधगम्य होता है, जिसमें उच्च क्रम के समुच्चय और जेल के शीर्ष पर एक प्रोटीन स्मीयर उभरता है।
        सावधानी: ओएस को लाइज़ करने के लिए सैंपल बफर का उपयोग करते समय, बाद में लाइसिस समाधान को गर्म न करें, क्योंकि यह रोडोप्सिन एकत्रीकरण को ट्रिगर कर सकता है। भंडारण के लिए तैयार होने तक लाइसेड ओएस को ठंडा करने से भी बचें, क्योंकि यह एसडीएस को अवक्षेपित करेगा। अप्रयुक्त लाइसेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। यदि उपचार किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि लाइसेट उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर पूरी तरह से पिघल गए हैं।
      2. एक प्रोटीन परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें जो उच्च एसडीएस और रिडक्टेंट सांद्रता29 के लिए सहिष्णु है। उपयुक्त प्रोटीन परख अभिकर्मकों पर सुझाव ों के लिए सामग्री की तालिका देखें, और इन अभिकर्मकों के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें।
      3. एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन30 द्वारा अनुपचारित ओएस और ऑक्सओएस नमूने 4% -15% ग्रेडिएंट जेल पर चलाएं, मानक ट्राइस-ग्लाइसिन एसडीएस बफर का उपयोग करें। जेल को 80 वी पर चलाया जाता है जब तक कि नमूने स्टैक में प्रवेश नहीं करते, फिर कमरे के तापमान पर 50-60 मिनट के लिए 120 वी पर।
      4. मानक प्रोटोकॉल31 का उपयोग करके जेल को कूमासी नीले रंग से दाग दें। कूमासी धुंधला यूवी उपचार द्वारा प्रेरित क्रॉस-लिंकिंग की पर्याप्तता का प्रदर्शन करेगा।

2. आरपीई संस्कृतियों में लिपोफससिन जैसे कणिकाओं (यूएएम) का निर्माण

  1. ऑक्सओएस फीडिंग: मात्रा, आवृत्ति और फागोसाइटोसिस ब्रिजिंग लिगेंड
    नोट: फीडिंग मानव आईपीएससी-आरपीई या एचएफआरपीई संस्कृतियों पर मार्ग 1 पर होती है, जो भारती लैब (आईपीएससी-आरपीई के लिए) 32 द्वारा उल्लिखित प्रोटोकॉल या एचएफआरपीई के लिए हमारे पहले उल्लिखित प्रोटोकॉल के अनुसार उगाई जाती है, जिसे शेल्डन मिलर लैब22,23 से अनुकूलित किया गया है। नीचे दी गई सभी गणना एक 24-वेल ट्रांसवेल (6.5 मिमी व्यास, 0.33 सेमी2 विकास क्षेत्र) को ऑक्सओएस या ओएस खिलाने पर आधारित हैं।
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5.6 x 107 OxOS / mL के 25 μL को पिघलाएं और OxOS एलिकोट में 45 μL सेल कल्चर मीडिया जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 70 μL की अंतिम मात्रा हो।
      नोट: चरण 1 में तैयार किए गए ऑक्सओएस एलिकोट में फागोसाइटोसिस ब्रिजिंग लिगेंड एमएफजी-ई 8 और प्रोटीन एस शामिल होंगे। हालांकि, यदि उन लिगेंड को फ्रीज-डाउन से पहले एलिकोट में नहीं जोड़ा गया था, तो उन्हें इस चरण में जोड़ा जा सकता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोशिकाओं को खिलाए जाने वाले मीडिया में लिगेंड की अंतिम एकाग्रता प्रोटीन एस के लिए 4 μg / mL और MFG-E8 के लिए 1.5 μg / mL है। जैसा कि चरण 1.1.11 में कहा गया है, ब्रिजिंग लिगेंड की सांद्रता को अन्य आरपीई प्रकारों या सेल घनत्व के लिए बदलने की आवश्यकता हो सकती है।
    2. ट्रांसवेल से एपिकल मीडिया को निकालें और एपिकल चैंबर में फागोसाइटोसिस ब्रिजिंग लिगेंड के साथ 2 x 107 ऑक्सओएस / एमएल के 70 μL जोड़ें। 24 घंटे के बाद, एक नए ऑक्सओएस फीडिंग के साथ निकालें और बदलें। फीडिंग सप्ताह के दिनों के दौरान दैनिक रूप से होती है, सप्ताहांत को छोड़ देते हुए, जब तक कि 20 फीडिंग पूरी नहीं हो जाती (~ 1 महीने)। बेसोलेटरल सेल कल्चर मीडिया (400-550 μL) 2-3x / सप्ताह बदलें।
    3. 20 फीडिंग के पूरा होने पर, कुएं के लिए सामान्य मीडिया परिवर्तन फिर से शुरू करें।
      नोट: आरपीई एपिकल सतह से चिपचिपे ऑक्सओएस को धोने के लिए कई अतिरिक्त मीडिया परिवर्तन होते हैं, इसलिए ऑक्सओएस फीडिंग समाप्त होने के कम से कम 1-2 सप्ताह बाद यूएएम से लदी संस्कृतियों के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए।
      सावधानी: ऑक्सओएस फीडिंग के माध्यम से यूएएम बिल्डअप के लिए उचित नियंत्रण होना महत्वपूर्ण है। जैसा कि दैनिक मीडिया परिवर्तन आरपीई जीव विज्ञान को प्रभावित कर सकते हैं, निम्नलिखित नियंत्रण कुओं की सिफारिश की जाती है: नियंत्रण 1: ऑक्सओएस-उपचारित समूह के समान संख्या में फीडिंग के लिए सप्ताह के दिनों के दौरान दैनिक मीडिया को बदलें। नियंत्रण 2: सप्ताह के दिनों के दौरान आरपीई अनुपचारित ओएस को ऑक्सओएस फीडिंग के समान एकाग्रता और मात्रा में रोजाना फीड करें, फीडिंग की समान संख्या के लिए।
  2. ट्रांस-एपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेसिस्टेंस (टीईआर) और सेल डेथ परख द्वारा लिपोफसिन जैसे कणिकाओं से लदी संस्कृतियों के स्वास्थ्य की निगरानी करना।
    नोट: ऑक्सओएस फीडिंग के दौरान और बाद में, आरपीई संस्कृतियों के स्वास्थ्य को आरपीई टाइट-जंक्शन अखंडता और कोशिका मृत्यु का आकलन करके मापा जा सकता है। यह पहले दिखाया गया है कि ट्रांस-एपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईआर) को मापने के माध्यम से टाइट-जंक्शन अखंडता का आकलन, सामान्य सेल स्वास्थ्यके लिए एक संवेदनशील मार्कर है। कोशिका मृत्यु के अधिक पारंपरिक गैर-इनवेसिव मार्कर, जैसे लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) की रिहाई, को भी नियोजित किया जा सकता है।
    1. TEER निष्पादित करें
      नोट: टीईआर का परीक्षण ट्रांस एपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईआर) मीटर और टीईआर इलेक्ट्रोड के साथ किया जाता है, आमतौर पर निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए ( सामग्री की तालिका देखें)।
      1. टीईआर इलेक्ट्रोड को स्टरलाइज़ करने के लिए, इलेक्ट्रोड को साफ करने के लिए 70% इथेनॉल में भिगोए गए टास्क वाइपर का उपयोग करें और फिर 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में इलेक्ट्रोड प्रोब की युक्तियों को डुबोएं।
      2. इलेक्ट्रोड को पूरी तरह से सूखने दें, फिर इलेक्ट्रोड को बाँझ मीडिया में डुबोएं।
      3. बाँझ मीडिया से जांच को हटा दें और टीईआर इलेक्ट्रोड की दो जांच ों को एक सुसंस्कृत ट्रांसवेल के एपिकल और बेसोलेटरल कक्षों में डालें; लंबी जांच टिप बेसोलेटरल कक्ष में फिट बैठती है।
        नोट: अभ्यास के बिना टीईआर इलेक्ट्रोड के साथ एपिकल चैंबर के निचले हिस्से को खुरचना आसान है, और इस तरह के स्क्रैपिंग नाटकीय रूप से टीईआर रीडिंग को बदल देगा क्योंकि कंफ्लुएंट आरपीई मोनोलेयर बाधित होता है। इस प्रकार, यह अनुशंसा की जाती है कि शुरुआती प्रयोगात्मक आरपीई संस्कृतियों पर परीक्षण से पहले गैर-महत्वपूर्ण ट्रांसवेल पर अभ्यास करें। इसके अलावा, आरपीई संस्कृतियों की प्रत्येक प्लेट का परीक्षण करने के बाद, प्रयोगकर्ता को मानक ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप के तहत आरपीई मोनोलेयर के किसी भी स्क्रैपिंग की जांच करनी चाहिए।
      4. ट्रांसवेल में एपिकल और बेसोलेटरल जांच होने के बाद, टीईआर को रिकॉर्ड करने के लिए मीटर के फुट स्विच पर रीड बटन या स्टेप दबाएं। प्लेटों या कोशिकाओं के समूहों के बीच, इलेक्ट्रोड जांच को बाँझ मीडिया से धोएं। यदि संक्रमण एक उच्च चिंता का विषय है, तो प्लेटों के बीच रिस्टरलाइज़ करें।
      5. मीटर से प्रतिरोध रीडिंग लेकर टीईआर की गणना करें, मीडिया के साथ एक रिक्त ट्रांसवेल के मूल्य को घटाएं, लेकिन कोई सेल नहीं (आमतौर पर 0.33 सेमी2 सतह क्षेत्र के साथ 24-वेल ट्रांसवेल के लिए 100-110 Ω), और फिर ट्रांसवेल के सतह क्षेत्र से गुणा करें।
        नोट: टीईआर मान सेल सतह क्षेत्र के लिए सामान्यीकृत रिपोर्ट किया जाना चाहिए। स्वस्थ एचएफआरपीई संस्कृतियों के लिए विशिष्ट मूल्य 350-1100Hcm2 से होते हैं। तापमान कम होने पर टीईआर मान बढ़ जाते हैं। इस प्रकार, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से कमरे के तापमान के हुड तक संस्कृतियों को हटाते समय, टीईआर मान प्लेट में बढ़ जाएंगे। इस परिवर्तनशीलता से बचाने के लिए, या तो जल्दी से काम करें (यदि अनुभव किया गया हो) या कमरे के तापमान के साथ प्लेट के तापमान के लिए 10-15 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    2. एलडीएच रिलीज परख का प्रदर्शन करें
      नोट: सेल कल्चर सुपरनैटेंट में एलडीएच की रिहाई सेल मृत्यु के दौरान होती है और इसे एक मानक किट के साथ मापा जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
      1. 24 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद कोशिकाओं के ऊपर से सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और मानक मीडिया का उपयोग करके 1:100 तक पतला करें।
      2. कुल संभव एलडीएच रिलीज को प्रेरित करें, जो चरण 2.2.2.1 से सभी मूल्यों को सामान्य बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, 24-वेल ट्रांसवेल में नियंत्रण कोशिकाओं से एपिकल मीडिया के 2 μL 10% ट्राइटन एक्स -100 को जोड़कर। सेल सुपरनैटेंट मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इंजेक्ट करने के बाद, अब-लाइसेड कोशिकाओं के ऊपर मीडिया मिलाएं और कुल संभावित एलडीएच रिलीज को मापने के लिए एकत्र करें।
      3. एक बार जब सतह पर तैरने वाले एकत्र हो जाते हैं, तो निर्माता मानक निर्देशों का उपयोग करके परख करें, किट के बफर समाधान का उपयोग करके 30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद ल्यूमिनेसेंस को मापें।
        नोट: सभी एलडीएच मान एलडीएच रिलीज की कुल संभावित मात्रा के लिए सामान्यीकृत हैं।
  3. लिपोफससिन जैसे ग्रेन्युल स्पेक्ट्रम और संरचना का लक्षण वर्णन।
    1. ऑटोफ्लोरेसेंस परिमाणीकरण और स्पेक्ट्रा प्राप्त करना।
      1. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% पीएफए के साथ यूएएम से भरी संस्कृतियों को ठीक करें, इसके बाद पीबीएस वॉश 5 एक्स।
      2. एपिकल चैंबर में पीबीएस की थोड़ी मात्रा रखें और फिर ट्रांसवेल को उल्टा पलट दें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके, ट्रांसवेल से अर्ध-छिद्रपूर्ण झिल्ली को काट दें, झिल्ली और ट्रांसवेल के जंक्शन पर काटने का बल लागू करें।
        नोट: इस बारे में सुसंगत रहें कि ट्रांसवेल के होंठ के कितने करीब कट बनाया गया है, क्योंकि ट्रांसवेल झिल्ली में कटौती सुसंगत नहीं होने पर ताना और झुर्री की प्रवृत्ति होती है।
      3. एक बार ट्रांसवेल झिल्ली कट जाने के बाद, तुरंत एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर फोर्सप्स का उपयोग करके रखें, कोशिकाओं के साथ ट्रांसवेल झिल्ली के कुछ हिस्सों को छूने से बचने के लिए सावधान रहें। कोशिकाओं को छूने से बचते हुए, एक टास्क वाइप के साथ अतिरिक्त पीबीएस को दूर करें। बढ़ते मीडिया और एक कवरस्लिप जोड़ें। सुनिश्चित करें कि ट्रांसवेल का कौन सा पक्ष "दाईं ओर" है, जब ट्रांसवेल को कवर किया जाता है।
      4. चरण 1.3.1.4 और चरण 1.3.1.5 के समान सेटिंग्स और प्रक्रियाओं का उपयोग करके ऑटोफ्लोरोसेंट तीव्रता और स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
        नोट: यूएएम इमेजिंग करते समय, एक महत्वपूर्ण तत्व यह है कि ऑक्सओएस ऑटोफ्लोरोसेंट होते हैं और अक्सर ऑक्सओएस फीडिंग के पूरा होने के बाद दिनों और कभी-कभी हफ्तों तक आरपीई एपिकल सतह से चिपक जाते हैं। नतीजतन, यूएएम की मात्रा निर्धारित करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए एक विधि नियोजित करने की आवश्यकता होती है कि मापा ऑटोफ्लोरेसेंस यूएएम से आ रहा है और ऑक्सओएस से नहीं। सबसे आसान तरीका एक रोडोप्सिन एंटीबॉडी के साथ लिपोफसिन संस्कृतियों को सह-दाग देना है। उदाहरण के लिए, एंटी-रोडोप्सिन एंटीबॉडी 4 डी 2 का उपयोग 1: 1000 कमजोर पड़ने पर और मानक पीएफए-निर्धारण इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल34 के साथ किया जा सकता है। रोडोप्सिन के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी एक दूर-लाल डाई-संयुग्मित एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए 647 एनएम के पास एक उत्तेजना मैक्सिमा के साथ) होना चाहिए, क्योंकि यूएएम और ऑक्सओएस ऑटोफ्लोरेसेंस इस तरंग दैर्ध्य में सबसे कमजोर होते हैं। कॉन्फोकल छवियों को तब दो चैनलों में क्रमिक रूप से प्राप्त किया जा सकता है, 405 एनएम लेजर के साथ यूएएम और ऑक्सओएस ऑटोफ्लोरेसेंस को रोमांचक और 415 एनएम से 550 एनएम तक उत्सर्जन, जबकि अवशिष्ट रोडोप्सिन, जो अनडाइजेस्टेड ऑक्सओएस का संकेत देता है, को एक अलग चैनल में मानक दूर-लाल डाई इमेजिंग मापदंडों के साथ उत्तेजित किया जा सकता है। अधिग्रहण के बाद, रोडोप्सिन चैनल का उपयोग इमेजजे जैसे प्रोग्राम में एक घटाने वाले मास्क के रूप में किया जा सकता है ताकि चिपचिपे शेष ऑक्सओएस से आने वाले ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाया जा सके, जिससे मात्रा निर्धारित करने के लिए केवल यूएएम ऑटोफ्लोरेसेंस पीछे रह जाए।
        चेतावनी: यहां तक कि ओएस जो फोटो-ऑक्सीकृत नहीं हैं, वे कुछ ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करते हैं, और कठोर धोने के साथ भी, कुछ ओएस और ऑक्सओएस आरपीई सतह से चिपक जाते हैं। इस प्रकार, रोडोप्सिन इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करके एक घटाव मास्क उत्पन्न किए बिना, जैसा कि उपरोक्त नोट में सुझाव दिया गया है, ऑक्सओ या मानक ओएस खिलाए गए संस्कृतियों में यूएएम ऑटोफ्लोरेसेंस स्तरों का सटीक परिमाणीकरण संभव नहीं है।
    2. लिपोफससिन जैसे कणिकाओं और अन्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस मार्करों का समवर्ती पता लगाएं
      नोट: जैसा कि चरण 2.3.1 में विस्तृत है, लिपोफसिन का व्यापक ऑटोफ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम प्रतिदीप्ति सह-धुंधला होने के लिए विकल्पों को सीमित करता है। सह-धुंधला करने की सुविधा के लिए निम्नलिखित तरीकों पर विचार किया जा सकता है।
      1. एक दूर-लाल फ्लोरोफोर े का उपयोग करें। लिपोफस्सिन से ऑटोफ्लोरेसेंस निकट अवरक्त में कमजोर है। इस प्रकार, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चैनल सेटिंग्स के सावधानीपूर्वक समायोजन के साथ मिलकर, रुचि के एंटीजन की प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए एक दूर-लाल डाई का उपयोग करना, आमतौर पर सह-धुंधला प्रतिदीप्ति से ऑटोफ्लोरेसेंस को अलग कर सकता है।
      2. लिपोफसिन की लंबी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पूंछ का लाभ उठाएं।
        नोट: चूंकि लिपोफससिन में बहुत व्यापक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम होता है, इसलिए इसे अक्सर कम एनएम तरंग दैर्ध्य (जैसे 405 एनएम लेजर) पर उत्तेजित किया जा सकता है और स्पेक्ट्रम के नारंगी / लाल हिस्से (जैसे 585-635 एनएम) में उत्सर्जन का अभी भी पता लगाया जा सकता है। उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का यह अनूठा संयोजन अक्सर एक अन्य सह-धुंधला फ्लोरोफोरे के आसपास तैयार किया जा सकता है।
        1. फ्लोरोफोरे का उपयोग करके रुचि के एंटीजन का पता लगाएं जिसमें 500-530 एनएम पर उत्सर्जन का पता लगाने के साथ लगभग 488 एनएम की उत्तेजना होती है। 405 एनएम उत्तेजना और 585-635 एनएम उत्सर्जन के साथ ऑटोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए एक अलग चैनल स्थापित करें। यह दूसरा चैनल केवल यूएएम का पता लगाएगा, जबकि पहला चैनल एंटीजन ऑफ इंटरेस्ट प्लस लिपोफसिन का पता लगाएगा।
        2. इमेजजे जैसे फ्री-वेयर प्रोग्राम का उपयोग करके, पहले चैनल से यूएएम सिग्नल को हटाने के लिए इस दूसरे यूएएम-केवल चैनल का उपयोग घटाव मास्क के रूप में करें (जिसमें एंटीजन सिग्नल और यूएएम सिग्नल दोनों शामिल हैं)।
      3. वर्णक्रमीय अनमिक्सिंग का उपयोग करें। अधिकांश आधुनिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में एक वर्णक्रमीय अनमिक्सिंग विकल्प होता है। यह एक नमूने के स्पेक्ट्रम को केवल यूएएम के साथ प्राप्त करने की अनुमति देता है और दूसरा नमूना केवल सह-धुंधला फ्लोरोफोरे के साथ रुचि का उपयोग करता है। प्रयोगात्मक नमूना, जिसमें यूएएम और सह-धुंधला फ्लोरोफोरे दोनों शामिल हैं, को तब अधिग्रहित किया जा सकता है और रैखिक अनमिक्सिंग विधियों के अधीन किया जा सकता है ताकि यह गणना की जा सके कि सिग्नल का कितना प्रतिशत ऑटोफ्लोरेसेंस बनाम सह-धुंधला से आया है।
        नोट: स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के लिए व्यापक गाइड सबसे आधुनिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ उपलब्ध हैं।
      4. प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग का उपयोग करें। जबकि यूएएम और सह-धुंधला फ्लोरोफोरे के बीच उत्सर्जन स्पेक्ट्रम समान हो सकता है, यह संभावना है कि उनके प्रतिदीप्ति जीवनकाल में काफी अंतर है। सामान्य तौर पर, यूएएम अधिकांश विशिष्ट फ्लोरोफोरे की तुलना में कम प्रतिदीप्ति जीवनकाल प्रदर्शित करता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप तक पहुंच के साथ जो आजीवन इमेजिंग की अनुमति देता है, कोई उन लोगों का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति संकेतों को गेट कर सकता है जो विशिष्ट लिपोफसिन जीवनकाल से अधिक लंबे हैं।
        नोट: सामान्य तौर पर, 2 एनएस से अधिक समय तक संकेतों के लिए प्रतिदीप्ति जीवनकाल को गेट करना यूएएम संदूषण को बहुत कम करता है, हालांकि यह सिग्नल को पूरी तरह से समाप्त नहीं करता है।
      5. एक ऑटोफ्लोरेसेंस सप्रेसर का उपयोग करें। परंपरागत रूप से, सूडान ब्लैक का उपयोग विशिष्ट इम्यूनोफ्लोरेसेंसस्टेनिंग 35 से पहले ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाने के लिए किया गया है। कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऑटोफ्लोरेसेंस बुझाने वाले उत्पाद सूडान ब्लैक के परिणामों में सुधार करने के लिए रिपोर्ट करते हैं, और इन उत्पादों को सामग्री की तालिका में विस्तृत किया गया है। ऑटोफ्लोरेसेंस शमन, निश्चित रूप से, लिपोफसिन का पता लगाने की क्षमता को नष्ट कर देगा।
    3. लिपोफससिन जैसे कणिकाओं की संरचना निर्धारित करें
      1. तटस्थ लिपिड का आकलन करें
        1. यूएएम से भरे आरपीई को ठीक करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 4% पीएफए में कुओं (अनुपचारित ओएस खिलाया गया) को नियंत्रित करें, और पीबीएस 5 एक्स से धो लें।
        2. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 3% बीएसए पीबीएस घोल में 10 μg / mL नाइल रेड या 3.33 μg / mL Bodipy 493/503 का उपयोग करके तटस्थ लिपिड के लिए दाग, इसके बाद 5 मिनट 3x के लिए पीबीएस के साथ धोना।
        3. चरण 2.3.1.2 और 2.3.1.3 और छवि के रूप में ट्रांसवेल को काट लें और माउंट करें। सामान्य तौर पर, इमेजिंग के लिए निम्नलिखित उत्तेजना और उत्सर्जन बैंडविड्थ का उपयोग करें: नाइल रेड - एक्स 543 एनएम, ईएम 620-700 एनएम और बोडिपी 493/503 - एक्स 488 एनएम, ईएम 500-550 एनएम।
      2. एस्टरिफाइड और अनस्टेरिफाइड कोलेस्ट्रॉल का आकलन करें
        1. चरण 2.3.3.1.1 का पालन करें
        2. फिलिपिन एक फ्लोरोसेंट डाई है जो अनस्टेरिफाइड कोलेस्ट्रॉल को पहचानता है, लेकिन एस्टरिफाइड कोलेस्ट्रॉल36 नहीं। इस प्रकार, यूएएम में कुल कोलेस्ट्रॉल (अनस्टेरिफाइड और एस्टरिफाइड) की मात्रा का आकलन करने के लिए, पहले एस्टरिफाइड कोलेस्ट्रॉल को अनस्टेरिफाइड कोलेस्ट्रॉल में बदलने के लिए कोलेस्ट्रॉल एस्टरेज़ के साथ नमूने का पूर्व-उपचार करें। 3.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.2) (सामग्री की तालिका देखें) में 20 यू / एमएल कोलेस्ट्रॉल एस्टरेज़ के साथ कोशिकाओं का इलाज करें, इसके बाद 5 मिनट 3 x के लिए पीबीएस के साथ धोएं।
        3. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस में 50 μg / mL फिलिपिन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ दाग लगाएं, और 5 मिनट 3x के लिए पीबीएस से धो लें। नमूने को कवर रखें, प्रकाश से दूर, फिलिपिन फोटोब्लीच आसानी से।
          नोट: यदि केवल अनस्टेरिफाइड कोलेस्ट्रॉल की मात्रा निर्धारित की जानी है, तो चरण 2.3.3.2.2 में कोलेस्ट्रॉल एस्टरेज़ को छोड़ा जा सकता है। यदि एस्टरिफाइड कोलेस्ट्रॉल की मात्रा निर्धारित की जानी है, तो इसे नमूने में कुल कोलेस्ट्रॉल और अनस्टेरिफाइड कोलेस्ट्रॉल के बीच अंतर से अनुमान लगाया जा सकता है।
        4. चरण 2.3.1.2 और 2.3.1.3 और छवि के रूप में ट्रांसवेल को काट लें और माउंट करें।
          नोट: फिलिपिन इमेजिंग करते समय, यह बहुत जल्दी फोटोब्लीच करता है। किसी को उत्तेजना की तीव्रता और अवधि को कम करने की आवश्यकता है, और उम्मीद है कि ओकुलर के माध्यम से नमूने को देखने के साथ कुछ फोटोब्लीचिंग भी हो सकती है। इसलिए, इमेजिंग करते समय, किसी को चाहिए: (1) फिलिपिन चैनल के अलावा एक प्रतिदीप्ति चैनल का उपयोग करके छवि बनाने के लिए एक उपयुक्त क्षेत्र की खोज करें, (2) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (प्रकाश जोखिम की तीव्रता को सीमित करने के लिए) के बजाय एक वाइडफील्ड पर फिलिपिन की छवि बनाएं, और (3) किसी क्षेत्र की बार-बार इमेजिंग से बचें। सामान्य तौर पर, इमेजिंग फिलिपिन के लिए निम्नलिखित उत्तेजना और उत्सर्जन बैंडविड्थ का उपयोग करें - एक्स 380 एनएम, ईएम 480 एनएम।

3. आरपीई फागोसाइटोसिस पर लिपोफससिन जैसे कणिकाओं के प्रभाव ों का आकलन: कुल उपभोग्य क्षमता।

नोट: नीचे दिए गए ओएस पल्स केवल प्रोटोकॉल के माध्यम से ओएस फागोसाइटोसिस को मापने का तर्क प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में विस्तृत है। विधि, जिसे "कुल उपभोग्य क्षमता" कहा जाता है, फागोसाइटोसिस दक्षता के बारे में अस्पष्टता से बचता है जो पारंपरिक ओएस पल्स-चेस फागोसाइटोसिस परख के साथ उभर सकता है। 4 x 106 ओएस / एमएल युक्त 50 μL मीडिया का उपयोग करके 24-वेल ट्रांसवेल प्लेटों पर परख की जाती है।

  1. प्रयोग के लिए आवश्यक कुओं की संख्या की गणना करें और फिर नियमित ओएस की उचित मात्रा को पिघलाएं, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 2400 x g पर स्पिन करें, और मानक आरपीई सेल कल्चर मीडिया में 4 x 106 ओएस / एमएल में पुन: निलंबित करें। फागोसाइटोसिस दरों को सुविधाजनक बनाने के लिए ब्रिजिंग लिगेंड जोड़ें।
    नोट: कोशिकाओं को खिलाए जाने के लिए मीडिया में ब्रिजिंग लिगेंड की अंतिम एकाग्रता प्रोटीन एस के लिए 4 μg / mL और MFG-E8 के लिए 1.5 μg / mL है। जैसा कि चरण 1.1.11 में कहा गया है, ब्रिजिंग लिगेंड की सांद्रता को अन्य आरपीई प्रकारों या सेल घनत्व के लिए बदलने की आवश्यकता हो सकती है।
  2. एपिकल मीडिया को हटा दें और 50 μL 4 x 106 ओएस / एमएल जोड़ें, आदर्श रूप से ब्रिजिंग लिगेंड की उचित सांद्रता के साथ।
  3. ओएस जोड़ने के बाद विभिन्न समय पर (जैसे - 0 घंटे, 1 घंटे, 4 घंटे, और 24 घंटे), कोशिकाओं और ओवरलाइंग ओएस युक्त सुपरनैटेंट दोनों को अलग करने के लिए प्रोटीज इनहिबिटर के साथ 16.67 μL 4x Laemmli नमूना बफर जोड़ें। ट्रांसवेल सतह को खरोंचने के लिए पी -200 पिपेट का उपयोग करें, सावधान रहें कि ट्रांसवेल झिल्ली को पंचर न करें या ट्रांसवेल से झिल्ली को अलग न करें, और संयुक्त सेल सुपरनैटेंट प्लस सेल लाइसेट को एक साथ इकट्ठा करें। भंवर, नीचे घूमें, और पूरी तरह से विकृतीकरण के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
    सावधानी: ओएस को निष्क्रिय करने के लिए नमूना बफर का उपयोग करने के बावजूद, बाद में लाइसिस समाधान को गर्म न करें, क्योंकि यह रोडोप्सिन एकत्रीकरण को ट्रिगर कर सकता है। भंडारण के लिए तैयार होने तक लाइसेड ओएस को ठंडा करने से भी बचें, क्योंकि इससे प्रोटीन कम हो जाएगा। -20 डिग्री सेल्सियस पर अप्रयुक्त लाइसेट को फ्रीज करें, यह सुनिश्चित करें कि लाइसेट उपयोग से पहले पूरी तरह से पिघल गए हैं।
  4. चरण 1.3.3 के समान सेटिंग्स का उपयोग करके एसडीएस पेज पर लाइसेट चलाएं, प्रति अच्छी तरह से लाइसेट की समान मात्रा लोड करें। जीएपीडीएच, β-एक्टिन, या किसी अन्य हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग सेल संख्या को सामान्य करने के लिए किया जाना चाहिए, क्योंकि फागोसाइटोसिस दर सेल नंबर पर निर्भर है।
  5. रोडोप्सिन के एन- या सी-टर्मिनस के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी धब्बों की जांच करें। मानक पश्चिमी सोख्ता स्थितियों का उपयोग करें, और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने को सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध किया गया है।
    नोट: मुख्य रोडोप्सिन बैंड के नीचे, कई रोडोप्सिन टुकड़े होंगे। ये टुकड़े आंशिक रूप से पचने वाले रोडोप्सिन का प्रतिनिधित्व करते हैं, एक प्रक्रिया जो लाइसोसोम32,33 के साथ फागोसोम के संलयन से पहले शुरू होती है। नियंत्रित आरपीई की तुलना में यूएएम-लदे आरपीई में रोडोप्सिन टुकड़ों की संख्या में वृद्धि फागोसोम-लाइसोसोम संलयन, लाइसोसोम अम्लीकरण, और / या विघटनकारी एंजाइम फ़ंक्शन 16,34,35 के स्तर पर फागोलिसोसोम क्षमता में डाउनस्ट्रीम दोष का संकेत दे सकती है।

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Representative Results

ओएस के फोटो-ऑक्सीकरण के लिए सेट-अप चित्रा 1एआई में प्रदर्शित किया गया है। पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन-लेपित स्लाइड ्स समाधान में ओएस की एक बड़ी मात्रा को शेष स्लाइड में फैले बिना प्रति खुले आयत लोड करने की अनुमति देती हैं। ओएस के साथ स्लाइड ढक्कन बंद होने के साथ एक बाँझ पेट्री डिश के भीतर निहित है, और स्लाइड पर एक यूवी लैंप रखा गया है जैसा कि चित्र 1 एआई में दिखाया गया है। वैकल्पिक रूप से, स्लाइड को यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस में रखा जा सकता है, जैसा कि चित्रा 1 ए III में दिखाया गया है। फोटो-ऑक्सीकरण के बाद, ओएस ऑटोफ्लोरेसेंस काफी बढ़ जाता है, जैसा कि माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 1 बी) दोनों द्वारा मूल्यांकन किया गया है। फोटो-ऑक्सीकरण के बाद प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग की डिग्री का मूल्यांकन एसडीएस-पेज द्वारा कोमासी दाग के साथ किया जा सकता है, जिसे प्रमुख प्रोटीन बैंड (मोनोमेरिक रोडोप्सिन) के उच्च क्रम समुच्चय और स्मीयर में रूपांतरण के रूप में दिखाया गया है (चित्रा 1 सी)। हाथ से पकड़े जाने वाले यूवी लैंप (चित्रा 1एआईआई) बनाम यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस (चित्रा 1 एiii) के साथ फोटो-ऑक्सीकरण की तुलना करने से पता चलता है कि हाथ से पकड़े जाने वाला यूवी लैंप यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस (चित्रा 1 बी) से 3 जे / सेमी 2 उपचार के रूप में अधिक ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ ऑक्सओएस का उत्पादन करता है, और यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस (चित्रा 1 सी) से 6 जे / सेमी 2 उपचार के रूप में अधिक प्रोटीन क्रॉस-लिंकिंग करता है।). यदि एक शोधकर्ता के लिए उपलब्ध यूवी लैंप इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले से भिन्न होता है, तो हम चित्रा 1 सी में यूवी लैंप लेन में देखे गए क्रॉस-लिंकिंग के स्तर को प्राप्त करने के लिए एक्सपोज़र समय को टाइट करने का सुझाव देते हैं। ओएस के प्रोटीन-पृथक अंश और ओएस16 के लिपिड-पृथक अंश दोनों में, अनुपचारित ओएस के स्पेक्ट्रम की तुलना में ऑक्सओएस का ऑटोफ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम हल्का नीला-स्थानांतरित है।

आरपीई संस्कृतियों में यूएएम बिल्डअप की मात्रा ऑक्सओएस फीडिंग (चित्रा 2 ए) की संख्या पर निर्भर करती है, और लगभग 4 सप्ताह के दौरान 20 फीडिंग यूएएम संचय की एक मजबूत मात्रा प्रदान करती है। यूएएम ऑटोफ्लोरेसेंस को अवशिष्ट ऑक्सओएस के ऑटोफ्लोरेसेंस से अलग करने के लिए, जो धोने के दिनों से हफ्तों तक आरपीई एपिकल सतह से चिपके रहते हैं, हम एक रोडोप्सिन एंटीबॉडी के साथ दाग लगाते हैं, जो दूर-लाल डाई के साथ पता लगाया जाता है। मास्क के रूप में इस रोडोप्सिन फ्लोरेसेंस चैनल का उपयोग करके, हम यूएएम चैनल से ऑक्सओएस ऑटोफ्लोरेसेंस को घटा सकते हैं, यह सुनिश्चित करते हुए कि हम वास्तव में यूएएम से ऑटोफ्लोरेसेंस को केवल16 से निर्धारित कर रहे हैं। ऊपर उल्लिखित धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, इस मॉडल में संचित यूएएम में प्रचुर मात्रा में तटस्थ लिपिड हैं, जैसा कि देशी लिपोफसिन के समान नील रेड स्टेनिंग16 द्वारा मूल्यांकन किया गया है। हालांकि, हमें कोई एस्टरिफाइड या अनस्टेरिफाइड कोलेस्ट्रॉल संचय नहीं मिलता है (चित्रा 2 बी), जो स्वस्थ आंखों से देशी लिपोफसिन में कोलेस्ट्रॉल संचय की कमी के अनुरूप है (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

लिपोफससिन ऑटोफ्लोरेसेंस के साथ समवर्ती ब्याज के फ्लोरोसेंट मार्करों का पालन करना मुश्किल है, लिपोफसिन के बहुत व्यापक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को देखते हुए। उपरोक्त विधि अनुभाग में, इस समस्या को दूर करने के लिए कई विधियाँ विस्तृत हैं। ऊपर चरण 2.3.2.1 में उल्लिखित विधि दूर-लाल में लिपोफसिन के लिए कम ऑटोफ्लोरेसेंस उत्सर्जन तीव्रता का लाभ उठाती है। चित्रा 2सीआई में, यूएएम और ऑटोफैगी मार्कर एलसी 3 के सह-स्थानीयकरण का मूल्यांकन एलसी 3 को एलेक्सा 647 डाई के साथ धुंधला करके किया जाता है। एलसी 3 चैनल में यूएएम के कुछ रक्तस्राव के बावजूद, यह स्पष्ट है कि इन छवियों में लिपोफसिन और एलसी 3 कहां स्थित हैं। ऊपर चरण 2.3.2.2 में उल्लिखित विधि में, लिपोफसिन का बहुत लंबा प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा एक उत्सर्जन चैनल के डिजाइन की अनुमति देता है जिसमें केवल लिपोफसिन से प्रतिदीप्ति होती है। चित्रा 2सीआई में, यूएएम 488 एनएम लेजर के साथ उत्साहित है, जबकि उत्सर्जन 500-535 एनएम और 600-645 एनएम दोनों पर पाया जाता है। नमूना एलसी 3 के साथ सह-सना हुआ है, एलेक्सा 488 डाई के साथ पता लगाया गया है। एलेक्सा 488 चैनल (उत्तेजना: 488 एनएम, उत्सर्जन: 500-535 एनएम) में एलसी 3 और यूएएम सिग्नल दोनों शामिल हैं। हालांकि, 488 एनएम उत्तेजना और 600-645 एनएम उत्सर्जन के साथ दूसरे चैनल में केवल यूएएम होता है। इस दूसरे चैनल का उपयोग मास्क के रूप में किया जा सकता है, जिसे एलेक्सा 488/एलसी 3 चैनल पर लागू किया जाता है, ताकि एलसी 3 सिग्नल से अवांछित यूएएम सिग्नल को घटाया जा सके। ऊपर चरण 2.3.2.4 में उल्लिखित विधि में, ऑटोफ्लोरोसेंट लिपोफससिन का छोटा प्रतिदीप्ति जीवनकाल किसी को सह-धुंधला प्रतिदीप्ति से लिपोफससिन को अलग करने की अनुमति देता है। चित्रा 2Ciii में, 2 ns से पहले फोटॉन-काउंटिंग डिटेक्टर तक पहुंचने वाले सभी प्रतिदीप्ति संकेतों को समाप्त कर दिया जाता है, जो LC3 से सह-धुंधला संकेत को बड़े पैमाने पर संरक्षित करते हुए UAM ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल के अधिकांश हिस्से को बंद कर देता है। लिपोफससिन को सह-धुंधला प्रतिदीप्ति से अलग करने के लिए तरीकों का एक संयोजन आवश्यक हो सकता है यदि लिपोफससिन और सह-धुंधला फ्लोरोफोरे का मजबूत सह-स्थानीयकरण होता है।

जैसा कि कई अध्ययनों ने ओएस फागोसाइटोसिस दर 5,36,37,38,39 पर आरपीई लिपोफससिन संचय के प्रभाव को माना है, यूएएम से भरी संस्कृतियों में ओएस फागोसाइटोसिस क्षमता का आकलन किया गया था। विशिष्ट फागोसाइटोसिस परख में ओएस ("पल्स") के साथ कोशिकाओं की एक संक्षिप्त इनक्यूबेशन शामिल होती है, जिसके बाद अनबाउंड ओएस का वॉश-ऑफ और "पीछा" अवधि के लिए ओएस के बिना मीडिया का प्रतिस्थापन होता है। पीछा करने के दौरान, जैसा कि ओएस को नीचा दिखाया जाता है, आरपीई के भीतर ओएस में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन रोडोप्सिन का नुकसान होता है। पीछा करने के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर, ओएस-मुक्त मीडिया को हटा दिया जाता है, इसके बाद आरपीई लाइसेट के भीतर शेष रोडोप्सिन के लिए सेल लाइसिस और एसडीएस-पेज होता है। हालांकि, चूंकि ओएस पल्स अवधि में ओएस के उत्थान और गिरावट दोनों शामिल हैं, उच्च उत्थान और गिरावट ("फागोसाइटोसिस कुशल" कोशिकाओं) के साथ आरपीई में पीछा अवधि में कम उत्थान और गिरावट ("फागोसाइटोसिस अक्षम" कोशिकाओं) के साथ आरपीई के समान रोडोप्सिन स्तर हो सकते हैं। झांग एट अल23 द्वारा अध्ययन में इसे योजनाबद्ध रूप से दर्शाया गया है। इस अस्पष्टता को दूर करने के लिए, यहां एक "पल्स-ओनली" परख नियोजित की गई थी। इस विधि में, ओएस को आरपीई पर स्पंदित किया जाता है लेकिन धोया नहीं जाता है। ओएस जोड़ने के बाद विभिन्न समय पर, मीडिया और सेल लाइसेट को एक साथ एकत्र किया जाता है। मीडिया में अनपचा हुआ ओएस होता है और सेल लाइसेट में सेल की सतह पर बरकरार ओएस का एक संयोजन होता है, आंशिक रूप से पचने वाला ओएस जिसे आंतरिक रूप दिया गया है, और पूरी तरह से पचने वाला ओएस है जिसने इसे लाइसोसोम के माध्यम से सफलतापूर्वक बनाया है। एक नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं को ओएस के संपर्क में लाया जाता है लेकिन फिर सेल लाइसेट और ओएस युक्त सुपरनैटेंट तुरंत एकत्र किए जाते हैं। इस नियंत्रण से पता चलता है कि कोशिकाओं में कुल रोडोप्सिन कितना पेश किया गया था। चूंकि ओएस परिचय के बाद विभिन्न बिंदुओं पर लाइसेट प्लस सुपरनैटेंट एकत्र किया जाता है, इसलिए कोई यह आकलन कर सकता है कि कुल रोडोप्सिन सिग्नल का कितना अंश गायब हो गया है, इसे सभी पेश किए गए / शुरुआती ओएस की मात्रा के लिए मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है जो अब पूरी तरह से खराब हो गए हैं। इस परख के लिए रीडआउट को "कुल उपभोग्य क्षमता" कहा जाता है, क्योंकि यह सभी ओएस गिरावट को सटीक रूप से मापता है और ऊपर वर्णित पल्स-चेज़ प्रयोग की भ्रामक व्याख्याओं के अधीन नहीं है।

चित्रा 3 ए और पूरक चित्रा 1 कुल उपभोग्य क्षमता परख का उपयोग करके शेष रोडोप्सिन के पश्चिमी धब्बे को प्रदर्शित करते हैं। कोशिकाओं को खिलाए गए ओएस की मात्रा को 0 एच पर रोडोप्सिन बैंड द्वारा मापा जाता है। मुख्य रोडोप्सिन बैंड को नियंत्रण और यूएएम से लदे आरपीई नमूनों (4 घंटे और 24 घंटे पर एकल तीर) के बीच समान दक्षता के साथ नीचा दिखाया जाता है। हालांकि, रोडोप्सिन के आंशिक रूप से अवक्रमित टुकड़ों को देखते समय समूहों के बीच अंतर होता है, जो मुख्य रोडोप्सिन बैंड के नीचे दिखाई देते हैं। टुकड़े की बहुतायत में अंतर यूएएम समूह में लाइसोसोमल क्षमता को कम करता है, क्योंकि रोडोप्सिन के प्रोटियोलिटिक रूप से क्लीवर किए गए टुकड़ों को सामान्य लाइसोसोमल फ़ंक्शन के साथ तेजी से नीचा दिखाया जाना चाहिए। मुख्य रोडोप्सिन टुकड़े की बढ़ी हुई बहुतायत के बिना इन टुकड़ों की बढ़ी हुई बहुतायत यूएएम से लदी संस्कृतियों में लाइसोसोमल डिग्रेडेटिव क्षमता में अधिक सूक्ष्म दोषों का सुझाव देती है। पूर्व अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि लिपोफससिन वास्तव में ओएस फागोसाइटोसिस44 में दोषों को प्रेरित कर सकता है, लेकिन किसी भी पूर्व अध्ययन ने विशेष रूप से रोडोप्सिन टुकड़ों पर लिपोफसिन के प्रभावों की जांच नहीं की है, जो फागोलाइसोसोमल गिरावट के अंतिम चरणों में शिथिलता के अधिक सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। चित्रा 3 बी दो अलग-अलग एंटी-रोडोप्सिन एंटीबॉडी का उपयोग करके मुख्य रोडोप्सिन बैंड प्लस रोडोप्सिन टुकड़ों के पश्चिमी सोख्ता को दर्शाता है। एंटीबॉडी 4 डी 2 रोडोप्सिन के एन-टर्मिनस को पहचानता है, और एन-टर्मिनल टुकड़े लाइसोसोम में अवक्रमित होने वाले रोडोप्सिन का अंतिम हिस्सा हैं। इसके विपरीत, एंटीबॉडी 1 डी 4 रोडोप्सिन के सी-टर्मिनस को पहचानता है, जो फागोसोम-लाइसोसोम संलयन से पहले भी खराब हो जाता है। इस प्रकार, यह समझना कि कौन से टुकड़े किस एंटीबॉडी के साथ दाग देते हैं, रोडोप्सिन प्रसंस्करण दोषों की भावना प्रदान करता है जो पूर्व-लाइसोसोमल बनाम लाइसोसोमल 32,40,41 हैं।

Figure 1
चित्रा 1: फोटो-ऑक्सीकृत बाहरी खंड (ऑक्सओएस) उपचार और लक्षण वर्णन। (ए) पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन-लेपित स्लाइड पर ओएस का चित्रण (i) 254 एनएम यूवी हैंडहेल्ड लैंप (ii) या यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस (iii) के साथ इलाज किया जाता है। (बी) अनुपचारित (नियमित) ओएस (रेगोएस) की तुलना में, उपचारित ओएस (ऑक्सओएस) में ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि हुई थी जैसा कि कॉन्फोकल इमेजिंग (बाएं) (स्केल बार = 10 μm) और फ्लो साइटोमेट्री (दाएं) द्वारा दिखाया गया है। हैंडहेल्ड यूवी लैंप के साथ इलाज किए गए ऑक्सओएस की ऑटोफ्लोरोसेंट तीव्रता 3 जे / सेमी2 (त्रुटि बार = एसईएम) के चमकदार जोखिम पर यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस के साथ इलाज किए गए ओएस के समान थी। (ग) एसडीएस-पेज यूवी एक्सपोजर द्वारा प्रेरित ओएस प्रोटीन के क्रॉसलिंकिंग का प्रदर्शन करता है। हैंडहेल्ड यूवी लैंप के माध्यम से ऑक्सओएस क्रॉसलिंकिंग 6 जे / सेमी 2 के चमकदार जोखिम पर यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस के साथ इलाज किए गए ओएस के समान था। मोनोमेरिक रोडोप्सिन को एक तीर के साथ हाइलाइट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एचएफआरपीई संस्कृतियों में इमेजिंग ऑक्सओएस-प्रेरित लिपोफससिन जैसे कणिकाएं। (ए) ऑक्सओएस द्वारा प्रेरित ऑटोफ्लोरोसेंट ग्रैन्यूल (हरा) 5 फीडिंग की तुलना में 20 फीडिंग के बाद काफी अधिक जमा हुआ। रोडोप्सिन एंटीबॉडी (मैजेंटा) के साथ अवशिष्ट ऑक्सओएस दाग। स्केल बार = 10 μm. (B) OxOS (हरा) द्वारा प्रेरित UAM मुक्त कोलेस्ट्रॉल या कोलेस्ट्रॉल एस्टर से समृद्ध नहीं था, जैसा कि फिलिपिन स्टेनिंग ( लाल) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। ( सी) लिपोफसिन की उपस्थिति में प्रतिदीप्ति सह-धुंधला होने के लिए इमेजिंग विधियां। (i ) ऑटोफैगी मार्कर एलसी3 (मैजेंटा) पर दाग लगाने के लिए दूर-लाल फ्लोरोफोरे (एलेक्सा 647) का प्रयोग, जो यूएएम रक्तस्राव को कम करता है। शुद्ध यूएएम (हरा) एक मानक हरे चैनल उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर सेट-अप के साथ चित्रित किया गया है। स्केल बार = 2 μm. (ii) अनुपातमेट्रिक इमेजिंग का उपयोग एलेक्सा 488 के साथ लेबल किए गए एलसी 3 धुंधला से यूएएम ऑटोफ्लोरेसेंस को समझने में मदद करता है। उत्तेजना 488 एनएम है, ग्रीन चैनल उत्सर्जन बैंडपास 500-535 एनएम है जबकि लाल चैनल उत्सर्जन बैंडपास 600-645 एनएम है। हरे चैनल से एलसी 3 सिग्नल को अलग करने के लिए लाल चैनल को घटाने वाले मास्क के रूप में लागू किया जा सकता है। स्केल बार = 5 μm. (iii) चूंकि लिपोफससिन/यूएएम का प्रतिदीप्ति जीवनकाल आमतौर पर विशिष्ट रंगों की तुलना में कम होता है, इसलिए यूएएम ऑटोफ्लोरेसेंस को 2 एनएस से भी कम समय में फोटॉन-काउंटिंग डिटेक्टर पर पहुंचने वाले फ्लोरेसेंस संकेतों को बाहर निकालकर कम किया जा सकता है। शीर्ष छवि गेटिंग के बिना है। नीचे की छवि गेटिंग के साथ है, जिसमें केवल प्रतिदीप्ति संकेत 2 एनएस से अधिक जीवनकाल के साथ हैं। शीर्ष और नीचे की छवियों के बीच विशिष्ट एलसी 3 सिग्नल (एलेक्सा 488 के साथ लेबल) की तुलना में यूएएम सिग्नल में अधिक सापेक्ष कमी है। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ओएस फागोसाइटोसिस को मापने के लिए "कुल उपभोग्य क्षमता" विधि। (ए) आरपीई संस्कृति में ओएस की शुरूआत के बाद सेल लाइसेट और सुपरनैटेंट दोनों में कुल शेष रोडोप्सिन प्रोटीन, जैसा कि पश्चिमी ब्लॉट द्वारा परख किया गया है। 50 μL मीडिया में नियमित ओएस खिलाने के बाद, वातानुकूलित मीडिया / सुपरनैटेंट और कोशिकाओं दोनों को 0, 4 और 24 घंटे पर एक साथ मिलाया गया था। 0 एच टाइमपॉइंट एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, जो प्रत्येक ट्रांसवेल को खिलाए गए ओएस की कुल मात्रा को दर्शाता है। बरकरार रोडोप्सिन बैंड (एकल तीर) नियंत्रण और यूएएम से लदे आरपीई कोशिकाओं के बीच अलग नहीं था, जो आरपीई फागोसाइटोसिस पर यूएएम का कोई बड़ा प्रभाव नहीं बताता है। हालांकि, डबल तीर द्वारा इंगित रोडोप्सिन के दरार उत्पाद, यूएएम समूह में अधिक थे, जो फागोलाइसोसोमल प्रणाली में कुछ हल्के विघटनकारी शिथिलता का सुझाव देते हैं। जीएपीडीएच के समान स्तर से संकेत मिलता है कि कुओं के बीच सेल गिनती, जो फागोसाइटोसिस दरों को प्रभावित कर सकती है, बराबर थी। (बी) विभिन्न रोडोप्सिन एंटीबॉडी विभिन्न गिरावट टुकड़ों को पहचानते हैं। 4 डी 2 रोडोप्सिन के एन-टर्मिनस को पहचानता है, जो लाइसोसोमल गिरावट के अंतिम चरणों तक बरकरार है। जिन टुकड़ों को यह पहचानता है वे इसलिए छोटे (डबल तीर) हैं। इसके विपरीत, 1 डी 4 रोडोप्सिन के सी-टर्मिनस को पहचानता है, जो फागोलाइसोसोमल प्रक्रिया में पहले नीचा हो जाता है। इसलिए यह एंटीबॉडी एक उच्च आणविक भार (डबल तीर) के रोडोप्सिन टुकड़ों को पहचानता है। दोनों एंटीबॉडी बरकरार रोडोप्सिन (एकल तीर) को पहचानते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्र 1: चित्रा 3 ए के अनुरूप असंपादित धब्बा। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जबकि आरपीई लिपोफसिन का दशकों से अध्ययन किया गया है, इसकी विषाक्तता पर 2,9,16,42 बहस की जाती है। पशु मॉडल11 से लिपोफसिन की विषाक्तता के बारे में अस्पष्टता को देखते हुए, मानव आरपीई का उपयोग करने वाले इन विट्रो मॉडल मूल्यवान हैं। इन विट्रो लिपोफसिन संचय मॉडल की एक श्रृंखला का वर्णन किया गया है, लेकिन किसी ने भी ओएस फीडिंग और अत्यधिक परिपक्व और विभेदित मानव आरपीई संस्कृतियों दोनों का उपयोग नहीं किया है। यह संयोजन एक आदर्श मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, क्योंकि ओएस फीडिंग विवो में लिपोफसिन संचय के लिए विधि को पुन: प्रस्तुत करता है और अत्यधिक परिपक्व मानव आरपीई संस्कृतियां विवो में आरपीई व्यवहार को सबसे अच्छी तरह से दोहराती हैं। दिलचस्प बात यह है कि अत्यधिक विभेदित एचएफआरपीई संस्कृतियों का उपयोग करते समय, यह पाया गया कि नियमित ओएस एक्सपोजर लिपोफसिन जैसी सामग्री को प्रेरित करने के लिए अपर्याप्त था, यहां तक कि बार-बार फीडिंगके बाद भी। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल एक नियंत्रित फैशन में फोटो-ऑक्सीकरण ओएस (ऑक्सओएस) द्वारा लिपोफससिन संचय प्रक्रिया को तेज करता है। मानव आईपीएससी-आरपीई और एचएफआरपीई संस्कृतियों दोनों को ऑक्सओएस खिलाने से लिपोफसिन जैसे कणिकाओं का मजबूत संचय हुआ, जिसे अपचनीय ऑटोफ्लोरोसेंट सामग्री (यूएएम) कहा जाता है। यूएएम संचय संस्कृति प्रणालियों में लिपोफसिन के मॉडलिंग की अनुमति देता है जो विवो 22,23,29,43,44 में स्वस्थ मानव आरपीई की नकल करता है। एक पूर्व प्रकाशन और इस अध्ययन दोनों में, स्वस्थ पुराने वयस्कों से देशी लिपोफसिन की तुलना में यूएएम का व्यापक लक्षण वर्णन समानता और अंतर दोनों को दर्शाता है। यूएएम विवो में लिपोफस्सिन की अल्ट्रास्ट्रक्चर की नकल करता है, जिसमें मेलेनोलिपोफसिन16 बनाने के लिए मेलेनिन ग्रैन्यूल के साथ फ्यूज करने के लिए लिपोफसिन ग्रैन्यूल की प्रवृत्ति शामिल है। यूएएम और लिपोफसिन दोनों में पर्याप्त तटस्थ लिपिड, कोई रोडोप्सिन नहीं है, और कोलेस्ट्रॉल में कोई महत्वपूर्ण संवर्धन नहीं है (चित्रा 2 ए, बी हमारे पूर्व प्रकाशन16, चित्रा 2 ए, बी ऊपर, और अप्रकाशित डेटा से)। हमने देशी लिपोफससिन ग्रेन्युल आकार और स्पेक्ट्रम की तुलना यूएएम से की (हमारे पूर्व प्रकाशन16 से चित्रा 3)। यूएएम ग्रैन्यूल शुरू में देशी लिपोफसिन की तुलना में थोड़ा बड़ा और नीला-स्थानांतरित होता है, लेकिन संस्कृति में महत्वपूर्ण अवधि के साथ, यूएएम कॉम्पैक्ट उनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में एक छोटे आकार और लाल-बदलाव के लिए कॉम्पैक्ट होता है, जो देशी लिपोफसिन के आकार और स्पेक्ट्रा प्रोफाइल के समान हो जाता है।

ऑक्सओएस यूएएम मॉडल का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया गया है, जिसमें लिपोफसिन ग्रैन्यूल50 को रोकने और हटाने पर ऑटोफैगी इंड्यूसर के प्रभाव और आरपीई ध्रुवीयता और चयापचय पर लिपोफसिन के प्रभावशामिल हैं। इसके अलावा, इन कणिकाओं को एक वर्ष से अधिक समय तक सुसंस्कृत आरपीई में बने रहने के लिए दिखाया गया है, जिससे लंबे समय तक लिपोफसिन स्पेक्ट्रा, आकृति विज्ञान और व्यवहार के विकास का अध्ययन किया जा सकताहै। मॉडल के अन्य अनुप्रयोगों में पूरक सक्रियण51, लाइसोसोमल स्थिरता और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं 52 और माइटोकॉन्ड्रियल समझौता53 पर लिपोफसिन संचय का अध्ययन शामिल है।

इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, आरपीई संस्कृतियों को अत्यधिक विभेदित और परिपक्व होना चाहिए। ऑक्सओएस फीडिंग केवल तभी शुरू होनी चाहिए जब आरपीई कम से कम 8 सप्ताह तक ट्रांसवेल पर रहा हो और अत्यधिक परिपक्व आरपीई की सभी विशेषताओं को प्राप्त किया हो (5 'पी को फिनमैन एट अल द्वारा विस्तृत किया गया है - आकृति विज्ञान में बहुभुज, पोस्टमाइटोटिक, पिगमेंटेड, ध्रुवीकृत, और फागोसाइटिक54)। दूसरा, ओएस अत्यधिक नाजुक हैं और पाइपिंग के दौरान देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। अंत में, कुल यूवी फ्लक्स एक्सपोजर के लिए ओएस का अनुपात महत्वपूर्ण है जो बरकरार रहता है लेकिन फिर भी यूएएम को प्रेरित कर सकता है; इस प्रोटोकॉल में इस अनुपात को परिष्कृत किया गया है। ओएस की एक निश्चित संख्या के लिए बहुत अधिक यूवी प्रकाश अत्यधिक क्रॉस-लिंकिंग का कारण बनता है और ओएस में महत्वपूर्ण रासायनिक संरचनाओं को नष्ट कर देता है। ओएस की दी गई संख्या के लिए बहुत कम यूवी प्रकाश संस्कृति में यूएएम को प्रेरित करने में विफल रहेगा।

प्रोटोकॉल में संशोधन में बड़े पैमाने पर ऑक्सओएस फीडिंग अवधि या एकाग्रता को बदलना शामिल है। अनुभवजन्य रूप से, लगभग 4 सप्ताह के दौरान 20 फीडिंग यूएएम संचय की एक मजबूत मात्रा पैदा करती है। इससे अधिक फीडिंग से यूएएम संचय में वृद्धि हो सकती है, जबकि कम फीडिंग से केवल छिटपुट यूएएम संचय होने की संभावना है। प्रयोग और प्रयोगकर्ता के उद्देश्य, जरूरतों और संसाधनों के आधार पर फीडिंग की संख्या को समायोजित किया जा सकता है। कम विभेदित आरपीई संस्कृतियों (उच्च मार्ग संख्या, सेल लाइनों, या उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण गुणों का प्रदर्शन करने वाली संस्कृतियों) में, मजबूत यूएएम प्रेरण के लिए कम फीडिंग और कम ऑक्सओएस सांद्रता की आवश्यकता होती है।

प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं। ओएस के फोटो-ऑक्सीकरण के लिए एक हैंडहेल्ड यूवी लैंप का उपयोग ओएस को दिए गए कुल चमकदार जोखिम की सटीक मात्रा को रोकता है। हालांकि, हाथ से पकड़े जाने वाले लैंप का उपयोग करके ओएस के फोटो-ऑक्सीकरण को इस अध्ययन में चित्र 1 में बहुत अधिक महंगे (लेकिन मात्रात्मक) यूवी क्रॉसलिंकर डिवाइस से सहसंबद्ध किया गया था ताकि उज्ज्वल जोखिम के लिए पैरामीटर प्रदान करने में मदद मिल सके। यह अनुशंसा की जाती है कि प्रयोगकर्ता यूवी एक्सपोजर की अवधि को बदल दें जब तक कि क्रॉस-लिंकिंग / रोडोप्सिन स्मीयरिंग पैटर्न चित्रा 1 सी में पश्चिमी धब्बा के यूवी लैंप कॉलम में देखे गए नकल न करे।

विधि की एक दूसरी सीमा यह है कि इसमें विवो में लिपोफससिन संचय की कई विशेषताओं का अभाव है। दरअसल, इस प्रोटोकॉल के दौरान, लिपोफसिन जैसे कणिकाओं को इस भेद को स्पष्ट करने के लिए अपचनीय ऑटोफ्लोरोसेंट सामग्री (यूएएम) के रूप में संदर्भित किया जाता है। फोटो-ऑक्सीकरण ओएस रोग राज्यों में फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों में होने वाले कुछ प्राकृतिक रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग को पुन: प्रस्तुत करता है, लेकिन यूएएम मॉडल में क्रॉस-लिंकिंग बहुत तेज और संभवतः अधिक गैर-विशिष्ट है। इसके अलावा, लगभग एक महीने के ऑक्सओएस फीडिंग के बावजूद, यूएएम मॉडल अभी भी लिपोफसिन-उत्प्रेरण ओएस के लिए "तीव्र" जोखिम का प्रतिनिधित्व करता है, जो मनुष्यों में लिपोफसिन जमा होने में लगने वाले दशकों की तुलना में है। संस्कृति में अधिक लंबे समय तक लिपोफससिन संचय के साथ, कम फेनोटाइपिक प्रभाव हो सकते हैं। फिर भी, क्योंकि यूएएम ग्रैन्यूल यहां प्रस्तुत संस्कृति प्रणाली में एक वर्ष से अधिक समय तक बने रहते हैं, इसलिए आरपीई स्वास्थ्यपर उनके दीर्घकालिक प्रभावों का अध्ययन करने का अवसर है।

आरपीई फागोसाइटोसिस क्षमता का आकलन करने के लिए यहां प्रस्तुत "कुल उपभोग्य क्षमता" विधि की एक सीमा यह है कि यह यह भेद करने में विफल रहता है कि फागोसाइटोसिस दोष ओएस बाइंडिंग बनाम अपटेक बनाम गिरावट के कारण हो सकता है या नहीं। दरअसल, जब फागोसाइटोसिस परख का लक्ष्य फागोसाइटोसिस प्रक्रिया के विशिष्ट चरणों की शिथिलता में यांत्रिक अंतर्दृष्टि है, तो पारंपरिक ओएस पल्स-चेज़ परख अधिक उपयुक्त हैं। "कुल उपभोग्य क्षमता" का माप नियोजित किया जाना चाहिए जब लक्ष्य केवल नियंत्रण बनाम प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत आरपीई संस्कृति की ओएस फागोसाइटोसिस क्षमता को स्पष्ट रूप से मापना है।

निष्कर्ष में, अत्यधिक विभेदित मानव आरपीई संस्कृतियों में लिपोफसिन जैसे ग्रेन्युल संचय के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह विधि लिपोफससिन संचय के लिए शारीरिक प्रक्रिया को विलय करती है - फोटो-ऑक्सीकृत ओएस के बार-बार फीडिंग - आरपीई संस्कृति मॉडल के साथ जो विवो में मानव आरपीई को दृढ़ता से पुन: उत्पन्न करने के लिए बार-बार अध्ययनों में दिखाए गए हैं । लिपोफससिन जैसे कणिकाओं से लदी परिणामी संस्कृतियों का उपयोग असंख्य अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें आरपीई जीव विज्ञान पर लिपोफसिन प्रभावों के आकलन से लेकर छोटे अणुओं, जीन ों और सिग्नलिंग मार्गों के परीक्षण शामिल हैं जो लिपोफसिन संचय को संशोधित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम विट्रियो-रेटिना सर्जरी फाउंडेशन (वीआरएसएफ), फाइट फॉर साइट (एफएफएस), और इंटरनेशनल रेटिना रिसर्च फाउंडेशन (आईआरआरएफ) से अनुदान द्वारा समर्थित है। जे.एम.एल.एम. वर्तमान में राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (EY033420) से K08 अनुदान द्वारा समर्थित है। एचएफटी अनुसंधान के लिए कोई संघीय धन का उपयोग नहीं किया गया था। आगे का समर्थन ड्राई एएमडी के लिए जेम्स ग्रोसफेल्ड पहल और निम्नलिखित निजी दाताओं से आता है: बारबरा डन और डी एंड डिक्सन ब्राउन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

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References

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जीव विज्ञान अंक 194 लिपोफसिन रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड युक्तियां या टुकड़े (ओएस) फागोसाइटोसिस स्टारगार्ड की बीमारी उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) अपचनीय ऑटोफ्लोरेसेंस सामग्री (यूएएम)।
अत्यधिक ध्रुवीकृत मानव रेटिना वर्णक उपकला संस्कृतियों में बेहतर लिपोफसिन मॉडल और बाहरी खंड फागोसाइटोसिस क्षमता का परिमाणीकरण
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Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

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