अत्यधिक ध्रुवीकृत मानव रेटिना वर्णक उपकला संस्कृतियों में बेहतर लिपोफसिन मॉडल और बाहरी खंड फागोसाइटोसिस क्षमता का परिमाणीकरण
Summary
यह प्रोटोकॉल अत्यधिक विभेदित और ध्रुवीकृत मानव रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) संस्कृतियों में एक लिपोफससिन संचय मॉडल और आरपीई की कुल ओएस खपत / गिरावट क्षमता का पता लगाने के लिए एक बेहतर बाहरी खंड (ओएस) फागोसाइटोसिस परख का वर्णन करता है। ये विधियां पिछले लिपोफसिन मॉडल और शास्त्रीय पल्स-चेज़ बाहरी खंड फागोसाइटोसिस परख की सीमाओं को दूर करती हैं।
Abstract
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) द्वारा फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों का दैनिक फागोसाइटोसिस एक इंट्रासेल्युलर उम्र बढ़ने वाले वर्णक के संचय में योगदान देता है जिसे लिपोफसिन कहा जाता है। लिपोफस्सिन की विषाक्तता स्टार्गर्ड की बीमारी में अच्छी तरह से स्थापित है, सबसे आम विरासत में मिली रेटिना अपघटन, लेकिन उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) में अधिक विवादास्पद है, जो विकसित दुनिया में अपरिवर्तनीय अंधापन का प्रमुख कारण है। मनुष्यों में लिपोफससिन विषाक्तता का निर्धारण करना मुश्किल रहा है, और स्टारगार्ड के पशु मॉडल में सीमित विषाक्तता है। इस प्रकार, इन विट्रो मॉडल जो विवो में मानव आरपीई की नकल करते हैं, लिपोफसिन उत्पादन, निकासी और विषाक्तता को बेहतर ढंग से समझने के लिए आवश्यक हैं। आज तक अधिकांश सेल कल्चर लिपोफसिन मॉडल सेल लाइनों में रहे हैं या आरपीई को पूरे फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड के टुकड़ों / युक्तियों के बजाय जटिल लिपोफसिन मिश्रण के एक घटक को खिलाना शामिल है, जो एक अधिक पूर्ण और शारीरिक लिपोफसिन मॉडल उत्पन्न करता है। यहां वर्णित अत्यधिक विभेदित प्राथमिक मानव प्रसव पूर्व आरपीई (एचएफआरपीई) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) व्युत्पन्न आरपीई में लिपोफसिन जैसी सामग्री (जिसे अपचनीय ऑटोफ्लोरेसेंस सामग्री, या यूएएम कहा जाता है) के संचय को प्रेरित करने की एक विधि है। फागोसाइटोसिस के माध्यम से आरपीई द्वारा उठाए गए पराबैंगनी प्रकाश-उपचारित ओएस टुकड़ों के बार-बार फीडिंग द्वारा संस्कृतियों में यूएएम जमा हुआ। विवो में लिपोफस्सिन से यूएएम अनुमानित और भिन्न होने के प्रमुख तरीकों पर भी चर्चा की गई है। लिपोफससिन जैसे संचय के इस मॉडल के साथ, समवर्ती एंटीबॉडी धुंधला होने से यूएएम ग्रैन्यूल के व्यापक ऑटोफ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम को अलग करने के लिए इमेजिंग विधियां पेश की जाती हैं। अंत में, आरपीई फागोसाइटोसिस क्षमता पर यूएएम के प्रभाव का आकलन करने के लिए, बाहरी खंड के टुकड़े / टिप्स अपटेक और ब्रेकडाउन को निर्धारित करने के लिए एक नई विधि पेश की गई है। “कुल उपभोग्य क्षमता” कहा जाता है, यह विधि क्लासिक बाहरी खंड “पल्स-चेज़” परख में निहित आरपीई फागोसाइटोसिस क्षमता की संभावित गलत व्याख्याओं को दूर करती है। यहां पेश किए गए मॉडल और तकनीकों का उपयोग लिपोफसिन उत्पादन और निकासी मार्गों और कथित विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड युक्तियों या टुकड़ों के दैनिक उत्थान और गिरावट सहित फोटोरिसेप्टर के लिए महत्वपूर्ण समर्थन प्रदान करता है (इस प्रोटोकॉल के दौरान, संक्षिप्त नाम ओएस पूरे बाहरी खंडों के बजाय ओएस युक्तियों या टुकड़ों के लिए खड़ा है)। पोस्ट-माइटोटिक आरपीई में यह दैनिक उत्थान अंततः फागोलाइसोसोमल क्षमता को अधिभारित करता है और अपचनीय, ऑटोफ्लोरोसेंट इंट्रासेल्युलर सामग्री के निर्माण की ओर जाता है, जिसे लिपोफसिन कहा जाता है। दिलचस्प बात यह है कि कई अध्ययनों से यह भी पता चला है कि आरपीई लिपोफसिन ओएस फागोसाइटोसिस 1,2 के बिना जमा हो सकता है। लिपोफसिन में कई घटक होते हैं, जिनमें दृश्य चक्र रेटिनोइड्स से प्राप्त क्रॉस-लिंक्ड जोड़ शामिल हैं, और 80 3 वर्ष से अधिक आयु के लोगों के लिए आरपीई सेल वॉल्यूम के लगभग 20% पर कब्जा कर सकतेहैं।
क्या लिपोफसिन विषाक्त है, इस पर गर्म बहस हुई है। स्टारगार्ड की बीमारी फोटोरिसेप्टर और आरपीई का एक ऑटोसोमल रिसेसिव अपघटन है जिसमें एबीसीए 4 में एक उत्परिवर्तन फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों के भीतर निहित दृश्य चक्र रेटिनोइड्स के अनुचित प्रसंस्करण को ट्रिगर करता है। अनुचित रेटिनोइड प्रसंस्करण से बीआईएस-रेटिनोइड प्रजातियों के असामान्य क्रॉस-लिंकिंग और गठन की ओर जाता है, जिसमें बीआईएस-रेटिनोइड एन-रेटिनिलिडेन-एन-रेटिनिलएथेनॉलमाइन (ए 2 ई) शामिल है। अध्ययनों ने ए 2 ई विषाक्तता 4,5 के लिए कई तंत्रों का प्रदर्शन किया है। लिपोफसिन नैदानिक इमेजिंग के दौरान फंडस ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों में योगदान देता है, और स्टारगार्ड के रोगियों और पशु मॉडल दोनों रेटिना अपघटन से पहले फंडस ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि प्रदर्शित करते हैं, जो लिपोफसिन के स्तर और विषाक्तता 6,7 के बीच सहसंबंध का सुझाव देते हैं। हालांकि, उम्र के साथ, लिपोफससिन आरपीई अपघटन को ट्रिगर किए बिना सभी मनुष्यों में जमा होता है। इसके अलावा, उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) में, जहां आरपीई अपघटन केवल बुजुर्ग रोगियों में होता है, रोग के शुरुआती और मध्यवर्ती रूपों वाले लोगों में उम्र से मेल खाने वाले गैर-रोगग्रस्तमनुष्यों की तुलना में कम फंडस ऑटोफ्लोरेसेंस संकेत होते हैं। इन नैदानिक निष्कर्षों को हिस्टोलॉजिकल स्तर पर भी 9,10 तक सत्यापित किया गया है।
आरपीई लिपोफससिन संचय के पशु मॉडल ने लिपोफसिन विषाक्तता के बारे में कुछ अस्पष्टता भी छोड़ी है। एबीसीए 4 नॉकआउट माउस एक पिगमेंटेड पृष्ठभूमि पर रेटिना अपघटन प्रदर्शित नहीं करता है, जबकि यह अल्बिनो पृष्ठभूमि पर या नीली रोशनी11,12 के संपर्क में आने पर करता है। इसके अलावा, एबीसीए 4 नॉकआउट के माध्यम से प्राप्त लिपोफससिन की विषाक्तता संभवतः प्राकृतिक उम्र बढ़ने के साथ होने वाले अधिक धीरे-धीरे जमा होने वाले लिपोफसिन से भिन्न होती है, जैसा कि एएमडी13 में देखा गया है।
लिपोफससिन संचय के इन विट्रो मॉडल आरपीई स्वास्थ्य पर लिपोफसिन संचय के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प प्रदान करते हैं। इस तरह के मॉडल लिपोफसिन घटकों में हेरफेर करने की अनुमति देते हैं, एकल रेटिनोइड घटकों को खिलाने से लेकर ओएस को खिलाने तक, और पशु आरपीई के बजाय मानव में अध्ययन की अनुमति देते हैं। पिछले कुछ दशकों में, संस्कृति में आरपीई लिपोफसिन मॉडल करने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। अन्य समूहों के साथ, डॉ बोल्टन के समूह ने 4 से 85 वर्ष की आयु के दाताओं से 4 से 7 मानव प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के मार्ग पर तीन महीने तक रोजाना गोजातीय ओएस खिलाया। वैकल्पिक रूप से, ऑटोफैगी के निषेध ने 3 से 7 प्राथमिक मानव आरपीई संस्कृतियों15 में लिपोफस्सिन संचय को भी जन्म दिया है। हालांकि, अत्यधिक विभेदित, मार्ग 1, प्राथमिक मानव प्रसव-पूर्व आरपीई (एचएफआरपीई) संस्कृतियों में उप-घातक लाइसोसोमल निषेध लिपोफसिन को प्रेरित करने में विफल रहा, यहां तक किदैनिक आधार पर ओएस के बार-बार जोड़ने के साथ भी।
अधिक न्यूनीकरणवादी दृष्टिकोण के रूप में, दूसरों ने संस्कृतियों को एकल लिपोफसिन घटकों को खिलाया है, विशेष रूप से बीआईएस-रेटिनोइड ए 2 ई 4,17। इस तरह के अध्ययन मूल्यवान हैं कि वे व्यक्तिगत लिपोफसिन घटकों के लिए विषाक्तता के संभावित प्रत्यक्ष तंत्र को परिभाषित करते हैं, उदाहरण के लिए, लाइसोसोमल कोलेस्ट्रॉल और सेरामाइड होमियोस्टेसिस18। इसी समय, ए 2 ई1 9 की विषाक्तता के बारे में बहस है, और इसे सीधे कोशिकाओं को खिलाने से लिपोफसिन संचय के लिए विशिष्ट मार्ग को दरकिनार कर दिया जाता है, जिसमें फोटोरिसेप्टर ओएस का फागोसाइटोसिस शामिल है। आरपीई संस्कृतियों में लिपोफसिन के सभी घटकों को वितरित करने के प्रयास में, बोल्टन और मार्शल ने मानव आंखों से लिपोफसिन को शुद्ध किया और भ्रूण और बुजुर्ग मानव दाताओं दोनों से प्राप्त 4 से 7 मानव प्राथमिक आरपीई संस्कृतियों को पारित करने के लिए इसे खिलाया। अभिनव होने के बावजूद, यह विधि बार-बार प्रयोगों के लिए एक सीमित लिपोफसिन स्रोत का प्रतिनिधित्व करती है।
जबकि आरपीई संस्कृतियों को ओएस के बार-बार फीडिंग कई प्रणालियों में लिपोफसिन का उत्पादन करते हैं, यह अत्यधिक विभेदित प्राथमिक आरपीईसंस्कृतियों में ऐसा करने में विफल रहता है। फोटो-ऑक्सीकरण ओएस बीआईएस-रेटिनोइड गठन जैसी क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करता है जो स्वाभाविक रूप से विवो में लिपोफसिन गठन के दौरान होता है। यह आरपीई संस्कृति प्रणालियों में लिपोफससिन जैसे ग्रेन्युल गठन में तेजी ला सकता है, यहां तक कि वे भी जो लिपोफसिन संचयके लिए अत्यधिक विभेदित और प्रतिरोधी हैं। यहां, अत्यधिक विभेदित एचएफआरपीई और मानव आईपीएससी-आरपीई में लिपोफसिन जैसे ग्रेन्युल संचय को प्रेरित करने की एक विधि पेश की गई है, जो विहलमार्क के प्रकाशित प्रोटोकॉल21 से संशोधित है। इस विधि में लिपोफससिन जैसे कणिकाओं को प्रेरित करने का लाभ है जो उसी स्रोत (फोटोरिसेप्टर ओएस) और मार्ग (फागोलाइसोसोमल ओएस अपटेक) को नियोजित करते हैं जैसा कि विवो में लिपोफसिनोजेनेसिस के लिए होता है। इसके अलावा, यह मानव आरपीई संस्कृतियों पर किया जाता है जो विवो 22,23,24 में मानव आरपीई को दोहराने के लिए कई अध्ययनों में अत्यधिक विभेदित और मान्य हैं। इन लिपोफससिन जैसे कणिकाओं को अपचनीय ऑटोफ्लोरोसेंट सामग्री (यूएएम) कहा जाता है, और इस प्रोटोकॉल में डेटा और चर्चा प्रदान करते हैं जो यूएएम की तुलना विवो लिपोफसिन में करते हैं। अत्यधिक विभेदित मानव आरपीई में यूएएम से भरी संस्कृतियों के निर्माण और मूल्यांकन के तरीकों के साथ, आरपीई ओएस फागोसाइटोसिस का आकलन करने के लिए एक अद्यतन विधि भी पेश की गई है। ओएस फागोसाइटोसिस को निर्धारित करने के लिए कई उत्कृष्ट पल्स-चेज़ विधियों को पेश किया गया है, जिसमें पश्चिमी सोख्ता, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और एफएसीएस25,26,27 शामिल हैं। हालांकि, ओएस पल्स-चेज़ की शुरुआत में, खराब ओएस अपटेक की ओर ले जाने वाली स्थितियों को उन स्थितियों के साथ जोड़ा जा सकता है जो आंतरिक ओएस के तेजी से क्षरण को बढ़ावा देते हैं। यहां प्रस्तुत विधि पेश किए गए ओएस की कुल मात्रा को मापती है जो आरपीई (“कुल उपभोग क्षमता”) द्वारा पूरी तरह से खपत / अवक्रमित है, जिससे इस अस्पष्टता को खत्म करने में मदद मिलती है। यह अनुमान लगाया गया है कि इन प्रोटोकॉल का उपयोग करके लिपोफसिन विषाक्तता के बारे में अंतर्दृष्टि, जिसमें “कुल उपभोग्य क्षमता” विधि का उपयोग करके ओएस फागोसाइटोसिस दरों पर प्रभाव शामिल है, का उपयोग विवो में लिपोफसिन की विषाक्तता पर प्रकाश डालने के लिए किया जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि आरपीई लिपोफसिन का दशकों से अध्ययन किया गया है, इसकी विषाक्तता पर 2,9,16,42 बहस की जाती है। पशु मॉडल11 से लिपोफसिन की विषाक्तता के बारे में अस्पष्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विट्रियो-रेटिना सर्जरी फाउंडेशन (वीआरएसएफ), फाइट फॉर साइट (एफएफएस), और इंटरनेशनल रेटिना रिसर्च फाउंडेशन (आईआरआरएफ) से अनुदान द्वारा समर्थित है। जे.एम.एल.एम. वर्तमान में राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (EY033420) से K08 अनुदान द्वारा समर्थित है। एचएफटी अनुसंधान के लिए कोई संघीय धन का उपयोग नहीं किया गया था। आगे का समर्थन ड्राई एएमडी के लिए जेम्स ग्रोसफेल्ड पहल और निम्नलिखित निजी दाताओं से आता है: बारबरा डन और डी एंड डिक्सन ब्राउन।
Materials
| 100 mm cell culture dish | Corning | #353003 | Others also work |
| 24-well Transwells | Corning | #3470 | |
| Anti-LC3 antibody | Cell Signaling Technology | #4801S | 1:1000 dilution |
| Anti-rhodopsin antibody 1D4 | Abcam | #5417 | 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal. |
| Anti-rhodopsin antibody 4D2 | EnCor Biotech | MCA-B630 | 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal. |
| Autofluorescence quencher | Biotium | #23007 | TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher |
| Autofluorescence quencher | Vector Laboratories | SP-8400 | Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit |
| Bodipy 493/503 | Life Technologies | D3922 | |
| Cholesterol esterase | Life Technologies | From A12216 kit | |
| Confocal microscope | Leica | Leica Stellaris SP8 with FALCON module | |
| Dark-adapted bovine retinas | W. L. Lawson Company | Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) | Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com |
| Filipin | Sigma-Aldrich | F4767 | |
| Flow cytometer | Thermo Fisher | Attune NxT | |
| Flow cytometer analysis software | BD | FlowJo | |
| Handheld UV light | Analytik Jena US | UVGL-55 | |
| Human MFG-E8 | Sino Biological | 10853-H08B | |
| Human purified Protein S | Enzyme Research Laboratories | HPS | |
| Laemmli sample buffer | Thermo Fisher | J60015-AD | |
| LDH assay | Promega | J2380 | LDH-Glo Cytotoxicity Assay |
| Mounting media | Invitrogen | P36930 | Prolong Gold antifade reagent |
| Nile red | Sigma-Aldrich | #72485 | |
| Polytetrafluoroethylene-coated slides | Tekdon | Customized | Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" - 3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide. |
| Protease inhibitors | Cell Signaling Technology | #5872 | |
| Protein assay | Bio-Rad | #5000122 RC DC protein assay | |
| TEER electrode | World Precision Instruments | STX3 | |
| Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter | World Precision Instruments | EVOM3 | |
| Ultraviolet crosslinker device | Analytik Jena US | UVP CL-1000 |
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