Förbättrade lipofuscinmodeller och kvantifiering av fagocytoskapacitet i yttre segmentet i högpolariserade humana retinala pigmentepitelkulturer

Summary

Detta protokoll beskriver en lipofuscinackumuleringsmodell i mycket differentierade och polariserade humana retinala pigmentepiteliala (RPE) kulturer och en förbättrad fagocytosanalys i yttre segment (OS) för att detektera RPE: s totala förbrukning / nedbrytningskapacitet. Dessa metoder övervinner begränsningarna hos tidigare lipofuscinmodeller och klassiska pulsjaktsanalyser av yttre segmentfagocytos.

Abstract

Den dagliga fagocytosen av fotoreceptorns yttre segment av retinalpigmentepitelet (RPE) bidrar till ackumuleringen av ett intracellulärt åldringspigment som kallas lipofuscin. Toxiciteten av lipofuscin är väl etablerad i Stargardts sjukdom, den vanligaste ärftliga retinal degeneration, men är mer kontroversiell i åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den främsta orsaken till irreversibel blindhet i den utvecklade världen. Att bestämma lipofuscintoxicitet hos människor har varit svårt, och djurmodeller av Stargardts har begränsad toxicitet. Således behövs in vitro-modeller som efterliknar human RPE in vivo för att bättre förstå lipofuscingenerering, clearance och toxicitet. Majoriteten av cellodlingslipofuscinmodeller hittills har varit i cellinjer eller har involverat matning av RPE en enda komponent i den komplexa lipofuscinblandningen snarare än fragment / spetsar av hela fotoreceptorns yttre segment, vilket genererar en mer komplett och fysiologisk lipofuscinmodell. Här beskrivs en metod för att inducera ackumulering av lipofuscinliknande material (benämnt osmältbart autofluorescensmaterial, eller UAM) i högdifferentierad primär human prenatal RPE (hfRPE) och inducerad pluripotent stamcellshärledd RPE (iPSC). UAM ackumuleras i kulturer genom upprepade matningar av ultraviolett ljusbehandlade OS-fragment som tas upp av RPE via fagocytos. De viktigaste sätten som UAM approximerar och skiljer sig från lipofuscin in vivo diskuteras också. Tillsammans med denna modell av lipofuscinliknande ackumulering introduceras avbildningsmetoder för att skilja det breda autofluorescensspektrumet av UAM-granuler från samtidig antikroppsfärgning. Slutligen, för att bedöma effekten av UAM på RPE-fagocytoskapacitet, har en ny metod för att kvantifiera upptag och nedbrytning av yttre segmentfragment / spetsar introducerats. Benämnd “Total konsumptiv kapacitet”, denna metod övervinner potentiella feltolkningar av RPE-fagocytoskapacitet som är inneboende i klassiska yttre segment “pulsjakt” -analyser. De modeller och tekniker som introduceras här kan användas för att studera lipofuscingenerering och clearancevägar och förmodad toxicitet.

Introduction

Det retinala pigmentepitelet (RPE) ger kritiskt stöd för överliggande fotoreceptorer, inklusive det dagliga upptaget och nedbrytningen av fotoreceptorns yttre segmentspetsar eller fragment (i hela detta protokoll står förkortningen OS för OS-tips eller fragment snarare än hela yttre segment). Detta dagliga upptag i postmitotisk RPE överbelastar så småningom fagolysosomal kapacitet och leder till uppbyggnad av osmältbart, autofluorescerande intracellulärt material, kallat lipofuscin. Intressant nog har flera studier också visat att RPE lipofuscin kan ackumuleras utan OS fagocytos ^1,2. Lipofuscin har många komponenter, inklusive tvärbundna addukter härrörande från visuell cykel retinoider, och kan uppta nästan 20% av RPE-cellvolymen för personer över 80 år³.

Huruvida lipofuscin är giftigt har diskuterats varmt. Stargardts sjukdom är en autosomal recessiv degeneration av fotoreceptorerna och RPE där en mutation i ABCA4 utlöser felaktig bearbetning av visuella cykelretinoider som finns i fotoreceptorns yttre segment. Felaktig retinoidbearbetning leder till avvikande tvärbindning och bildning av bis-retinoida arter, inklusive bis-retinoid N-retinyliden-N-retinyletanolamin (A2E). Studier har visat flera mekanismer för A2E-toxicitet ^4,5. Lipofuscin bidrar till fundus autofluorescenssignaler under klinisk avbildning, och både Stargardts patienter och djurmodeller visar ökad fundus autofluorescens före retinal degeneration, vilket tyder på en korrelation mellan lipofuscinnivåer och toxicitet ^6,7. Men med åldern ackumuleras lipofuscin hos alla människor utan att utlösa en RPE-degeneration. Vidare, i åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), där RPE-degeneration endast förekommer hos äldre patienter, har de med tidiga och mellanliggande former av sjukdomen mindre fundus autofluorescenssignaler än åldersmatchade icke-sjuka människor⁸. Dessa kliniska fynd har verifierats på histologisk nivå samt ^9,10.

Djurmodeller av RPE lipofuscin ackumulering har också lämnat viss tvetydighet om lipofuscin toxicitet. ABCA4 knockout-musen visar inte retinal degeneration på en pigmenterad bakgrund, medan den gör det på en albinobakgrund eller när den utsätts för blått ljus^11,12. Vidare skiljer sig toxiciteten hos lipofuscin härledd via ABCA4-knockout sannolikt från det långsammare ackumulerande lipofuscin som uppträder med naturligt åldrande, vilket ses i AMD¹³.

In vitro-modeller av lipofuscin ackumulering ger ett alternativ till att studera effekterna av lipofuscin ackumulering på RPE hälsa. Sådana modeller möjliggör manipulering av lipofuscinkomponenter, från matning av enstaka retinoidkomponenter till utfodring av OS, och tillåter studier i humant snarare än animaliskt RPE. Under de senaste decennierna har flera metoder utvecklats för att modellera RPE lipofuscin i kultur. Tillsammans med andra grupper matade Dr. Boultons grupp bovint OS dagligen i upp till tre månader vid passage 4 till 7 humana primära RPE-celler från givare i åldern 4 till 85 år¹⁴. Alternativt har hämning av autofagi också lett till lipofuscinackumulering i passagerna 3 till 7 primära humana RPE-kulturer¹⁵. Subletala lysosomala hämningar i mycket differentierade, passage 1, primära humana prenatala RPE-kulturer (hfRPE) misslyckades dock med att inducera lipofuscin, även med upprepad tillsats av OS dagligen¹⁶.

Som ett mer reduktionistiskt tillvägagångssätt har andra matat enstaka lipofuscinkomponenter till kulturer, särskilt bis-retinoid A2E ^4,17. Sådana studier är värdefulla genom att de definierar potentiella direkta mekanismer för toxicitet för enskilda lipofuscinkomponenter, vilket exempelvis involverar lysosomalt kolesterol och ceramidhomeostas¹⁸. Samtidigt diskuteras toxiciteten hos A2E¹⁹, och att mata den direkt till celler kringgår den typiska vägen för lipofuscinackumulering, vilket involverar fagocytos av fotoreceptor OS. I ett försök att leverera alla komponenter av lipofuscin till RPE-kulturer, renade Boulton och Marshall lipofuscin från mänskliga ögon och matade detta till passage 4 till 7 mänskliga primära RPE-kulturer härrörande från både foster och äldre mänskliga donatorer²⁰. Även innovativ, representerar denna metod en begränsad lipofuscin källa för upprepade experiment.

Medan upprepade matningar av OS till RPE-kulturer producerar lipofuscin i många system, misslyckas det med att göra det i mycket differentierade primära RPE-kulturer¹⁶. Fotooxiderande OS inducerar tvärbindningsreaktioner som bis-retinoidbildning som naturligt uppträder under lipofuscinbildning in vivo. Detta kan påskynda lipofuscinliknande granulbildning i RPE-odlingssystem, även de som är mycket differentierade och resistenta mot lipofuscinackumulering¹⁶. Här introduceras en metod för att inducera lipofuscinliknande granulatackumulering i högdifferentierad hfRPE och human iPSC-RPE, modifierad från Wihlmarks publicerade protokoll²¹. Denna metod har fördelen att inducera lipofuscinliknande granuler som använder samma källa (fotoreceptor OS) och väg (fagolysosomalt OS-upptag) som sker för lipofuscinogenes in vivo. Vidare görs det på humana RPE-kulturer som är mycket differentierade och validerade i flera studier för att replikera human RPE in vivo^22,23,24. Dessa lipofuscinliknande granuler kallas osmältbart autofluorescerande material (UAM) och ger data och diskussion i detta protokoll som jämför UAM med in vivo lipofuscin. Tillsammans med metoder för att bygga och utvärdera UAM-laddade kulturer i högdifferentierad human RPE introduceras också en uppdaterad metod för att bedöma RPE OS-fagocytos. Flera utmärkta pulsjaktsmetoder för kvantifiering av OS-fagocytos har introducerats, inklusive Western blotting, immunocytokemi och FACS^25,26,27. Men tidigt i OS-pulsjakten kan förhållanden som leder till dålig OS-upptagning blandas ihop med förhållanden som främjar snabb nedbrytning av internaliserat operativsystem. Metoden som presenteras här mäter den totala mängden introducerat operativsystem som helt förbrukas/försämras av RPE (“Total förbrukningskapacitet”), vilket hjälper till att eliminera denna tvetydighet. Det förväntas att insikter om lipofuscintoxicitet som använder dessa protokoll, inklusive effekter på OS-fagocytoshastigheter med hjälp av metoden “Total konsumtionskapacitet”, kommer att användas för att belysa toxiciteten hos lipofuscin in vivo.

Protocol

Det nuvarande protokollet om förvärv och användning av mänsklig vävnad granskades och godkändes av University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486). 1. Beredning av fotooxiderade yttre segmentspetsar och fragment OBS: Mörkanpassade bovina näthinnor köptes och skickades på is (se Materialförteckning). Från dessa näthinnor renades OS enligt ett tidigare publicerat protokoll23. Yttre segment…

Representative Results

Inställningen för fotooxidation av operativsystem visas i figur 1Ai. De polytetrafluoretylenbelagda objektglasen gör det möjligt att ladda en stor volym OS-lösning per öppen rektangel utan att sprida sig över resten av objektglaset. Bilden med OS finns i en steril petriskål med locket avstängt och en UV-lampa placeras över bilden som visas i figur 1Aii. Alternativt kan bilden placeras i en UV-tvärbindare, som visas i figur 1Aiii</…

Discussion

Medan RPE lipofuscin har studerats i årtionden, dess toxicitet diskuteras 2,9,16,42. Med tanke på tvetydighet om toxiciteten hos lipofuscin från djurmodeller¹¹ är in vitro-modeller som använder human RPE värdefulla. En rad in vitro lipofuscinackumuleringsmodeller har beskrivits, men ingen har använt både OS-utfodring och mycket mogna och differe…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000