A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Detta protokoll beskriver en lipofuscinackumuleringsmodell i mycket differentierade och polariserade humana retinala pigmentepiteliala (RPE) kulturer och en förbättrad fagocytosanalys i yttre segment (OS) för att detektera RPE: s totala förbrukning / nedbrytningskapacitet. Dessa metoder övervinner begränsningarna hos tidigare lipofuscinmodeller och klassiska pulsjaktsanalyser av yttre segmentfagocytos.

Abstract

Den dagliga fagocytosen av fotoreceptorns yttre segment av retinalpigmentepitelet (RPE) bidrar till ackumuleringen av ett intracellulärt åldringspigment som kallas lipofuscin. Toxiciteten av lipofuscin är väl etablerad i Stargardts sjukdom, den vanligaste ärftliga retinal degeneration, men är mer kontroversiell i åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den främsta orsaken till irreversibel blindhet i den utvecklade världen. Att bestämma lipofuscintoxicitet hos människor har varit svårt, och djurmodeller av Stargardts har begränsad toxicitet. Således behövs in vitro-modeller som efterliknar human RPE in vivo för att bättre förstå lipofuscingenerering, clearance och toxicitet. Majoriteten av cellodlingslipofuscinmodeller hittills har varit i cellinjer eller har involverat matning av RPE en enda komponent i den komplexa lipofuscinblandningen snarare än fragment / spetsar av hela fotoreceptorns yttre segment, vilket genererar en mer komplett och fysiologisk lipofuscinmodell. Här beskrivs en metod för att inducera ackumulering av lipofuscinliknande material (benämnt osmältbart autofluorescensmaterial, eller UAM) i högdifferentierad primär human prenatal RPE (hfRPE) och inducerad pluripotent stamcellshärledd RPE (iPSC). UAM ackumuleras i kulturer genom upprepade matningar av ultraviolett ljusbehandlade OS-fragment som tas upp av RPE via fagocytos. De viktigaste sätten som UAM approximerar och skiljer sig från lipofuscin in vivo diskuteras också. Tillsammans med denna modell av lipofuscinliknande ackumulering introduceras avbildningsmetoder för att skilja det breda autofluorescensspektrumet av UAM-granuler från samtidig antikroppsfärgning. Slutligen, för att bedöma effekten av UAM på RPE-fagocytoskapacitet, har en ny metod för att kvantifiera upptag och nedbrytning av yttre segmentfragment / spetsar introducerats. Benämnd “Total konsumptiv kapacitet”, denna metod övervinner potentiella feltolkningar av RPE-fagocytoskapacitet som är inneboende i klassiska yttre segment “pulsjakt” -analyser. De modeller och tekniker som introduceras här kan användas för att studera lipofuscingenerering och clearancevägar och förmodad toxicitet.

Introduction

Det retinala pigmentepitelet (RPE) ger kritiskt stöd för överliggande fotoreceptorer, inklusive det dagliga upptaget och nedbrytningen av fotoreceptorns yttre segmentspetsar eller fragment (i hela detta protokoll står förkortningen OS för OS-tips eller fragment snarare än hela yttre segment). Detta dagliga upptag i postmitotisk RPE överbelastar så småningom fagolysosomal kapacitet och leder till uppbyggnad av osmältbart, autofluorescerande intracellulärt material, kallat lipofuscin. Intressant nog har flera studier också visat att RPE lipofuscin kan ackumuleras utan OS fagocytos ^1,2. Lipofuscin har många komponenter, inklusive tvärbundna addukter härrörande från visuell cykel retinoider, och kan uppta nästan 20% av RPE-cellvolymen för personer över 80 år³.

Huruvida lipofuscin är giftigt har diskuterats varmt. Stargardts sjukdom är en autosomal recessiv degeneration av fotoreceptorerna och RPE där en mutation i ABCA4 utlöser felaktig bearbetning av visuella cykelretinoider som finns i fotoreceptorns yttre segment. Felaktig retinoidbearbetning leder till avvikande tvärbindning och bildning av bis-retinoida arter, inklusive bis-retinoid N-retinyliden-N-retinyletanolamin (A2E). Studier har visat flera mekanismer för A2E-toxicitet ^4,5. Lipofuscin bidrar till fundus autofluorescenssignaler under klinisk avbildning, och både Stargardts patienter och djurmodeller visar ökad fundus autofluorescens före retinal degeneration, vilket tyder på en korrelation mellan lipofuscinnivåer och toxicitet ^6,7. Men med åldern ackumuleras lipofuscin hos alla människor utan att utlösa en RPE-degeneration. Vidare, i åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), där RPE-degeneration endast förekommer hos äldre patienter, har de med tidiga och mellanliggande former av sjukdomen mindre fundus autofluorescenssignaler än åldersmatchade icke-sjuka människor⁸. Dessa kliniska fynd har verifierats på histologisk nivå samt ^9,10.

Djurmodeller av RPE lipofuscin ackumulering har också lämnat viss tvetydighet om lipofuscin toxicitet. ABCA4 knockout-musen visar inte retinal degeneration på en pigmenterad bakgrund, medan den gör det på en albinobakgrund eller när den utsätts för blått ljus^11,12. Vidare skiljer sig toxiciteten hos lipofuscin härledd via ABCA4-knockout sannolikt från det långsammare ackumulerande lipofuscin som uppträder med naturligt åldrande, vilket ses i AMD¹³.

In vitro-modeller av lipofuscin ackumulering ger ett alternativ till att studera effekterna av lipofuscin ackumulering på RPE hälsa. Sådana modeller möjliggör manipulering av lipofuscinkomponenter, från matning av enstaka retinoidkomponenter till utfodring av OS, och tillåter studier i humant snarare än animaliskt RPE. Under de senaste decennierna har flera metoder utvecklats för att modellera RPE lipofuscin i kultur. Tillsammans med andra grupper matade Dr. Boultons grupp bovint OS dagligen i upp till tre månader vid passage 4 till 7 humana primära RPE-celler från givare i åldern 4 till 85 år¹⁴. Alternativt har hämning av autofagi också lett till lipofuscinackumulering i passagerna 3 till 7 primära humana RPE-kulturer¹⁵. Subletala lysosomala hämningar i mycket differentierade, passage 1, primära humana prenatala RPE-kulturer (hfRPE) misslyckades dock med att inducera lipofuscin, även med upprepad tillsats av OS dagligen¹⁶.

Som ett mer reduktionistiskt tillvägagångssätt har andra matat enstaka lipofuscinkomponenter till kulturer, särskilt bis-retinoid A2E ^4,17. Sådana studier är värdefulla genom att de definierar potentiella direkta mekanismer för toxicitet för enskilda lipofuscinkomponenter, vilket exempelvis involverar lysosomalt kolesterol och ceramidhomeostas¹⁸. Samtidigt diskuteras toxiciteten hos A2E¹⁹, och att mata den direkt till celler kringgår den typiska vägen för lipofuscinackumulering, vilket involverar fagocytos av fotoreceptor OS. I ett försök att leverera alla komponenter av lipofuscin till RPE-kulturer, renade Boulton och Marshall lipofuscin från mänskliga ögon och matade detta till passage 4 till 7 mänskliga primära RPE-kulturer härrörande från både foster och äldre mänskliga donatorer²⁰. Även innovativ, representerar denna metod en begränsad lipofuscin källa för upprepade experiment.

Medan upprepade matningar av OS till RPE-kulturer producerar lipofuscin i många system, misslyckas det med att göra det i mycket differentierade primära RPE-kulturer¹⁶. Fotooxiderande OS inducerar tvärbindningsreaktioner som bis-retinoidbildning som naturligt uppträder under lipofuscinbildning in vivo. Detta kan påskynda lipofuscinliknande granulbildning i RPE-odlingssystem, även de som är mycket differentierade och resistenta mot lipofuscinackumulering¹⁶. Här introduceras en metod för att inducera lipofuscinliknande granulatackumulering i högdifferentierad hfRPE och human iPSC-RPE, modifierad från Wihlmarks publicerade protokoll²¹. Denna metod har fördelen att inducera lipofuscinliknande granuler som använder samma källa (fotoreceptor OS) och väg (fagolysosomalt OS-upptag) som sker för lipofuscinogenes in vivo. Vidare görs det på humana RPE-kulturer som är mycket differentierade och validerade i flera studier för att replikera human RPE in vivo^22,23,24. Dessa lipofuscinliknande granuler kallas osmältbart autofluorescerande material (UAM) och ger data och diskussion i detta protokoll som jämför UAM med in vivo lipofuscin. Tillsammans med metoder för att bygga och utvärdera UAM-laddade kulturer i högdifferentierad human RPE introduceras också en uppdaterad metod för att bedöma RPE OS-fagocytos. Flera utmärkta pulsjaktsmetoder för kvantifiering av OS-fagocytos har introducerats, inklusive Western blotting, immunocytokemi och FACS^25,26,27. Men tidigt i OS-pulsjakten kan förhållanden som leder till dålig OS-upptagning blandas ihop med förhållanden som främjar snabb nedbrytning av internaliserat operativsystem. Metoden som presenteras här mäter den totala mängden introducerat operativsystem som helt förbrukas/försämras av RPE (“Total förbrukningskapacitet”), vilket hjälper till att eliminera denna tvetydighet. Det förväntas att insikter om lipofuscintoxicitet som använder dessa protokoll, inklusive effekter på OS-fagocytoshastigheter med hjälp av metoden “Total konsumtionskapacitet”, kommer att användas för att belysa toxiciteten hos lipofuscin in vivo.

Protocol

Det nuvarande protokollet om förvärv och användning av mänsklig vävnad granskades och godkändes av University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486). 1. Beredning av fotooxiderade yttre segmentspetsar och fragment OBS: Mörkanpassade bovina näthinnor köptes och skickades på is (se Materialförteckning). Från dessa näthinnor renades OS enligt ett tidigare publicerat protokoll23. Yttre segmenttvärbindning med UV-lampaSänk ner polytetrafluoretylenbelagda glas (se materialförteckning) helt i 70% etanol i 10 minuter i ett biosäkerhetsskåp för att sterilisera objektglasen. Låt objektglasen lufttorka i en steril 100 mm cellodlingsskål. Placera varje glas i en ny 100 mm cellodlingsskål och tillsätt 200 μl seruminnehållande cellodlingssubstrat (oavsett vilket medium som vanligtvis används för de aktuella RPE-kulturerna) i varje rektangel och placera sedan ett handhållet 254 nm UV-ljus (se Materialförteckning) på 100 mm cellodlingsskålen (utan lock) med glödlampan direkt vänd mot glaset. och exponera i 20 min. De medier som specifikt används för denna studie och de specifika produktnumren för mediekomponenterna har tidigare publicerats22,23. Detta medium kallas “RPE-media” i hela detta protokoll.UV-behandling av mediet blockerar glasytan och förhindrar att OS fastnar under nästa steg. Tina frysta alikvoter av OS vid 37 °C (i handen eller via vattenbad). Mängden operativsystem som behövs beror på applikationen. I allmänhet kan man behandla upp till 500 μL 2 x 108 OS / ml per rektangel på bilden. När du har tinat, snurra operativsystemet vid 2400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera omedelbart supernatanten i biosäkerhetsskåpet med en pipett snarare än ett vakuum för att förhindra oavsiktlig förlust av pelleten. Resuspendera försiktigt pelleten med steril PBS.OBS: Håll koll på den återsuspenderade volymen och den förväntade koncentrationen. t.ex. återsuspendering av pelleten från ett 1 ml rör med 1 x 10 8 OS/ml med 500 μL PBS ger 2 x 108 OS/ml. Den maximala volymen och koncentrationen per rektangel på det polytetrafluoretylenbelagda objektglaset är 500 μl 2 x 108 OS/ml. Aspirera mediet från objektglasen och placera upp till 500 μl 2 x 108 OS/ml PBS-lösning på varje rektangel på objektglaset. Placera det handhållna UV-ljuset över cellodlingsskålen (utan lock) med glödlampan direkt vänd mot operativsystemet. Utsätt OS-lösningen för 254 nm ljus i 40 minuter.OBS: Under 40 minuters exponering, täck UV-lampan och skålen med en handduk eller absorberande dyna, stäng biosäkerhetsskåpets båge och stäng av fläkten. Detta förhindrar att någon betydande avdunstning uppstår. Om UV-lampan som används i detta protokoll inte är tillgänglig för en forskare finns det två alternativ för att säkerställa att lämplig mängd tvärbindning uppnås. Den första är att följa den kvantitativa UV-exponering som beskrivs i steg 1.2, antingen med den enhet som beskrivs i steg 1.2 eller en annan enhet som kan ge samma kvantitativa strålningsexponering som nämnda enhet i 1.2. Ett annat alternativ är att utsätta OS för UV-bestrålning under en tid som inducerar graden av tvärbindning på Coomassie-fläcken som ses i figur 1C. Samla upp den behandlade OS PBS-lösningen i sterila mikrocentrifugrör, tvätta om rektangeln på det belagda glaset med 200-500 μL PBS (2-3x) och samla varje tvätt i mikrocentrifugröret. När du är klar, titta på bilden under ett vävnadsodlingsrumsmikroskop för att bekräfta att nästan alla operativsystem har tagits bort från bilden. Snurra ned OS PBS-lösningen vid 2400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur, aspirera PBS i biosäkerhetsskåpet med en pipettor och återsuspendera i 500 μL standardmedia som ska användas för RPE-kulturer (t.ex. “RPE-media” som definieras i avsnitt 1.1.2). Resuspensionsvolymen kan justeras baserat på önskad fotooxiderad OS-koncentration (OxOS). Placera 10 μL av suspensionen i ett nytt mikrocentrifugrör, späd 50-100x med mer cellodlingsmedia och räkna OS med en hemocytometer. Baserat på antalet operativsystem, späd OxOS-suspensionen till en slutlig lagerkoncentration. För utfodring av högmogna RPE-kulturer i 24-brunns Transwells (yta på 0,33 cm 2; se materialtabell) rekommenderas en slutlig mediekoncentration på2 x 107 OS/ml.För att uppnå detta, fördela OxOS i 25 μL alikvoter vid en koncentration på 5,6 x 107 OS/ml, suspenderad i standard RPE-odlingsmedia. Efter upptining av en alikvot på 25 μl blandas hela alikvoten med 45 μl standardsubstrat för RPE-odling, vilket ger en slutlig medievolym på 70 μl och OS-koncentration på 2 x 107 OS/ml för varje OxOS Transwell-matning. Innan du alikvoterar OxOS, tillsätt fagocytos överbryggande ligander (Protein S och MFG-E8, se Materialtabell), vilket underlättar OS-upptag och lipofuscinackumulering. Arbetskoncentrationerna av överbryggande ligander i en Transwell med 24 brunnar är 4 μg/ml för humant renat protein S och 1,5 μg/ml för humant rekombinant MFG-E8. För 25 μl alikvoter av OxOS vid 5,6 x 107 OS/ml är lagerkoncentrationen för protein S 11,2 μg/ml och för MFG-E8 4,2 μg/ml.OBS: Överbryggningsligandkoncentrationerna optimerades för hfRPE-kulturer på 24-brunns Transwells, med ett ungefärligt cellantal på 320 000 celler per 0,33 cm2 brunn. Ligandkoncentrationerna kan behöva justeras för andra RPE-typer och celldensiteter eftersom ligander som förekommer utöver fagocytosreceptortillgängligheten paradoxalt nog kan blockera OS-upptag28. Snäppfrys alikvoterna i flytande kväve.OBS: Flera frys-tinningar är mycket skadliga för OS-integriteten. Yttre segmenttvärbindning med en UV-tvärbindningsanordningFölj steg 1.1, med undantag för stegen nedan, som ersätter steg 1.1.2 respektive 1.1.6:(ersätter steg 1.1.2) Placera varje glas i en ny 100 mm cellodlingsskål och tillsätt 200 μL seruminnehållande cellodlingsmedia (t.ex. “RPE-media” eller något annat substitut) i varje rektangel och placera sedan objektglas i en ultraviolett tvärbindningsanordning (se Materialförteckning) och behandla med 254 nm UV vid en strålningsexponering på 3-6 J/cm2 för att blockera glasytan och förhindra att OS fastnar under nästa steg. (ersätter steg 1.1.6) Aspirera mediet från objektglasen och placera upp till 500 μl 2 x 108 OS/ml i steril PBS på varje rektangel på objektglaset. Placera objektglas i enheten för ultraviolett tvärbindare, ställ in strålningsexponering efter behov (3-9 J/cm2) och behandla vid 254 nm.OBS: Den strålningsexponering som behövs kan bestämmas noggrant genom titrering av strålningsexponering mellan 3-9 J/cm2 tills graden av autofluorescens och proteintvärbindning (som ses i figur 1B och figur 1C) uppnås.VARNING: Hantering av OS utanför ett biosäkerhetsskåp kan leda till kontaminering. Efter exponering av OS för UV-tvärbindningsenheten, samla OS med sterila pipettspetsar, överför till sterila mikrocentrifugrör och hantera alla ytterligare steg i biosäkerhetshuven. Karakterisering av oxiderat OSKvantifiera autofluorescensemissionsspektrum genom avbildningPlacera 20–50 μl stamlösning från obehandlat operativsystem och OxOS i två separata mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 2400 x g i 5 min vid rumstemperatur, resuspendera pellets i buffrad (t.ex. PBS) 4% paraformaldehyd och fixera i 15 minuter vid rumstemperatur. Efter fixering, snurra nedåt enligt ovan, tvätta med PBS x 2 (snurra ner mellan tvättarna) och återsuspendera sedan i mindre än 30 μl PBS. Placera några mikroliter av resuspensionen på ett mikroskopglas, tillsätt monteringsmedia (se materialförteckning) och slutligen ett täckglas. Bild OxOS på ett konfokalmikroskop (se materialförteckning).OBS: OxOS autofluorescens kan exciteras av ett brett spektrum av laservåglängder, men en 405 nm eller 488 nm laserlinje används vanligtvis. Emissionen är lika bred, men en typisk GFP / FITC-excitations- / emissionsfilterinställning är tillräcklig för att se autofluorescens. För att mäta OxOS-emissionsspektrumet, använd λ-skanning på ett konfokalmikroskop. Typiska λ-skanningsinställningar inkluderar excitation med 405 nm eller 488 nm och detektering av emission som sträcker sig från 10 nm rödförskjuten från laserexcitationslinjen hela vägen till cirka 800 nm, med en λ-stegstorlek på 10 nm. Varje mikroskopisystem har sina egna anvisningar om hur man använder λ-läget, och läsaren måste hänvisa till manualen för deras specifika konfokala. Som ett alternativ, kvantifiera autofluorescens genom flödescytometri.Snurra ner 2 x 10 7 obehandlat OS och separat 2 x 107 OxOS i mikrocentrifugrör och resuspendera i 1 ml PBS.OBS: Fixering krävs inte om flödescytometri utförs direkt efter upptining. Ladda obehandlade OS- och OxOS-prover på flödescytometer (se materialtabell). Justera forward scatter (FSC) och side scatter (SSC) till ett acceptabelt uppslag i FSC-SSC-spridningsdiagrammet. Använd PBS som en kontroll för att utesluta förorenande små partiklar. Observera att OS är betydligt mindre än celler. Använd flödescytometerns standard FITC-kanal för autofluorescenskvantifiering. Räkna minst 10 000 händelser. Använd FITC-histogrammets pulsområdesvärde för att representera fluorescensintensitet.OBS: För den aktuella studien analyseras alla data med hjälp av programvara för flödescytometeranalys (se materialförteckning), enligt tillverkarens instruktioner. Bedöma graden av tvärbindning i OxOSSnurra ner 2 x 10 7 obehandlat OS och separat 2 x 107 OxOS i mikrocentrifugrör. Ta bort supernatanten och lyse pelletsen direkt genom att tillsätta 1,2x Laemmli provbuffert (tillräckligt för att täcka; se materialförteckning). Vortex, håll vid rumstemperatur i 30 minuter, snurra ner vid rumstemperatur vid lika med eller större än 12000 x g i 10 minuter och samla supernatant.OBS: Bedömning av graden av proteintvärbindning i OxOS ger en känsla av UV-behandlingens tillräcklighet. Jämförelse görs mellan obehandlad OS och OxOS, och adekvat tvärbindning sker när det monomera rodopsinbandet som dominerar Coomassie-färgningen (figur 1C, pil) är bara märkbart, med framväxt av högre ordningsaggregat och ett proteinutstryk på toppen av gelén.VARNING: När du använder provbuffert för att lysera operativsystemet, värm inte upp lyslösningen därefter, eftersom detta kan utlösa rodopsinaggregering. Undvik också att kyla det lyserade operativsystemet tills det är klart för lagring, eftersom detta kommer att fälla ut SDS. Oanvända lysater kan förvaras vid -20 °C. Vid rethawing, se till att lysaterna är helt tinade vid rumstemperatur före användning. Kvantifiera proteinkoncentrationen med hjälp av en proteinanalys som är tolerant mot höga SDS och reduktionskoncentrationer29. Se Materialförteckning för förslag på lämpliga proteinanalysreagenser och följ tillverkarens protokoll för dessa reagens. Kör obehandlade OS- och OxOS-prover med SDS-PAGE-elektrofores30 på en 4% -15% gradientgel, med standard tris-glycin SDS-buffert. Gel körs vid 80 V tills prover kommer in i stapeln, sedan vid 120 V i 50-60 min vid rumstemperatur. Färga gelen med Coomassie-blå med standardprotokoll31. Coomassie-färgningen kommer att visa tillräckligheten av tvärbindning inducerad av UV-behandling. 2. Bygga lipofuscinliknande granuler (UAM) i RPE-kulturer OxOS-matningar: mängd, frekvens och fagocytos överbryggande liganderOBS: Matningar sker på humana iPSC-RPE- eller hfRPE-kulturer vid passage 1, odlade enligt protokollet som beskrivs av Bharti-laboratoriet (för iPSC-RPE)32 eller vårt tidigare skisserade protokoll för hfRPE, anpassat från Sheldon Miller-labbet22,23. Alla beräkningar nedan är baserade på matning av OxOS eller OS till en 24-brunns Transwell (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 tillväxtområde).Tina 25 μl 5,6 x 107 OxOS/ml vid 37 °C och tillsätt 45 μl cellodlingsmedia till OxOS-alikvoten, vilket resulterar i en slutlig volym på 70 μl.OBS: OxOS alikvoter beredda i steg 1 kommer att innehålla fagocytos överbryggande ligander MFG-E8 och Protein S. Om dessa ligander inte tillsattes till alikvoterna före nedfrysningen kan de emellertid tillsättas i detta steg, vilket säkerställer att den slutliga koncentrationen av liganderna i de medier som ska matas med cellerna är 4 μg/ml för protein S och 1,5 μg/ml för MFG-E8. Såsom anges i steg 1.1.11 kan koncentrationerna av överbryggande ligander behöva ändras för andra RPE-typer eller celldensiteter. Ta bort apikala medier från Transwell och tillsätt 70 μl 2 x 107 OxOS/ml med fagocytos som överbryggar ligander till apikalkammaren. Efter 24 timmar, ta bort och byt ut med en ny OxOS-matning. Matning sker dagligen under vardagar, hoppar över helger, tills 20 matningar är färdiga (~ 1 månad). Ändra basolaterala cellodlingsmedier (400-550 μL) 2-3x/vecka. Efter avslutad 20 matningar, återuppta normala medieförändringar för brunnen.OBS: Det tar flera ytterligare medieändringar för att tvätta bort klibbiga OxOS från RPE-apikalytan, så experiment med UAM-laddade kulturer måste göras minst 1-2 veckor efter att OxOS-matningen avslutats.VARNING: Det är viktigt att ha ordentliga kontroller för UAM-uppbyggnad via OxOS-matningar. Eftersom dagliga medieförändringar kan påverka RPE-biologin rekommenderas följande kontrollbrunnar: Kontroll 1: Byt ut media dagligen under vardagar för samma antal matningar som OxOS-behandlade gruppen. Kontroll 2: Mata RPE obehandlat OS dagligen under vardagar i samma koncentration och volym som OxOS-matning, för samma antal matningar. Övervakning av hälsan hos kulturer lastade med lipofuscinliknande granulat genom transepitelial elektrisk resistans (TEER) och celldödsanalyserOBS: Under och efter OxOS-matning kan hälsan hos RPE-kulturer mätas genom att bedöma RPE-täthetsintegritet och celldöd. Det har tidigare visats att bedömning av täthetstäthet, genom mätning av transepitelialt elektriskt motstånd (TEER), är en känslig markör för allmän cellhälsa33. Mer traditionella icke-invasiva markörer för celldöd, såsom frisättning av laktatdehydrogenas (LDH), kan också användas.Utför TEEROBS: TEER testas med en transepitelial elektrisk motståndsmätare (TEER) och TEER-elektrod, vanligtvis enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).För att sterilisera TEER-elektroden, använd en arbetstorkare indränkt i 70% etanol för att rengöra elektroden och sänk sedan ner elektrodsondens spetsar i 70% etanol i 10 minuter. Låt elektroden torka helt och sänk sedan ner elektroden i sterila medier. Ta bort sonden från sterila medier och sätt in TEER-elektrodens två sonder i de apikala och basolaterala kamrarna i en odlad Transwell; Den längre sondspetsen passar in i den basolaterala kammaren.OBS: Det är lätt att skrapa botten av apikalkammaren med TEER-elektroden utan övning, och sådan skrapning kommer dramatiskt att förändra TEER-avläsningarna när det sammanflytande RPE-monolagret störs. Därför rekommenderas att nybörjare övar på icke-viktiga Transwells innan de testar experimentella RPE-kulturer. Vidare, efter att varje platta av RPE-kulturer har testats, bör experimentet kontrollera om det finns någon skrapning av RPE-monolagret under ett standardvävnadsodlingsmikroskop. När de apikala och basolaterala sonderna är på plats i Transwell, tryck på läsknappen eller steg på mätarens fotbrytare för att registrera TEER. Tvätta elektrodsonden med sterila medier mellan plattor eller grupper av celler. Om infektion är en stor oro, sterilisera om mellan plattorna. Beräkna TEER genom att ta motståndsavläsningen från mätaren, subtrahera värdet på en tom Transwell med media men inga celler (vanligtvis 100-110 Ω för en 24-brunns Transwell med 0,33 cm2 yta) och multiplicera sedan med Transwells yta.OBS: TEER-värden måste rapporteras normaliserade till cellytan. Typiska värden för friska hfRPE-kulturer varierar från 350-1100 Ωcm2. TEER-värdena ökar när temperaturen sjunker. Således, när man tar bort kulturer från en 37 ° C inkubator till en rumstemperaturhuv, tenderar TEER-värdena att öka över plattan. För att skydda mot denna variation, arbeta antingen snabbt (om det upplevs) eller vänta i 10-15 minuter tills platttemperaturen balanserar med rumstemperaturen. Utför LDH-frisättningsanalysOBS: Frisättning av LDH till cellodlingssupernatant sker under celldöd och mäts med ett standardkit (se materialtabell).Samla upp supernatanten ovanför cellerna efter en 24 timmars inkubation och späd till 1:100 med standardmedia. Inducera total möjlig LDH-frisättning, vilket är viktigt för normalisering av alla värden från steg 2.2.2.1, genom tillsats av 2 μL 10% triton X-100 till 100 μL apikala medier från kontrollceller i en 24-brunns Transwell. Efter inkubation av supernatantblandningen triton/cell i 15 minuter vid 37 °C, blanda mediet ovanför de nu lyserade cellerna och samla in för att mäta total möjlig LDH-frisättning. När supernatanterna har samlats in, utför analysen med tillverkarens standardinstruktioner och mät luminiscensen efter en 30 minuters inkubation med hjälp av satsens buffertlösning.OBS: Alla LDH-värden normaliseras till den totala möjliga mängden LDH-frisättning. Karakterisering av lipofuscinliknande granulspektrum och sammansättningFörvärva autofluorescenskvantifiering och spektraFixa UAM-laddade kulturer med 4% PFA vid rumstemperatur i 15 minuter, följt av PBS-tvätt 5x. Håll en liten mängd PBS i apikalkammaren och vänd sedan Transwell upp och ner. Använd ett dissekerande mikroskop och ett rakblad, skär det halvporösa membranet från Transwell och applicera skärkraft vid korsningen mellan membranet och Transwell.OBS: Håll dig konsekvent om hur nära Transwells läpp snittet görs, eftersom Transwell-membranet har en tendens att skrynklas och skrynklas när snitten inte är konsekventa. När Transwell-membranet har skurits, placera omedelbart på ett mikroskopglas med pincett, var försiktig så att du undviker att vidröra delar av Transwell-membranet med celler. Transportera bort överflödig PBS med en uppgiftstorkning, samtidigt som du undviker att röra cellerna. Lägg till monteringsmedia och ett täckglas. Se till att hålla reda på vilken sida av Transwell som är “höger sida upp” när du täcker Transwell. Samla in autofluorescerande intensitet och spektra med samma inställningar och procedurer som steg 1.3.1.4 och steg 1.3.1.5.OBS: Vid avbildning av UAM är en viktig förvirring att OxOS är autofluorescerande och ofta håller fast vid RPE-apikalytan i dagar och ibland till och med veckor efter avslutad OxOS-matning. Som ett resultat, vid kvantifiering av UAM, måste en metod användas för att säkerställa att uppmätt autofluorescens kommer från UAM och inte OxOS. Den enklaste metoden är att samfärga lipofuscinkulturer med en rhodopsinantikropp. Till exempel kan anti-rhodopsinantikropp 4D2 användas vid en 1: 1000 utspädning och med ett standard PFA-fixeringsimmunocytokemiprotokoll34. Den sekundära antikroppen för rodopsin bör vara en långröd färgkonjugerad antikropp (t.ex. med en excitationsmaxima nära 647 nm), eftersom UAM och OxOS autofluorescens tenderar att vara svagast i denna våglängd. Konfokala bilder kan sedan förvärvas sekventiellt i två kanaler, spännande UAM- och OxOS-autofluorescens med en 405 nm laser och emission från 415 nm till 550 nm, medan kvarvarande rodopsin, som indikerar osmält OxOS, kan exciteras med standard långröda färgämnesavbildningsparametrar i en separat kanal. Efter förvärvet kan rhodopsinkanalen användas som en subtraktiv mask i ett program som ImageJ för att avlägsna autofluorescens som kommer från klibbiga återstående OxOS, vilket lämnar efter sig bara UAM-autofluorescens att kvantifiera.VARNING: Även operativsystem som inte är fotooxiderade visar viss autofluorescens, och även med noggrann tvätt fastnar vissa operativsystem och OxOS på RPE-ytan. Således, utan att generera en subtraktiv mask med användning av rodopsinimmunfärgning, som föreslagits i ovanstående OBS, är noggrann kvantifiering av UAM-autofluorescensnivåer i kulturer som matas med OxOs eller standard OS inte möjlig. Utföra samtidig detektion av lipofuscinliknande granulat och andra immunofluorescensmarkörerOBS: Som beskrivs i steg 2.3.1 begränsar lipofuscinets breda autofluorescensspektrum valet för fluorescens samfärgning. Följande metoder kan övervägas för att underlätta samfärgning.Använd en långröd fluorofor. Autofluorescens från lipofuscin är svag i närheten av infraröd. Således kan användning av ett långrött färgämne för fluorescensdetektion av ett antigen av intresse, kombinerat med noggranna justeringar av kanalinställningar på ett konfokalmikroskop, vanligtvis skilja autofluorescens från samfärgningsfluorescens. Dra nytta av lipofuscins långa fluorescensemissionssvans.OBS: Eftersom lipofuscin har ett mycket brett fluorescensemissionsspektrum kan det ofta exciteras vid en låg nm-våglängd (t.ex. 405 nm laser) och ha emission fortfarande detekterad i den orange / röda delen av spektrumet (t.ex. 585-635nm). Denna unika kombination av excitations- och emissionsvåglängder kan ofta skräddarsys runt en annan samfärgande fluorofor.Detektera antigenet av intresse med hjälp av en fluorofor som har toppexcitation runt 488 nm, med emissionsdetektering vid 500-530 nm. Ställ in en separat kanal för autofluorescensdetektering med 405 nm excitation och 585-635 nm emission. Denna andra kanal kommer endast att detektera UAM, medan den första kanalen kommer att detektera antigenet av intresse plus lipofuscin. Använd ett gratisprogram som ImageJ, använd den här andra UAM-kanalen som en subtraktiv mask för att ta bort UAM-signalen från den första kanalen (som innehåller både antigensignalen och UAM-signalen). Använd spektral oblandning. De flesta moderna konfokalmikroskop innehåller ett spektralt blandningsalternativ. Detta gör att man kan förvärva spektrumet av ett prov med bara UAM och ett annat prov med bara den samfärgande fluoroforen av intresse. Det experimentella provet, som innehåller både UAM och samfärgningsfluoroforen, kan sedan förvärvas och utsättas för linjära oblandningsmetoder för att beräkna vilken procent av signalen som kom från autofluorescens kontra samfärgning.OBS: Omfattande guider för spektral blandning finns tillgängliga med de flesta moderna konfokalmikroskop. Använd fluorescens livstidsavbildning. Medan emissionsspektrumet mellan UAM och en samfärgningsfluorofor av intresse kan vara likartad, är det troligt att deras fluorescenslivslängd skiljer sig avsevärt. I allmänhet visar UAM kortare fluorescenslivslängd än de flesta specifika fluoroforer. Med tillgång till ett konfokalmikroskop som möjliggör livstidsavbildning kan man grinda fluorescenssignaler för att upptäcka de som är längre än den typiska lipofuscinlivslängden.OBS: I allmänhet minskar fluorescenslivslängden för grindar till signaler längre än 2 ns kraftigt UAM-kontaminering, även om det inte helt eliminerar signalen. Användning av en autofluorescenssuppressor. Traditionellt har Sudan Black använts för att släcka autofluorescens före specifik immunofluorescensfärgning35. Flera kommersiellt tillgängliga autofluorescens quencher produkter rapporterar att förbättra resultaten av Sudan Black, och dessa produkter beskrivs i materialförteckningen. Autofluorescenssläckning kommer naturligtvis att förstöra förmågan att detektera lipofuscin. Bestäm sammansättningen av lipofuscinliknande granulerBedöm neutrala lipiderFixa UAM-laddade RPE och kontrollbrunnar (matat obehandlat OS) i 4% PFA vid rumstemperatur i 15 minuter och tvätta med PBS 5x. Färga för neutrala lipider med antingen 10 μg/ml Nile Red eller 3,33 μg/ml Bodipy 493/503 i en 3% BSA PBS-lösning vid rumstemperatur i 1 h, följt av tvättning med PBS i 5 min 3x. Klipp ut och montera Transwell som i steg 2.3.1.2 och 2.3.1.3 och bilden. Använd i allmänhet följande excitations- och emissionsbandbredder för avbildning: Nile Red – ex 543 nm, em 620-700 nm och Bodipy 493/503 – ex 488 nm, em 500-550 nm. Bedöm förestrat och unesterifierat kolesterolFölj steg 2.3.3.1.1 Filipin är ett fluorescerande färgämne som känner igen oföresterifierat kolesterol, men inte förestrat kolesterol36. Således, för att bedöma mängden totalt kolesterol (oföresterifierat och förestrat) i UAM, förbehandla först provet med kolesterolesteras för att omvandla förestrat kolesterol till oföresterifierat kolesterol. Behandla cellerna med 20 E/ml kolesterolesteras i 0,1 M kaliumfosfatbuffert (pH 7,2) (se materialtabell) vid 37 °C i 3,5 timmar, följt av tvättning med PBS i 5 min 3x. Färga med 50 μg/ml filipin (se materialtabell) i PBS vid rumstemperatur i 1 h och tvätta med PBS i 5 min 3x. Håll proverna täckta, borta från ljus, eftersom filippinska fotobleker lätt.OBS: Om endast oförestrat kolesterol ska kvantifieras kan kolesterolesteras i steg 2.3.3.2.2 hoppas över. Om mängden förestrat kolesterol ska kvantifieras kan den härledas av skillnaden mellan det totala kolesterolet och det oförestrade kolesterolet i provet. Klipp ut och montera Transwell enligt steg 2.3.1.2 och 2.3.1.3 och bilden.OBS: Vid avbildning av filipin bleker den mycket snabbt. Man måste minimera intensiteten och varaktigheten av excitation, och förvänta sig att viss fotoblekning även kan uppstå med att titta på provet genom okular. Därför bör man vid avbildning: (1) söka efter ett lämpligt område att avbilda med hjälp av en annan fluorescenskanal än filippinkanalen, (2) avbilda filipin på ett bredfält snarare än konfokalmikroskop (för att begränsa ljusexponeringens intensitet) och (3) undvika upprepad avbildning av ett område. Använd i allmänhet följande excitations- och emissionsbandbredder för avbildning av filipin – ex 380 nm, em 480 nm. 3. Bedömning av effekter av lipofuscinliknande granuler på RPE-fagocytos: Total konsumtionskapacitet OBS: Motiveringen för att mäta OS-fagocytos via OS-pulsprotokollet nedan beskrivs i avsnittet representativa resultat. Metoden, som kallas “Total konsumptiv kapacitet”, undviker tvetydigheter om fagocytoseffektivitet som kan uppstå med traditionella OS-pulsjaktfagocytosanalyser. Analyser görs på Transwells 24-brunnsplattor med 50 μl media innehållande 4 x 106 OS/ml. Beräkna antalet brunnar som behövs för experimentet och tina sedan en lämplig mängd vanligt operativsystem, snurra ner vid 2400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och resuspendera i standard RPE-cellodlingsmedia till 4 x 106 OS / ml. Lägg till överbryggande ligander för att underlätta fagocytoshastigheter.OBS: Den slutliga koncentrationen av överbryggande ligander i mediet som ska matas med celler är 4 μg/ml för protein S och 1,5 μg/ml för MFG-E8. Såsom anges i steg 1.1.11 kan koncentrationerna av överbryggande ligander behöva ändras för andra RPE-typer eller celldensiteter. Ta bort apikala medier och tillsätt 50 μL 4 x 106 OS/ml, helst med lämpliga koncentrationer av överbryggande ligander. Vid olika tidpunkter efter tillsats av OS (t.ex. – 0 timmar, 1 timme, 4 timmar och 24 timmar) tillsätts 16,67 μL 4x Laemmli provbuffert med proteashämmare för att lysera båda cellerna och den överliggande OS-innehållande supernatanten. Använd en P-200-pipett för att repa Transwell-ytan, var försiktig så att du inte punkterar Transwell-membranet eller lossar membranet från Transwell och samlar ihop det kombinerade cellsupernatanten plus celllysatet. Vortex, snurra ner och låt stå i rumstemperatur i 30 minuter för grundlig denaturering.VARNING: Trots att du använder provbuffert för att lysera operativsystemet, värm inte upp lyslösningen därefter, eftersom detta kan utlösa rodopsinaggregering. Undvik också att kyla det lyserade operativsystemet tills det är klart för lagring, eftersom detta kommer att fälla ut protein. Frys oanvända lysater vid -20 °C och se till att lysaterna tinas helt före användning. Kör lysater på SDS PAGE med samma inställningar som i steg 1.3.3 och ladda lika stora volymer lysater per brunn. GAPDH, β-aktin eller annat hushållsprotein bör användas för att normalisera cellantalet, eftersom fagocytoshastigheten är beroende av cellantalet. Sond Western blottar med antikroppar mot antingen N- eller C-terminalen av rhodopsin. Använd vanliga västerländska blottningsförhållanden och antikroppsutspädningar listas i materialtabellen.OBS: Under huvudrodopsinbandet kommer det att finnas flera rodopsinfragment. Dessa fragment representerar delvis smält rhodopsin, en process som startar före fusion av fagosomen med lysosomen32,33. En ökning av antalet rodopsinfragment i UAM-belastad RPE jämfört med kontroll RPE kan indikera en nedströms defekt i fagolysosomkapacitet, vid nivån av fagosom-lysosomfusion, lysosomal försurning och / eller nedbrytande enzymfunktion 16,34,35.

Representative Results

Inställningen för fotooxidation av operativsystem visas i figur 1Ai. De polytetrafluoretylenbelagda objektglasen gör det möjligt att ladda en stor volym OS-lösning per öppen rektangel utan att sprida sig över resten av objektglaset. Bilden med OS finns i en steril petriskål med locket avstängt och en UV-lampa placeras över bilden som visas i figur 1Aii. Alternativt kan bilden placeras i en UV-tvärbindare, som visas i figur 1Aiii</…

Discussion

Medan RPE lipofuscin har studerats i årtionden, dess toxicitet diskuteras 2,9,16,42. Med tanke på tvetydighet om toxiciteten hos lipofuscin från djurmodeller¹¹ är in vitro-modeller som använder human RPE värdefulla. En rad in vitro lipofuscinackumuleringsmodeller har beskrivits, men ingen har använt både OS-utfodring och mycket mogna och differe…

Materials

100 mm cell culture dish	Corning	#353003	Others also work
24-well Transwells	Corning	#3470
Anti-LC3 antibody	Cell Signaling Technology	#4801S	1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4	Abcam	#5417	1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2	EnCor Biotech	MCA-B630	1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher	Biotium	#23007	TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher	Vector Laboratories	SP-8400	Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503	Life Technologies	D3922
Cholesterol esterase	Life Technologies	From A12216 kit
Confocal microscope	Leica	Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas	W. L. Lawson Company	Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected)	Contact information: https://wllawsoncompany.com/ (402) 499-3161 stacy@wllawsoncompany.com
Filipin	Sigma-Aldrich	F4767
Flow cytometer	Thermo Fisher	Attune NxT
Flow cytometer analysis software	BD	FlowJo
Handheld UV light	Analytik Jena US	UVGL-55
Human MFG-E8	Sino Biological	10853-H08B
Human purified Protein S	Enzyme Research Laboratories	HPS
Laemmli sample buffer	Thermo Fisher	J60015-AD
LDH assay	Promega	J2380	LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media	Invitrogen	P36930	Prolong Gold antifade reagent
Nile red	Sigma-Aldrich	#72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides	Tekdon	Customized	Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors	Cell Signaling Technology	#5872
Protein assay	Bio-Rad	#5000122 RC DC protein assay
TEER electrode	World Precision Instruments	STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter	World Precision Instruments	EVOM3
Ultraviolet crosslinker device	Analytik Jena US	UVP CL-1000