Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Förbättrade lipofuscinmodeller och kvantifiering av fagocytoskapacitet i yttre segmentet i högpolariserade humana retinala pigmentepitelkulturer

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Detta protokoll beskriver en lipofuscinackumuleringsmodell i mycket differentierade och polariserade humana retinala pigmentepiteliala (RPE) kulturer och en förbättrad fagocytosanalys i yttre segment (OS) för att detektera RPE: s totala förbrukning / nedbrytningskapacitet. Dessa metoder övervinner begränsningarna hos tidigare lipofuscinmodeller och klassiska pulsjaktsanalyser av yttre segmentfagocytos.

Abstract

Den dagliga fagocytosen av fotoreceptorns yttre segment av retinalpigmentepitelet (RPE) bidrar till ackumuleringen av ett intracellulärt åldringspigment som kallas lipofuscin. Toxiciteten av lipofuscin är väl etablerad i Stargardts sjukdom, den vanligaste ärftliga retinal degeneration, men är mer kontroversiell i åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), den främsta orsaken till irreversibel blindhet i den utvecklade världen. Att bestämma lipofuscintoxicitet hos människor har varit svårt, och djurmodeller av Stargardts har begränsad toxicitet. Således behövs in vitro-modeller som efterliknar human RPE in vivo för att bättre förstå lipofuscingenerering, clearance och toxicitet. Majoriteten av cellodlingslipofuscinmodeller hittills har varit i cellinjer eller har involverat matning av RPE en enda komponent i den komplexa lipofuscinblandningen snarare än fragment / spetsar av hela fotoreceptorns yttre segment, vilket genererar en mer komplett och fysiologisk lipofuscinmodell. Här beskrivs en metod för att inducera ackumulering av lipofuscinliknande material (benämnt osmältbart autofluorescensmaterial, eller UAM) i högdifferentierad primär human prenatal RPE (hfRPE) och inducerad pluripotent stamcellshärledd RPE (iPSC). UAM ackumuleras i kulturer genom upprepade matningar av ultraviolett ljusbehandlade OS-fragment som tas upp av RPE via fagocytos. De viktigaste sätten som UAM approximerar och skiljer sig från lipofuscin in vivo diskuteras också. Tillsammans med denna modell av lipofuscinliknande ackumulering introduceras avbildningsmetoder för att skilja det breda autofluorescensspektrumet av UAM-granuler från samtidig antikroppsfärgning. Slutligen, för att bedöma effekten av UAM på RPE-fagocytoskapacitet, har en ny metod för att kvantifiera upptag och nedbrytning av yttre segmentfragment / spetsar introducerats. Benämnd "Total konsumptiv kapacitet", denna metod övervinner potentiella feltolkningar av RPE-fagocytoskapacitet som är inneboende i klassiska yttre segment "pulsjakt" -analyser. De modeller och tekniker som introduceras här kan användas för att studera lipofuscingenerering och clearancevägar och förmodad toxicitet.

Introduction

Det retinala pigmentepitelet (RPE) ger kritiskt stöd för överliggande fotoreceptorer, inklusive det dagliga upptaget och nedbrytningen av fotoreceptorns yttre segmentspetsar eller fragment (i hela detta protokoll står förkortningen OS för OS-tips eller fragment snarare än hela yttre segment). Detta dagliga upptag i postmitotisk RPE överbelastar så småningom fagolysosomal kapacitet och leder till uppbyggnad av osmältbart, autofluorescerande intracellulärt material, kallat lipofuscin. Intressant nog har flera studier också visat att RPE lipofuscin kan ackumuleras utan OS fagocytos 1,2. Lipofuscin har många komponenter, inklusive tvärbundna addukter härrörande från visuell cykel retinoider, och kan uppta nästan 20% av RPE-cellvolymen för personer över 80 år3.

Huruvida lipofuscin är giftigt har diskuterats varmt. Stargardts sjukdom är en autosomal recessiv degeneration av fotoreceptorerna och RPE där en mutation i ABCA4 utlöser felaktig bearbetning av visuella cykelretinoider som finns i fotoreceptorns yttre segment. Felaktig retinoidbearbetning leder till avvikande tvärbindning och bildning av bis-retinoida arter, inklusive bis-retinoid N-retinyliden-N-retinyletanolamin (A2E). Studier har visat flera mekanismer för A2E-toxicitet 4,5. Lipofuscin bidrar till fundus autofluorescenssignaler under klinisk avbildning, och både Stargardts patienter och djurmodeller visar ökad fundus autofluorescens före retinal degeneration, vilket tyder på en korrelation mellan lipofuscinnivåer och toxicitet 6,7. Men med åldern ackumuleras lipofuscin hos alla människor utan att utlösa en RPE-degeneration. Vidare, i åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), där RPE-degeneration endast förekommer hos äldre patienter, har de med tidiga och mellanliggande former av sjukdomen mindre fundus autofluorescenssignaler än åldersmatchade icke-sjuka människor8. Dessa kliniska fynd har verifierats på histologisk nivå samt 9,10.

Djurmodeller av RPE lipofuscin ackumulering har också lämnat viss tvetydighet om lipofuscin toxicitet. ABCA4 knockout-musen visar inte retinal degeneration på en pigmenterad bakgrund, medan den gör det på en albinobakgrund eller när den utsätts för blått ljus11,12. Vidare skiljer sig toxiciteten hos lipofuscin härledd via ABCA4-knockout sannolikt från det långsammare ackumulerande lipofuscin som uppträder med naturligt åldrande, vilket ses i AMD13.

In vitro-modeller av lipofuscin ackumulering ger ett alternativ till att studera effekterna av lipofuscin ackumulering på RPE hälsa. Sådana modeller möjliggör manipulering av lipofuscinkomponenter, från matning av enstaka retinoidkomponenter till utfodring av OS, och tillåter studier i humant snarare än animaliskt RPE. Under de senaste decennierna har flera metoder utvecklats för att modellera RPE lipofuscin i kultur. Tillsammans med andra grupper matade Dr. Boultons grupp bovint OS dagligen i upp till tre månader vid passage 4 till 7 humana primära RPE-celler från givare i åldern 4 till 85 år14. Alternativt har hämning av autofagi också lett till lipofuscinackumulering i passagerna 3 till 7 primära humana RPE-kulturer15. Subletala lysosomala hämningar i mycket differentierade, passage 1, primära humana prenatala RPE-kulturer (hfRPE) misslyckades dock med att inducera lipofuscin, även med upprepad tillsats av OS dagligen16.

Som ett mer reduktionistiskt tillvägagångssätt har andra matat enstaka lipofuscinkomponenter till kulturer, särskilt bis-retinoid A2E 4,17. Sådana studier är värdefulla genom att de definierar potentiella direkta mekanismer för toxicitet för enskilda lipofuscinkomponenter, vilket exempelvis involverar lysosomalt kolesterol och ceramidhomeostas18. Samtidigt diskuteras toxiciteten hos A2E19, och att mata den direkt till celler kringgår den typiska vägen för lipofuscinackumulering, vilket involverar fagocytos av fotoreceptor OS. I ett försök att leverera alla komponenter av lipofuscin till RPE-kulturer, renade Boulton och Marshall lipofuscin från mänskliga ögon och matade detta till passage 4 till 7 mänskliga primära RPE-kulturer härrörande från både foster och äldre mänskliga donatorer20. Även innovativ, representerar denna metod en begränsad lipofuscin källa för upprepade experiment.

Medan upprepade matningar av OS till RPE-kulturer producerar lipofuscin i många system, misslyckas det med att göra det i mycket differentierade primära RPE-kulturer16. Fotooxiderande OS inducerar tvärbindningsreaktioner som bis-retinoidbildning som naturligt uppträder under lipofuscinbildning in vivo. Detta kan påskynda lipofuscinliknande granulbildning i RPE-odlingssystem, även de som är mycket differentierade och resistenta mot lipofuscinackumulering16. Här introduceras en metod för att inducera lipofuscinliknande granulatackumulering i högdifferentierad hfRPE och human iPSC-RPE, modifierad från Wihlmarks publicerade protokoll21. Denna metod har fördelen att inducera lipofuscinliknande granuler som använder samma källa (fotoreceptor OS) och väg (fagolysosomalt OS-upptag) som sker för lipofuscinogenes in vivo. Vidare görs det på humana RPE-kulturer som är mycket differentierade och validerade i flera studier för att replikera human RPE in vivo22,23,24. Dessa lipofuscinliknande granuler kallas osmältbart autofluorescerande material (UAM) och ger data och diskussion i detta protokoll som jämför UAM med in vivo lipofuscin. Tillsammans med metoder för att bygga och utvärdera UAM-laddade kulturer i högdifferentierad human RPE introduceras också en uppdaterad metod för att bedöma RPE OS-fagocytos. Flera utmärkta pulsjaktsmetoder för kvantifiering av OS-fagocytos har introducerats, inklusive Western blotting, immunocytokemi och FACS25,26,27. Men tidigt i OS-pulsjakten kan förhållanden som leder till dålig OS-upptagning blandas ihop med förhållanden som främjar snabb nedbrytning av internaliserat operativsystem. Metoden som presenteras här mäter den totala mängden introducerat operativsystem som helt förbrukas/försämras av RPE ("Total förbrukningskapacitet"), vilket hjälper till att eliminera denna tvetydighet. Det förväntas att insikter om lipofuscintoxicitet som använder dessa protokoll, inklusive effekter på OS-fagocytoshastigheter med hjälp av metoden "Total konsumtionskapacitet", kommer att användas för att belysa toxiciteten hos lipofuscin in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det nuvarande protokollet om förvärv och användning av mänsklig vävnad granskades och godkändes av University of Michigan Institutional Review Board (HUM00105486).

1. Beredning av fotooxiderade yttre segmentspetsar och fragment

OBS: Mörkanpassade bovina näthinnor köptes och skickades på is (se Materialförteckning). Från dessa näthinnor renades OS enligt ett tidigare publicerat protokoll23.

  1. Yttre segmenttvärbindning med UV-lampa
    1. Sänk ner polytetrafluoretylenbelagda glas (se materialförteckning) helt i 70% etanol i 10 minuter i ett biosäkerhetsskåp för att sterilisera objektglasen. Låt objektglasen lufttorka i en steril 100 mm cellodlingsskål.
    2. Placera varje glas i en ny 100 mm cellodlingsskål och tillsätt 200 μl seruminnehållande cellodlingssubstrat (oavsett vilket medium som vanligtvis används för de aktuella RPE-kulturerna) i varje rektangel och placera sedan ett handhållet 254 nm UV-ljus (se Materialförteckning) på 100 mm cellodlingsskålen (utan lock) med glödlampan direkt vänd mot glaset. och exponera i 20 min. De medier som specifikt används för denna studie och de specifika produktnumren för mediekomponenterna har tidigare publicerats22,23. Detta medium kallas "RPE-media" i hela detta protokoll.
      UV-behandling av mediet blockerar glasytan och förhindrar att OS fastnar under nästa steg.
    3. Tina frysta alikvoter av OS vid 37 °C (i handen eller via vattenbad). Mängden operativsystem som behövs beror på applikationen. I allmänhet kan man behandla upp till 500 μL 2 x 108 OS / ml per rektangel på bilden.
    4. När du har tinat, snurra operativsystemet vid 2400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Aspirera omedelbart supernatanten i biosäkerhetsskåpet med en pipett snarare än ett vakuum för att förhindra oavsiktlig förlust av pelleten.
    5. Resuspendera försiktigt pelleten med steril PBS.
      OBS: Håll koll på den återsuspenderade volymen och den förväntade koncentrationen. t.ex. återsuspendering av pelleten från ett 1 ml rör med 1 x 10 8 OS/ml med 500 μL PBS ger 2 x 108 OS/ml. Den maximala volymen och koncentrationen per rektangel på det polytetrafluoretylenbelagda objektglaset är 500 μl 2 x 108 OS/ml.
    6. Aspirera mediet från objektglasen och placera upp till 500 μl 2 x 108 OS/ml PBS-lösning på varje rektangel på objektglaset. Placera det handhållna UV-ljuset över cellodlingsskålen (utan lock) med glödlampan direkt vänd mot operativsystemet. Utsätt OS-lösningen för 254 nm ljus i 40 minuter.
      OBS: Under 40 minuters exponering, täck UV-lampan och skålen med en handduk eller absorberande dyna, stäng biosäkerhetsskåpets båge och stäng av fläkten. Detta förhindrar att någon betydande avdunstning uppstår. Om UV-lampan som används i detta protokoll inte är tillgänglig för en forskare finns det två alternativ för att säkerställa att lämplig mängd tvärbindning uppnås. Den första är att följa den kvantitativa UV-exponering som beskrivs i steg 1.2, antingen med den enhet som beskrivs i steg 1.2 eller en annan enhet som kan ge samma kvantitativa strålningsexponering som nämnda enhet i 1.2. Ett annat alternativ är att utsätta OS för UV-bestrålning under en tid som inducerar graden av tvärbindning på Coomassie-fläcken som ses i figur 1C.
    7. Samla upp den behandlade OS PBS-lösningen i sterila mikrocentrifugrör, tvätta om rektangeln på det belagda glaset med 200-500 μL PBS (2-3x) och samla varje tvätt i mikrocentrifugröret. När du är klar, titta på bilden under ett vävnadsodlingsrumsmikroskop för att bekräfta att nästan alla operativsystem har tagits bort från bilden.
    8. Snurra ned OS PBS-lösningen vid 2400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur, aspirera PBS i biosäkerhetsskåpet med en pipettor och återsuspendera i 500 μL standardmedia som ska användas för RPE-kulturer (t.ex. "RPE-media" som definieras i avsnitt 1.1.2). Resuspensionsvolymen kan justeras baserat på önskad fotooxiderad OS-koncentration (OxOS).
    9. Placera 10 μL av suspensionen i ett nytt mikrocentrifugrör, späd 50-100x med mer cellodlingsmedia och räkna OS med en hemocytometer.
    10. Baserat på antalet operativsystem, späd OxOS-suspensionen till en slutlig lagerkoncentration. För utfodring av högmogna RPE-kulturer i 24-brunns Transwells (yta på 0,33 cm 2; se materialtabell) rekommenderas en slutlig mediekoncentration på2 x 107 OS/ml.
      1. För att uppnå detta, fördela OxOS i 25 μL alikvoter vid en koncentration på 5,6 x 107 OS/ml, suspenderad i standard RPE-odlingsmedia. Efter upptining av en alikvot på 25 μl blandas hela alikvoten med 45 μl standardsubstrat för RPE-odling, vilket ger en slutlig medievolym på 70 μl och OS-koncentration på 2 x 107 OS/ml för varje OxOS Transwell-matning.
    11. Innan du alikvoterar OxOS, tillsätt fagocytos överbryggande ligander (Protein S och MFG-E8, se Materialtabell), vilket underlättar OS-upptag och lipofuscinackumulering. Arbetskoncentrationerna av överbryggande ligander i en Transwell med 24 brunnar är 4 μg/ml för humant renat protein S och 1,5 μg/ml för humant rekombinant MFG-E8. För 25 μl alikvoter av OxOS vid 5,6 x 107 OS/ml är lagerkoncentrationen för protein S 11,2 μg/ml och för MFG-E8 4,2 μg/ml.
      OBS: Överbryggningsligandkoncentrationerna optimerades för hfRPE-kulturer på 24-brunns Transwells, med ett ungefärligt cellantal på 320 000 celler per 0,33 cm2 brunn. Ligandkoncentrationerna kan behöva justeras för andra RPE-typer och celldensiteter eftersom ligander som förekommer utöver fagocytosreceptortillgängligheten paradoxalt nog kan blockera OS-upptag28.
    12. Snäppfrys alikvoterna i flytande kväve.
      OBS: Flera frys-tinningar är mycket skadliga för OS-integriteten.
  2. Yttre segmenttvärbindning med en UV-tvärbindningsanordning
    Följ steg 1.1, med undantag för stegen nedan, som ersätter steg 1.1.2 respektive 1.1.6:
    1. (ersätter steg 1.1.2) Placera varje glas i en ny 100 mm cellodlingsskål och tillsätt 200 μL seruminnehållande cellodlingsmedia (t.ex. "RPE-media" eller något annat substitut) i varje rektangel och placera sedan objektglas i en ultraviolett tvärbindningsanordning (se Materialförteckning) och behandla med 254 nm UV vid en strålningsexponering på 3-6 J/cm2 för att blockera glasytan och förhindra att OS fastnar under nästa steg.
    2. (ersätter steg 1.1.6) Aspirera mediet från objektglasen och placera upp till 500 μl 2 x 108 OS/ml i steril PBS på varje rektangel på objektglaset. Placera objektglas i enheten för ultraviolett tvärbindare, ställ in strålningsexponering efter behov (3-9 J/cm2) och behandla vid 254 nm.
      OBS: Den strålningsexponering som behövs kan bestämmas noggrant genom titrering av strålningsexponering mellan 3-9 J/cm2 tills graden av autofluorescens och proteintvärbindning (som ses i figur 1B och figur 1C) uppnås.
      VARNING: Hantering av OS utanför ett biosäkerhetsskåp kan leda till kontaminering. Efter exponering av OS för UV-tvärbindningsenheten, samla OS med sterila pipettspetsar, överför till sterila mikrocentrifugrör och hantera alla ytterligare steg i biosäkerhetshuven.
  3. Karakterisering av oxiderat OS
    1. Kvantifiera autofluorescensemissionsspektrum genom avbildning
      1. Placera 20–50 μl stamlösning från obehandlat operativsystem och OxOS i två separata mikrocentrifugrör. Centrifugera vid 2400 x g i 5 min vid rumstemperatur, resuspendera pellets i buffrad (t.ex. PBS) 4% paraformaldehyd och fixera i 15 minuter vid rumstemperatur.
      2. Efter fixering, snurra nedåt enligt ovan, tvätta med PBS x 2 (snurra ner mellan tvättarna) och återsuspendera sedan i mindre än 30 μl PBS.
      3. Placera några mikroliter av resuspensionen på ett mikroskopglas, tillsätt monteringsmedia (se materialförteckning) och slutligen ett täckglas.
      4. Bild OxOS på ett konfokalmikroskop (se materialförteckning).
        OBS: OxOS autofluorescens kan exciteras av ett brett spektrum av laservåglängder, men en 405 nm eller 488 nm laserlinje används vanligtvis. Emissionen är lika bred, men en typisk GFP / FITC-excitations- / emissionsfilterinställning är tillräcklig för att se autofluorescens.
      5. För att mäta OxOS-emissionsspektrumet, använd λ-skanning på ett konfokalmikroskop. Typiska λ-skanningsinställningar inkluderar excitation med 405 nm eller 488 nm och detektering av emission som sträcker sig från 10 nm rödförskjuten från laserexcitationslinjen hela vägen till cirka 800 nm, med en λ-stegstorlek på 10 nm. Varje mikroskopisystem har sina egna anvisningar om hur man använder λ-läget, och läsaren måste hänvisa till manualen för deras specifika konfokala.
    2. Som ett alternativ, kvantifiera autofluorescens genom flödescytometri.
      1. Snurra ner 2 x 10 7 obehandlat OS och separat 2 x 107 OxOS i mikrocentrifugrör och resuspendera i 1 ml PBS.
        OBS: Fixering krävs inte om flödescytometri utförs direkt efter upptining.
      2. Ladda obehandlade OS- och OxOS-prover på flödescytometer (se materialtabell). Justera forward scatter (FSC) och side scatter (SSC) till ett acceptabelt uppslag i FSC-SSC-spridningsdiagrammet. Använd PBS som en kontroll för att utesluta förorenande små partiklar. Observera att OS är betydligt mindre än celler.
      3. Använd flödescytometerns standard FITC-kanal för autofluorescenskvantifiering. Räkna minst 10 000 händelser. Använd FITC-histogrammets pulsområdesvärde för att representera fluorescensintensitet.
        OBS: För den aktuella studien analyseras alla data med hjälp av programvara för flödescytometeranalys (se materialförteckning), enligt tillverkarens instruktioner.
    3. Bedöma graden av tvärbindning i OxOS
      1. Snurra ner 2 x 10 7 obehandlat OS och separat 2 x 107 OxOS i mikrocentrifugrör. Ta bort supernatanten och lyse pelletsen direkt genom att tillsätta 1,2x Laemmli provbuffert (tillräckligt för att täcka; se materialförteckning). Vortex, håll vid rumstemperatur i 30 minuter, snurra ner vid rumstemperatur vid lika med eller större än 12000 x g i 10 minuter och samla supernatant.
        OBS: Bedömning av graden av proteintvärbindning i OxOS ger en känsla av UV-behandlingens tillräcklighet. Jämförelse görs mellan obehandlad OS och OxOS, och adekvat tvärbindning sker när det monomera rodopsinbandet som dominerar Coomassie-färgningen (figur 1C, pil) är bara märkbart, med framväxt av högre ordningsaggregat och ett proteinutstryk på toppen av gelén.
        VARNING: När du använder provbuffert för att lysera operativsystemet, värm inte upp lyslösningen därefter, eftersom detta kan utlösa rodopsinaggregering. Undvik också att kyla det lyserade operativsystemet tills det är klart för lagring, eftersom detta kommer att fälla ut SDS. Oanvända lysater kan förvaras vid -20 °C. Vid rethawing, se till att lysaterna är helt tinade vid rumstemperatur före användning.
      2. Kvantifiera proteinkoncentrationen med hjälp av en proteinanalys som är tolerant mot höga SDS och reduktionskoncentrationer29. Se Materialförteckning för förslag på lämpliga proteinanalysreagenser och följ tillverkarens protokoll för dessa reagens.
      3. Kör obehandlade OS- och OxOS-prover med SDS-PAGE-elektrofores30 på en 4% -15% gradientgel, med standard tris-glycin SDS-buffert. Gel körs vid 80 V tills prover kommer in i stapeln, sedan vid 120 V i 50-60 min vid rumstemperatur.
      4. Färga gelen med Coomassie-blå med standardprotokoll31. Coomassie-färgningen kommer att visa tillräckligheten av tvärbindning inducerad av UV-behandling.

2. Bygga lipofuscinliknande granuler (UAM) i RPE-kulturer

  1. OxOS-matningar: mängd, frekvens och fagocytos överbryggande ligander
    OBS: Matningar sker på humana iPSC-RPE- eller hfRPE-kulturer vid passage 1, odlade enligt protokollet som beskrivs av Bharti-laboratoriet (för iPSC-RPE)32 eller vårt tidigare skisserade protokoll för hfRPE, anpassat från Sheldon Miller-labbet22,23. Alla beräkningar nedan är baserade på matning av OxOS eller OS till en 24-brunns Transwell (6,5 mm diameter, 0,33 cm2 tillväxtområde).
    1. Tina 25 μl 5,6 x 107 OxOS/ml vid 37 °C och tillsätt 45 μl cellodlingsmedia till OxOS-alikvoten, vilket resulterar i en slutlig volym på 70 μl.
      OBS: OxOS alikvoter beredda i steg 1 kommer att innehålla fagocytos överbryggande ligander MFG-E8 och Protein S. Om dessa ligander inte tillsattes till alikvoterna före nedfrysningen kan de emellertid tillsättas i detta steg, vilket säkerställer att den slutliga koncentrationen av liganderna i de medier som ska matas med cellerna är 4 μg/ml för protein S och 1,5 μg/ml för MFG-E8. Såsom anges i steg 1.1.11 kan koncentrationerna av överbryggande ligander behöva ändras för andra RPE-typer eller celldensiteter.
    2. Ta bort apikala medier från Transwell och tillsätt 70 μl 2 x 107 OxOS/ml med fagocytos som överbryggar ligander till apikalkammaren. Efter 24 timmar, ta bort och byt ut med en ny OxOS-matning. Matning sker dagligen under vardagar, hoppar över helger, tills 20 matningar är färdiga (~ 1 månad). Ändra basolaterala cellodlingsmedier (400-550 μL) 2-3x/vecka.
    3. Efter avslutad 20 matningar, återuppta normala medieförändringar för brunnen.
      OBS: Det tar flera ytterligare medieändringar för att tvätta bort klibbiga OxOS från RPE-apikalytan, så experiment med UAM-laddade kulturer måste göras minst 1-2 veckor efter att OxOS-matningen avslutats.
      VARNING: Det är viktigt att ha ordentliga kontroller för UAM-uppbyggnad via OxOS-matningar. Eftersom dagliga medieförändringar kan påverka RPE-biologin rekommenderas följande kontrollbrunnar: Kontroll 1: Byt ut media dagligen under vardagar för samma antal matningar som OxOS-behandlade gruppen. Kontroll 2: Mata RPE obehandlat OS dagligen under vardagar i samma koncentration och volym som OxOS-matning, för samma antal matningar.
  2. Övervakning av hälsan hos kulturer lastade med lipofuscinliknande granulat genom transepitelial elektrisk resistans (TEER) och celldödsanalyser
    OBS: Under och efter OxOS-matning kan hälsan hos RPE-kulturer mätas genom att bedöma RPE-täthetsintegritet och celldöd. Det har tidigare visats att bedömning av täthetstäthet, genom mätning av transepitelialt elektriskt motstånd (TEER), är en känslig markör för allmän cellhälsa33. Mer traditionella icke-invasiva markörer för celldöd, såsom frisättning av laktatdehydrogenas (LDH), kan också användas.
    1. Utför TEER
      OBS: TEER testas med en transepitelial elektrisk motståndsmätare (TEER) och TEER-elektrod, vanligtvis enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning).
      1. För att sterilisera TEER-elektroden, använd en arbetstorkare indränkt i 70% etanol för att rengöra elektroden och sänk sedan ner elektrodsondens spetsar i 70% etanol i 10 minuter.
      2. Låt elektroden torka helt och sänk sedan ner elektroden i sterila medier.
      3. Ta bort sonden från sterila medier och sätt in TEER-elektrodens två sonder i de apikala och basolaterala kamrarna i en odlad Transwell; Den längre sondspetsen passar in i den basolaterala kammaren.
        OBS: Det är lätt att skrapa botten av apikalkammaren med TEER-elektroden utan övning, och sådan skrapning kommer dramatiskt att förändra TEER-avläsningarna när det sammanflytande RPE-monolagret störs. Därför rekommenderas att nybörjare övar på icke-viktiga Transwells innan de testar experimentella RPE-kulturer. Vidare, efter att varje platta av RPE-kulturer har testats, bör experimentet kontrollera om det finns någon skrapning av RPE-monolagret under ett standardvävnadsodlingsmikroskop.
      4. När de apikala och basolaterala sonderna är på plats i Transwell, tryck på läsknappen eller steg på mätarens fotbrytare för att registrera TEER. Tvätta elektrodsonden med sterila medier mellan plattor eller grupper av celler. Om infektion är en stor oro, sterilisera om mellan plattorna.
      5. Beräkna TEER genom att ta motståndsavläsningen från mätaren, subtrahera värdet på en tom Transwell med media men inga celler (vanligtvis 100-110 Ω för en 24-brunns Transwell med 0,33 cm2 yta) och multiplicera sedan med Transwells yta.
        OBS: TEER-värden måste rapporteras normaliserade till cellytan. Typiska värden för friska hfRPE-kulturer varierar från 350-1100 Ωcm2. TEER-värdena ökar när temperaturen sjunker. Således, när man tar bort kulturer från en 37 ° C inkubator till en rumstemperaturhuv, tenderar TEER-värdena att öka över plattan. För att skydda mot denna variation, arbeta antingen snabbt (om det upplevs) eller vänta i 10-15 minuter tills platttemperaturen balanserar med rumstemperaturen.
    2. Utför LDH-frisättningsanalys
      OBS: Frisättning av LDH till cellodlingssupernatant sker under celldöd och mäts med ett standardkit (se materialtabell).
      1. Samla upp supernatanten ovanför cellerna efter en 24 timmars inkubation och späd till 1:100 med standardmedia.
      2. Inducera total möjlig LDH-frisättning, vilket är viktigt för normalisering av alla värden från steg 2.2.2.1, genom tillsats av 2 μL 10% triton X-100 till 100 μL apikala medier från kontrollceller i en 24-brunns Transwell. Efter inkubation av supernatantblandningen triton/cell i 15 minuter vid 37 °C, blanda mediet ovanför de nu lyserade cellerna och samla in för att mäta total möjlig LDH-frisättning.
      3. När supernatanterna har samlats in, utför analysen med tillverkarens standardinstruktioner och mät luminiscensen efter en 30 minuters inkubation med hjälp av satsens buffertlösning.
        OBS: Alla LDH-värden normaliseras till den totala möjliga mängden LDH-frisättning.
  3. Karakterisering av lipofuscinliknande granulspektrum och sammansättning
    1. Förvärva autofluorescenskvantifiering och spektra
      1. Fixa UAM-laddade kulturer med 4% PFA vid rumstemperatur i 15 minuter, följt av PBS-tvätt 5x.
      2. Håll en liten mängd PBS i apikalkammaren och vänd sedan Transwell upp och ner. Använd ett dissekerande mikroskop och ett rakblad, skär det halvporösa membranet från Transwell och applicera skärkraft vid korsningen mellan membranet och Transwell.
        OBS: Håll dig konsekvent om hur nära Transwells läpp snittet görs, eftersom Transwell-membranet har en tendens att skrynklas och skrynklas när snitten inte är konsekventa.
      3. När Transwell-membranet har skurits, placera omedelbart på ett mikroskopglas med pincett, var försiktig så att du undviker att vidröra delar av Transwell-membranet med celler. Transportera bort överflödig PBS med en uppgiftstorkning, samtidigt som du undviker att röra cellerna. Lägg till monteringsmedia och ett täckglas. Se till att hålla reda på vilken sida av Transwell som är "höger sida upp" när du täcker Transwell.
      4. Samla in autofluorescerande intensitet och spektra med samma inställningar och procedurer som steg 1.3.1.4 och steg 1.3.1.5.
        OBS: Vid avbildning av UAM är en viktig förvirring att OxOS är autofluorescerande och ofta håller fast vid RPE-apikalytan i dagar och ibland till och med veckor efter avslutad OxOS-matning. Som ett resultat, vid kvantifiering av UAM, måste en metod användas för att säkerställa att uppmätt autofluorescens kommer från UAM och inte OxOS. Den enklaste metoden är att samfärga lipofuscinkulturer med en rhodopsinantikropp. Till exempel kan anti-rhodopsinantikropp 4D2 användas vid en 1: 1000 utspädning och med ett standard PFA-fixeringsimmunocytokemiprotokoll34. Den sekundära antikroppen för rodopsin bör vara en långröd färgkonjugerad antikropp (t.ex. med en excitationsmaxima nära 647 nm), eftersom UAM och OxOS autofluorescens tenderar att vara svagast i denna våglängd. Konfokala bilder kan sedan förvärvas sekventiellt i två kanaler, spännande UAM- och OxOS-autofluorescens med en 405 nm laser och emission från 415 nm till 550 nm, medan kvarvarande rodopsin, som indikerar osmält OxOS, kan exciteras med standard långröda färgämnesavbildningsparametrar i en separat kanal. Efter förvärvet kan rhodopsinkanalen användas som en subtraktiv mask i ett program som ImageJ för att avlägsna autofluorescens som kommer från klibbiga återstående OxOS, vilket lämnar efter sig bara UAM-autofluorescens att kvantifiera.
        VARNING: Även operativsystem som inte är fotooxiderade visar viss autofluorescens, och även med noggrann tvätt fastnar vissa operativsystem och OxOS på RPE-ytan. Således, utan att generera en subtraktiv mask med användning av rodopsinimmunfärgning, som föreslagits i ovanstående OBS, är noggrann kvantifiering av UAM-autofluorescensnivåer i kulturer som matas med OxOs eller standard OS inte möjlig.
    2. Utföra samtidig detektion av lipofuscinliknande granulat och andra immunofluorescensmarkörer
      OBS: Som beskrivs i steg 2.3.1 begränsar lipofuscinets breda autofluorescensspektrum valet för fluorescens samfärgning. Följande metoder kan övervägas för att underlätta samfärgning.
      1. Använd en långröd fluorofor. Autofluorescens från lipofuscin är svag i närheten av infraröd. Således kan användning av ett långrött färgämne för fluorescensdetektion av ett antigen av intresse, kombinerat med noggranna justeringar av kanalinställningar på ett konfokalmikroskop, vanligtvis skilja autofluorescens från samfärgningsfluorescens.
      2. Dra nytta av lipofuscins långa fluorescensemissionssvans.
        OBS: Eftersom lipofuscin har ett mycket brett fluorescensemissionsspektrum kan det ofta exciteras vid en låg nm-våglängd (t.ex. 405 nm laser) och ha emission fortfarande detekterad i den orange / röda delen av spektrumet (t.ex. 585-635nm). Denna unika kombination av excitations- och emissionsvåglängder kan ofta skräddarsys runt en annan samfärgande fluorofor.
        1. Detektera antigenet av intresse med hjälp av en fluorofor som har toppexcitation runt 488 nm, med emissionsdetektering vid 500-530 nm. Ställ in en separat kanal för autofluorescensdetektering med 405 nm excitation och 585-635 nm emission. Denna andra kanal kommer endast att detektera UAM, medan den första kanalen kommer att detektera antigenet av intresse plus lipofuscin.
        2. Använd ett gratisprogram som ImageJ, använd den här andra UAM-kanalen som en subtraktiv mask för att ta bort UAM-signalen från den första kanalen (som innehåller både antigensignalen och UAM-signalen).
      3. Använd spektral oblandning. De flesta moderna konfokalmikroskop innehåller ett spektralt blandningsalternativ. Detta gör att man kan förvärva spektrumet av ett prov med bara UAM och ett annat prov med bara den samfärgande fluoroforen av intresse. Det experimentella provet, som innehåller både UAM och samfärgningsfluoroforen, kan sedan förvärvas och utsättas för linjära oblandningsmetoder för att beräkna vilken procent av signalen som kom från autofluorescens kontra samfärgning.
        OBS: Omfattande guider för spektral blandning finns tillgängliga med de flesta moderna konfokalmikroskop.
      4. Använd fluorescens livstidsavbildning. Medan emissionsspektrumet mellan UAM och en samfärgningsfluorofor av intresse kan vara likartad, är det troligt att deras fluorescenslivslängd skiljer sig avsevärt. I allmänhet visar UAM kortare fluorescenslivslängd än de flesta specifika fluoroforer. Med tillgång till ett konfokalmikroskop som möjliggör livstidsavbildning kan man grinda fluorescenssignaler för att upptäcka de som är längre än den typiska lipofuscinlivslängden.
        OBS: I allmänhet minskar fluorescenslivslängden för grindar till signaler längre än 2 ns kraftigt UAM-kontaminering, även om det inte helt eliminerar signalen.
      5. Användning av en autofluorescenssuppressor. Traditionellt har Sudan Black använts för att släcka autofluorescens före specifik immunofluorescensfärgning35. Flera kommersiellt tillgängliga autofluorescens quencher produkter rapporterar att förbättra resultaten av Sudan Black, och dessa produkter beskrivs i materialförteckningen. Autofluorescenssläckning kommer naturligtvis att förstöra förmågan att detektera lipofuscin.
    3. Bestäm sammansättningen av lipofuscinliknande granuler
      1. Bedöm neutrala lipider
        1. Fixa UAM-laddade RPE och kontrollbrunnar (matat obehandlat OS) i 4% PFA vid rumstemperatur i 15 minuter och tvätta med PBS 5x.
        2. Färga för neutrala lipider med antingen 10 μg/ml Nile Red eller 3,33 μg/ml Bodipy 493/503 i en 3% BSA PBS-lösning vid rumstemperatur i 1 h, följt av tvättning med PBS i 5 min 3x.
        3. Klipp ut och montera Transwell som i steg 2.3.1.2 och 2.3.1.3 och bilden. Använd i allmänhet följande excitations- och emissionsbandbredder för avbildning: Nile Red - ex 543 nm, em 620-700 nm och Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Bedöm förestrat och unesterifierat kolesterol
        1. Följ steg 2.3.3.1.1
        2. Filipin är ett fluorescerande färgämne som känner igen oföresterifierat kolesterol, men inte förestrat kolesterol36. Således, för att bedöma mängden totalt kolesterol (oföresterifierat och förestrat) i UAM, förbehandla först provet med kolesterolesteras för att omvandla förestrat kolesterol till oföresterifierat kolesterol. Behandla cellerna med 20 E/ml kolesterolesteras i 0,1 M kaliumfosfatbuffert (pH 7,2) (se materialtabell) vid 37 °C i 3,5 timmar, följt av tvättning med PBS i 5 min 3x.
        3. Färga med 50 μg/ml filipin (se materialtabell) i PBS vid rumstemperatur i 1 h och tvätta med PBS i 5 min 3x. Håll proverna täckta, borta från ljus, eftersom filippinska fotobleker lätt.
          OBS: Om endast oförestrat kolesterol ska kvantifieras kan kolesterolesteras i steg 2.3.3.2.2 hoppas över. Om mängden förestrat kolesterol ska kvantifieras kan den härledas av skillnaden mellan det totala kolesterolet och det oförestrade kolesterolet i provet.
        4. Klipp ut och montera Transwell enligt steg 2.3.1.2 och 2.3.1.3 och bilden.
          OBS: Vid avbildning av filipin bleker den mycket snabbt. Man måste minimera intensiteten och varaktigheten av excitation, och förvänta sig att viss fotoblekning även kan uppstå med att titta på provet genom okular. Därför bör man vid avbildning: (1) söka efter ett lämpligt område att avbilda med hjälp av en annan fluorescenskanal än filippinkanalen, (2) avbilda filipin på ett bredfält snarare än konfokalmikroskop (för att begränsa ljusexponeringens intensitet) och (3) undvika upprepad avbildning av ett område. Använd i allmänhet följande excitations- och emissionsbandbredder för avbildning av filipin - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Bedömning av effekter av lipofuscinliknande granuler på RPE-fagocytos: Total konsumtionskapacitet

OBS: Motiveringen för att mäta OS-fagocytos via OS-pulsprotokollet nedan beskrivs i avsnittet representativa resultat. Metoden, som kallas "Total konsumptiv kapacitet", undviker tvetydigheter om fagocytoseffektivitet som kan uppstå med traditionella OS-pulsjaktfagocytosanalyser. Analyser görs på Transwells 24-brunnsplattor med 50 μl media innehållande 4 x 106 OS/ml.

  1. Beräkna antalet brunnar som behövs för experimentet och tina sedan en lämplig mängd vanligt operativsystem, snurra ner vid 2400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och resuspendera i standard RPE-cellodlingsmedia till 4 x 106 OS / ml. Lägg till överbryggande ligander för att underlätta fagocytoshastigheter.
    OBS: Den slutliga koncentrationen av överbryggande ligander i mediet som ska matas med celler är 4 μg/ml för protein S och 1,5 μg/ml för MFG-E8. Såsom anges i steg 1.1.11 kan koncentrationerna av överbryggande ligander behöva ändras för andra RPE-typer eller celldensiteter.
  2. Ta bort apikala medier och tillsätt 50 μL 4 x 106 OS/ml, helst med lämpliga koncentrationer av överbryggande ligander.
  3. Vid olika tidpunkter efter tillsats av OS (t.ex. - 0 timmar, 1 timme, 4 timmar och 24 timmar) tillsätts 16,67 μL 4x Laemmli provbuffert med proteashämmare för att lysera båda cellerna och den överliggande OS-innehållande supernatanten. Använd en P-200-pipett för att repa Transwell-ytan, var försiktig så att du inte punkterar Transwell-membranet eller lossar membranet från Transwell och samlar ihop det kombinerade cellsupernatanten plus celllysatet. Vortex, snurra ner och låt stå i rumstemperatur i 30 minuter för grundlig denaturering.
    VARNING: Trots att du använder provbuffert för att lysera operativsystemet, värm inte upp lyslösningen därefter, eftersom detta kan utlösa rodopsinaggregering. Undvik också att kyla det lyserade operativsystemet tills det är klart för lagring, eftersom detta kommer att fälla ut protein. Frys oanvända lysater vid -20 °C och se till att lysaterna tinas helt före användning.
  4. Kör lysater på SDS PAGE med samma inställningar som i steg 1.3.3 och ladda lika stora volymer lysater per brunn. GAPDH, β-aktin eller annat hushållsprotein bör användas för att normalisera cellantalet, eftersom fagocytoshastigheten är beroende av cellantalet.
  5. Sond Western blottar med antikroppar mot antingen N- eller C-terminalen av rhodopsin. Använd vanliga västerländska blottningsförhållanden och antikroppsutspädningar listas i materialtabellen.
    OBS: Under huvudrodopsinbandet kommer det att finnas flera rodopsinfragment. Dessa fragment representerar delvis smält rhodopsin, en process som startar före fusion av fagosomen med lysosomen32,33. En ökning av antalet rodopsinfragment i UAM-belastad RPE jämfört med kontroll RPE kan indikera en nedströms defekt i fagolysosomkapacitet, vid nivån av fagosom-lysosomfusion, lysosomal försurning och / eller nedbrytande enzymfunktion 16,34,35.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inställningen för fotooxidation av operativsystem visas i figur 1Ai. De polytetrafluoretylenbelagda objektglasen gör det möjligt att ladda en stor volym OS-lösning per öppen rektangel utan att sprida sig över resten av objektglaset. Bilden med OS finns i en steril petriskål med locket avstängt och en UV-lampa placeras över bilden som visas i figur 1Aii. Alternativt kan bilden placeras i en UV-tvärbindare, som visas i figur 1Aiii. Efter fotooxidation ökar OS autofluorescens signifikant, vilket bedöms med både mikroskopi och flödescytometri (figur 1B). Graden av proteintvärbindning efter fotooxidation kan bedömas med SDS-PAGE med en Coomassie-fläck, som visas som en omvandling av det dominerande proteinbandet (monomera rhodopsin) till högre ordningsaggregat och utstryk (figur 1C). Jämförelse av fotooxidation med en handhållen UV-lampa (figur 1Aii) jämfört med UV-tvärbindaranordningen (figur 1Aiii) visar att den handhållna UV-lampan producerar OxOS med lika mycket autofluorescens som en 3 J/cm2-behandling från UV-tvärbindningsanordningen (figur 1B) och lika mycket proteintvärbindning som en 6 J/cm2-behandling från UV-tvärbindaranordningen (figur 1C). Om UV-lampan som är tillgänglig för en forskare skiljer sig från den som används i detta protokoll, föreslår vi att man titrerar exponeringstiden för att uppnå en nivå av tvärbindning som ses i UV-lampbanan i figur 1C. Autofluorescensspektrumet för OxOS är milt blåförskjutet jämfört med spektrumet för obehandlat OS, både i den proteinisolerade fraktionen av OS och den lipidisolerade fraktionen av OS16.

Mängden UAM-uppbyggnad i RPE-kulturer beror på antalet OxOS-matningar (figur 2A), och 20 matningar under cirka 4 veckor ger en robust mängd UAM-ackumulering. För att skilja UAM-autofluorescens från autofluorescens av kvarvarande OxOS som förblir fast på RPE-apikalytan även dagar till veckor efter tvätt, fläckar vi med en rodopsinantikropp, detekterad med ett långrött färgämne. Genom att använda denna rhodopsinfluorescenskanal som en mask kan vi subtrahera ut OxOS autofluorescens från UAM-kanalen, vilket säkerställer att vi verkligen kvantifierar autofluorescens från UAM endast16. Med hjälp av färgningsprotokoll som beskrivs ovan har ackumulerad UAM i denna modell rikliga neutrala lipider, enligt bedömning av Nile Red färgning16, liknande inhemsk lipofuscin. Vi finner emellertid liten eller ingen förestrad eller oförestrad kolesterolackumulering (figur 2B), vilket överensstämmer med bristen på kolesterolackumulering vi ser i inbyggt lipofuscin från friska ögon (data visas inte).

Att följa fluorescerande markörer av intresse samtidigt med lipofuscin autofluorescens är svårt, med tanke på lipofuscins mycket breda fluorescensemissionsspektrum. I metodavsnittet ovan beskrivs flera metoder för att lösa detta problem. Metoden som beskrivs i steg 2.3.2.1 ovan utnyttjar den låga autofluorescensemissionsintensiteten för lipofuscin i fjärrrött. I figur 2Ci bedöms samlokaliseringen av UAM och autofagimarkören LC3 genom färgning av LC3 med ett Alexa 647-färgämne. Trots viss genomblödning av UAM i LC3-kanalen är det uppenbart var lipofuscin och LC3 finns i dessa bilder. I den metod som beskrivs i steg 2.3.2.2 ovan möjliggör lipofuscins mycket långa fluorescensemissionsspektra design av en emissionskanal som endast innehåller fluorescens från lipofuscin. I figur 2Cii exciteras UAM med en 488 nm laser, medan emission detekteras vid både 500-535 nm och vid 600-645 nm. Provet samfärgas med LC3, detekterat med Alexa 488-färgämne. Alexa 488-kanalen (excitation: 488 nm, emission: 500-535 nm) innehåller både LC3- och UAM-signal. Den andra kanalen, med 488 nm excitation och 600-645 nm emission, innehåller emellertid endast UAM. Denna andra kanal kan användas som en mask, applicerad på Alexa 488 / LC3-kanalen, för att subtrahera ut oönskad UAM-signal från LC3-signalen. I den metod som beskrivs i steg 2.3.2.4 ovan tillåter den kortare fluorescenslivslängden för autofluorescerande lipofuscin att skilja lipofuscin från samfärgningsfluorescens. I figur 2Ciii elimineras alla fluorescenssignaler som anländer till en fotonräknande detektor före 2 ns, vilket stänger ut mycket av UAM-autofluorescenssignalen samtidigt som samfärgningssignalen från LC3 till stor del bevaras. En kombination av metoder kan vara nödvändig för att skilja lipofuscin från samfärgningsfluorescens om det finns en stark samlokalisering av lipofuscin och samfärgningsfluorofor.

Eftersom flera studier har postulerat en inverkan av RPE-lipofuscinackumulering på OS-fagocytoshastigheter 5,36,37,38,39, utvärderades OS-fagocytoskapacitet i UAM-laddade kulturer. Typiska fagocytosanalyser involverar en kort inkubation av celler med OS ("puls") följt av tvättning av obundet operativsystem och ersättning av media utan OS under en "jakt" -period. Under jakten, när OS försämras, finns det en förlust av rhodopsin, det vanligaste proteinet i OS, inom RPE. Vid olika tidpunkter under jakten avlägsnas det OS-fria mediet, följt av celllys och SDS-PAGE för rodopsin kvar inom RPE-lysaterna. Men eftersom OS-pulsperioden består av både upptag och nedbrytning av OS, kan RPE med högt upptag och nedbrytning ("fagocytoseffektiva" celler) ha samma rodopsinnivåer tidigt i jaktperioden som RPE med lågt upptag och nedbrytning ("fagocytos ineffektiva" celler). Detta representeras schematiskt i studien av Zhang et al23. För att övervinna denna tvetydighet användes en "endast puls" -analys här. I den här metoden pulseras OS på RPE men tvättas inte bort. Vid olika tidpunkter efter OS-tillsats samlas media och celllysat ihop. Mediet innehåller osmält OS och celllysatet innehåller en kombination av intakt OS på cellytan, delvis smält OS som har internaliserats och fullständigt smält OS som framgångsrikt har tagit sig igenom lysosomen. Som en kontroll exponeras celler för OS men sedan samlas celllysatet och OS-innehållande supernatant omedelbart. Denna kontroll avslöjar hur mycket totalt rodopsin som infördes i cellerna. Eftersom lysat plus supernatant samlas in vid olika punkter efter OS-introduktion kan man bedöma för vilken andel av den totala rodopsinsignalen som har försvunnit, med detta som en markör för mängden av alla införda/startande OS som nu är helt nedbrutna. Avläsningen för denna analys kallas "Total förbrukningskapacitet", eftersom den noggrant mäter all OS-nedbrytning och inte är föremål för de förvirrande tolkningarna av ett pulsjaktexperiment som beskrivs ovan.

Figur 3A och kompletterande figur 1 visar en Western blot av kvarvarande rodopsin med hjälp av testet Total Consumptive Capacity. Mängden OS som matas till celler mäts av rhodopsinbandet vid 0 timmar. Huvudrodopsinbandet bryts ned med samma effektivitet mellan kontrollproverna och UAM-laddade RPE-prover (enkelpil vid 4 timmar och 24 timmar). Det finns dock en skillnad mellan grupperna när man tittar på delvis nedbrutna fragment av rhodopsin, som förekommer under huvudrodopsinbandet. Skillnaderna i fragmentöverflöd innebär minskad lysosomal kapacitet i UAM-gruppen, eftersom proteolytiskt klyvda fragment av rodopsin snabbt bör brytas ned med normal lysosomal funktion. Ökad överflöd av dessa fragment utan ökat överflöd av det huvudsakliga rodopsinfragmentet tyder på mer subtila defekter i lysosomal nedbrytande kapacitet i UAM-laddade kulturer. Tidigare studier har föreslagit att lipofuscin verkligen kan inducera defekter i OS-fagocytos44, men ingen tidigare studie har undersökt effekterna av lipofuscin specifikt på rodopsinfragment, vilket möjliggör en mer exakt precisering av dysfunktionen till slutstadierna av fagolysosomal nedbrytning. Figur 3B visar Western blotting av huvudrodopsinbandet plus rodopsinfragment med användning av två olika anti-rhodopsinantikroppar. Antikropp 4D2 känner igen Rodopsins N-terminal, och N-terminala fragment är den sista delen av rodopsin som bryts ned i lysosomen. Däremot känner antikropp 1D4 igen C-terminalen för rhodopsin, som bryts ned redan före fagosom-lysosomfusion. Således ger förståelse av vilka fragment fläckar med vilken antikropp en känsla av rhodopsinbearbetningsdefekter som är pre-lysosomala kontra lysosomala 32,40,41.

Figure 1
Figur 1: Behandling och karakterisering av fotooxiderat yttre segment (OxOS). a ) Avbildning av totalöverlevnad på ett polytetrafluoretylenbelagt objektglas i ) behandlad med antingen en 254 nm UV-handlampa ( ii) eller en UV-tvärbindare (iii). (B ) Jämfört med obehandlad (vanlig) OS (RegOS) hade behandlad OS (OxOS) ökad autofluorescens, vilket visas av konfokal avbildning (vänster) (skalstapel = 10 μm) och flödescytometri (höger). Autofluorescerande intensitet hos OxOS behandlad med den handhållna UV-lampan liknade OS behandlad med UV-tvärbindarenheten vid en strålningsexponering på 3 J/cm2 (felstapel = S.E.M.). C) SDS-SIDA som visar tvärbindningen av OS-protein inducerat av UV-exponering. OxOS tvärbindning via den handhållna UV-lampan liknade OS behandlad med UV-tvärbindaren vid en strålningsexponering på 6 J / cm2. Monomera rhodopsin markeras med en pil. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Avbildning av OxOS-inducerade lipofuscinliknande granuler i hfRPE-kulturer. (A) Autofluorescerande granulat (grönt) inducerat av OxOS ackumulerade signifikant mer efter 20 matningar jämfört med 5 matningar. Kvarvarande OxOS-fläck med rodopsinantikropp (magenta). Skalstapel = 10 μm. (B) UAM inducerad av OxOS (grön) berikades inte med fritt kolesterol eller kolesterolester, enligt bedömning genom filipinfärgning (röd). Scele bar = 10 μm. (C) Avbildningsmetoder för samfärgning av fluorescens i närvaro av lipofuscin. (i) Användning av långröd fluorofor (Alexa 647) för att färga autofagimarkör LC3 (magenta), vilket minimerar UAM-genomblödning. Ren UAM (grön) avbildad med en standard grön kanalexcitation och emissionsfilteruppsättning. Skalstapel = 2 μm. (ii) Användning av ratiometrisk avbildning hjälper till att dechiffrera UAM-autofluorescens från LC3-färgning märkt med Alexa 488. Excitation är 488 nm, grön kanalemissionsbandpass är 500-535 nm medan röd kanalemissionsbandpass är 600-645 nm. Röd kanal kan appliceras som en subtraktiv mask för att isolera LC3-signal från den gröna kanalen. Skalstapel = 5 μm. iii) Eftersom fluorescenslivslängden för lipofuscin/UAM vanligtvis är kortare än specifika färgämnen, kan UAM-autofluorescens reduceras genom att stänga av fluorescenssignaler som anländer till en fotonräknande detektor på mindre än 2 ns. Toppbilden är utan grind. Nedre bilden är med grind, vilket endast håller fluorescenssignaler med en livslängd längre än 2 ns. Det finns en större relativ minskning av UAM-signalen jämfört med specifik LC3-signal (märkt med Alexa 488) mellan övre och nedre bilder. Skalstapel = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: "Total konsumtionskapacitet" -metod för mätning av OS-fagocytos. (A) Totalt återstående rodopsinprotein i både celllysat och supernatant efter introduktion av OS till RPE-kulturen, enligt western blot. Efter matning av vanlig OS i 50 μL media lyserades både det konditionerade mediet/supernatanten och cellerna tillsammans vid 0, 4 och 24 timmar. Tidpunkten 0 h fungerar som en kontroll som anger den totala mängden operativsystem som matas till varje Transwell. Det intakta rodopsinbandet (enkelpil) skilde sig inte mellan kontroll- och UAM-laddade RPE-celler, vilket tyder på ingen stor effekt av UAM på RPE-fagocytos. Klyvningsprodukterna av rhodopsin, indikerade av dubbelpilarna, var emellertid högre i UAM-gruppen, vilket tyder på en mild nedbrytande dysfunktion i fagolysosomalt system. Lika nivåer av GAPDH indikerar att cellantalet mellan brunnar, vilket kan påverka fagocytoshastigheten, var lika. (B) Olika rodopsinantikroppar känner igen olika nedbrytningsfragment. 4D2 känner igen N-terminalen av rhodopsin, som är intakt fram till de allra sista stegen av lysosomal nedbrytning. Fragmenten den känner igen är därför små (dubbla pilar). Däremot känner 1D4 igen C-terminalen av rhodopsin, som bryts ned tidigare i fagolysosomprocessen. Denna antikropp känner därför igen rodopsinfragment med högre molekylvikt (dubbla pilar). Båda antikropparna känner igen intakt rhodopsin (enkel pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur 1: Oredigerad fläck motsvarande figur 3A. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Medan RPE lipofuscin har studerats i årtionden, dess toxicitet diskuteras 2,9,16,42. Med tanke på tvetydighet om toxiciteten hos lipofuscin från djurmodeller11 är in vitro-modeller som använder human RPE värdefulla. En rad in vitro lipofuscinackumuleringsmodeller har beskrivits, men ingen har använt både OS-utfodring och mycket mogna och differentierade humana RPE-kulturer. Denna kombination representerar en idealisk modell, eftersom OS-utfodring rekapitulerar metoden för lipofuscinackumulering in vivo och högmogna humana RPE-kulturer bäst replikerar RPE-beteende in vivo. Intressant nog, när man använde mycket differentierade hfRPE-kulturer, upptäcktes att rutinmässig OS-exponering var otillräcklig för att inducera lipofuscinliknande material, även efter upprepade matningar16. Således accelererar detta protokoll lipofuscinackumuleringsprocessen genom fotooxiderande OS (OxOS) på ett kontrollerat sätt. Matning av OxOS till både humana iPSC-RPE- och hfRPE-kulturer resulterade i robust ackumulering av lipofuscinliknande granulat, vilket kallas osmältbart autofluorescerande material (UAM). UAM-ackumulering möjliggör modellering av lipofuscin i odlingssystem som efterliknar frisk human RPE in vivo 22,23,29,43,44. I både en tidigare publikation och i denna studie visar omfattande karakterisering av UAM jämfört med inbyggt lipofuscin från friska äldre vuxna både likheter och skillnader. UAM efterliknar ultrastrukturen av lipofuscin in vivo, inklusive tendensen för lipofuscingranuler att smälta samman med melaningranulat för att bilda melanolipofuscin16. Både UAM och lipofuscin innehåller betydande neutrala lipider, ingen rhodopsin och ingen signifikant anrikning av kolesterol (figur 2A, B från vår tidigare publikation16, figur 2A, B ovan och opublicerade data). Vi jämförde också inhemsk lipofuscingranulstorlek och spektrum med dem från UAM (figur 3 från vår tidigare publikation16). UAM-granuler är initialt något större och blåskiftade jämfört med infödda lipofuscin, men under betydande tidsperioder i kulturen komprimerar UAM till en mindre storlek och rödförskjutning i deras emissionsspektrum, vilket blir mycket mer lik storleken och spektraprofilen för infödd lipofuscin.

OxOS UAM-modellen har använts för en rad applikationer, inklusive effekterna av autofagiinducerare på att förebygga och avlägsna lipofuscingranulat50 och effekterna av lipofuscin på RPE-polaritet och metabolism16. Vidare har dessa granuler visat sig kvarstå i odlad RPE i mer än ett år, vilket gör att man kan studera utvecklingen av lipofuscinspektra, morfologi och beteende under långa tidsperioder16. Andra tillämpningar för modellen inkluderar studier av lipofuscinackumulering vid komplementaktivering51, lysosomal stabilitet och inflammatoriska svar 52 och mitokondriell kompromiss53.

Det finns några kritiska steg i detta protokoll. För det första måste RPE-kulturer vara mycket differentierade och mogna. OxOS-matningar bör endast påbörjas efter att RPE har varit på Transwells i minst 8 veckor och har erhållit alla egenskaper som är karakteristiska för högmogen RPE (de 5 'P: erna utarbetade av Finnemann et al. - polygonal i morfologi, postmitotisk, pigmenterad, polariserad och fagocytisk54). För det andra är OS mycket ömtåliga och bör hanteras med försiktighet under pipettering. Överdriven pipettering eller frys-tining kommer att bryta isär operativsystemet. Slutligen är förhållandet mellan OS och total UV-flödesexponering avgörande för att generera OxOS som förblir intakt men fortfarande kan inducera UAM; Detta förhållande har förfinats i detta protokoll. För mycket UV-ljus för ett visst antal operativsystem orsakar överdriven tvärbindning och förstör kritiska kemiska strukturer i operativsystemet. För lite UV-ljus för ett visst antal operativsystem kommer inte att inducera UAM i kulturen.

Ändringar av protokollet innebär till stor del att OxOS utfodringstid eller koncentration ändras. Empiriskt producerar 20 matningar under cirka 4 veckor en robust mängd UAM-ackumulering. Matningar utöver detta kan stegvis öka UAM-ackumuleringen, medan färre matningar sannolikt endast orsakar sporadisk UAM-ackumulering. Antalet matningar kan justeras utifrån experimentets och experimentets syfte, behov och resurser. I mindre differentierade RPE-kulturer (högre passagenummer, cellinjer eller kulturer som visar epitelial-mesenkymala övergångsegenskaper) behövs färre matningar och lägre OxOS-koncentrationer för robust UAM-induktion.

Protokollet har flera begränsningar. Användning av en handhållen UV-lampa för fotooxidation av OS förhindrar exakt kvantifiering av den totala strålningsexponeringen som levereras till OS. Fotooxidation av OS med hjälp av den handhållna lampan korrelerades emellertid i denna studie till en mycket dyrare (men kvantitativ) UV-tvärbindare i figur 1 för att ge parametrar för strålningsexponering. Det rekommenderas att försöksdeltagarna ändrar UV-exponeringens varaktighet tills mönstret för tvärbindning/rodopsinutstrykning efterliknar det som ses i UV-lampkolonnen i Western blot i figur 1C.

En andra begränsning av metoden är att den sannolikt saknar många av funktionerna i lipofuscinackumulering in vivo. Faktum är att i hela detta protokoll kallas lipofuscinliknande granuler som osmältbart autofluroescent material (UAM) för att göra denna skillnad tydlig. Fotooxiderande OS rekapitulerar en del av den naturliga kemiska tvärbindningen som händer i fotoreceptorns yttre segment i sjukdomstillstånd, men tvärbindningen accelereras kraftigt och sannolikt mer icke-specifik i UAM-modellen. Vidare, trots nästan en månad med OxOS-matningar, representerar UAM-modellen fortfarande en "akut" exponering för lipofuscininducerande OS, jämfört med de decennier det tar för lipofuscin att ackumuleras hos människor. Med en mer långvarig lipofuscinackumulering i kultur kan det finnas färre fenotypiska effekter. Men eftersom UAM-granulat kvarstår i mer än ett år i odlingssystemet som presenteras här, finns det möjlighet att studera deras långsiktiga effekter på RPE-hälsa16.

En begränsning med metoden "Total konsumtiv kapacitet" som presenteras här för att bedöma RPE-fagocytoskapacitet är att den inte skiljer om fagocytosdefekter kan bero på OS-bindning kontra upptag kontra nedbrytning. Faktum är att när målet med fagocytosanalysen är mekanistisk insikt i dysfunktion av specifika steg i fagocytosprocessen, är traditionella OS-pulsjaktanalyser mer lämpliga. Mätning av "Total konsumtionskapacitet" bör användas när målet helt enkelt är att entydigt mäta OS-fagocytoskompetensen hos RPE-kulturen under kontroll kontra experimentella förhållanden.

Sammanfattningsvis presenteras ett protokoll för lipofuscinliknande granulatackumulering i högdifferentierade humana RPE-kulturer. Denna metod sammanfogar den fysiologiska processen för lipofuscinackumulering - upprepade matningar av fotooxiderat OS - med RPE-odlingsmodeller som har visats i upprepade studier för att starkt rekapitulera human RPE in vivo. De resulterande kulturerna laddade med lipofuscinliknande granuler kan användas för otaliga applikationer, allt från bedömning av lipofuscineffekter på RPE-biologi till tester av små molekyler, gener och signalvägar som är viktiga för modulering av lipofuscinackumulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds delvis av bidrag från Vitreo-Retinal Surgery Foundation (VRSF), Fight for Sight (FFS) och International Retinal Research Foundation (IRRF). J.M.L.M. stöds för närvarande av ett K08-anslag från National Eye Institute (EY033420). Inga federala medel användes för HFT-forskning. Ytterligare stöd kommer från James Grosfeld Initiative for Dry AMD och följande privata givare: Barbara Dunn och Dee &; Dickson Brown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Tags

Biologi utgåva 194 Lipofuscin retinalt pigmentepitel (RPE) fotoreceptor yttre segmentspetsar eller fragment (OS) fagocytos Stargardts sjukdom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) osmältbart autofluorescensmaterial (UAM)
Förbättrade lipofuscinmodeller och kvantifiering av fagocytoskapacitet i yttre segmentet i högpolariserade humana retinala pigmentepitelkulturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. … More

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter